人造角膜后界膜

摘要

本发明涉及用于制备角膜内皮组织的方法和手段，并且提供一种结构化人造构造物，其实现了从人或动物体外的分离细胞新生成角膜内皮。

权利要求

1.一种用于将生物细胞机械转导分化为新形成的角膜内皮组织的人造后界膜构造物，其中所述构造物由具有蜂窝结构的圆顶形基体（10）形成，所述蜂窝结构形成在所述基体（10）的内凹侧（12）；其中所述蜂窝结构由具有中心凹部（22）和横向腹板（24）的重复的基本元件（20）形成，所述腹板高度为0.3至1μm，所述腹板宽度为1至8μm，由腹板包围的中央凹部的宽度均为10至20μm。

2.根据权利要求1所述的构造物，其中所述蜂窝结构由基本相等尺寸的重复的基本元件（20）形成。

3.根据权利要求2所述的构造物，其特征在于，所述蜂窝结构由不同尺寸的重复的基本元件（20）形成，在所述蜂窝结构中的基本元件（20）的尺寸为准随机分布。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的构造物，其中，所述基本元件（20）分别具有六边形的基本形状。

5.根据权利要求1 3中任一项所述的构造物，所述构造物包含生物聚合物。

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6.如权利要求5所述的构造物，所述的生物聚合物为生物相容性聚合物。

7.一种体外植入物，其包含前述权利要求中任一项所述的后界膜构造物和从分离的细胞新生成的角膜内皮组织。

8.一种制备根据权利要求1至6中任一项所述的人造后界膜构造物的方法，包括以下步骤：- 提供聚合物基体，

- 通过微结构化方法在基体表面形成空间蜂窝结构，所述微结构方法选自：光刻结构化，光解消融，微机械消融，铸造成型和压印成型。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述空间蜂窝结构的形成包括以下步骤：- 通过所述微结构化方法之一产生蜂窝结构的负模，然后- 借助制备的负模，通过铸造或压印，在生物聚合物中形成蜂窝结构。

10.如权利要求9所述的方法，所述的生物聚合物为生物相容性聚合物。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的人造后界膜构造物在间充质干细胞机械转导分化为角膜内皮组织中的用途。

12.一种从分离的生物细胞中制备新生成的体外角膜内皮植入物的方法，包括以下步骤：- 将分离的生物细胞与权利要求1至6中任一项所述的人造后界膜构造物接触，- 在后界膜构造物上培养细胞，其中实现角膜内皮的内皮细胞中的细胞分化，以及获得分化为新生成的角膜内皮的、具有后界膜构造物的组织，作为体外角膜内皮植入物。

13.根据权利要求12所述的方法，还包括以下步骤：- 将分化成新生成的角膜内膜的组织从后界膜构造物中分离，并获得分离的角膜内皮作为体外角膜内皮植入物。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述分离的生物细胞是间充质干细胞。

15.一种体外角膜内皮植入物，其通过根据权利要求12至14中任一项所述的方法制备。

说明书

人造角膜后界膜

技术领域

[0001] 本发明涉及用于生产哺乳动物眼角膜内皮组织的方法和手段，并且提供一种结构化的人造构造物，其能够从身体外的隔离细胞形成角膜内皮。

背景技术

[0002] 眼睛角膜的透明度对于视力至关重要。最重要的是，它需要完整的内皮组织(角膜内皮)。角膜背面的这种单层内皮与无细胞的基底膜直接接触，所谓的角膜后界膜，其从角膜的主层、基质分隔开。在健康角膜中，角膜后界膜基本上由VIII型胶原和层粘连蛋白组成。它具有规则的空间结构，其对应于内皮细胞的结构。内皮主动从角膜后界膜排出基质，避免水分堆积和水肿的形成，和由此导致的角膜的不透明。

[0003] 人的角膜内皮细胞在G1期停滞，并且在体内仅具有有限的增殖能力。这种无法分裂意味着，在角膜损伤的情况下，无论是由于炎症过程还是由于机械创伤，而且由于自然衰老过程，内皮的不可挽回的破坏可能会发生，在最坏的情况下，视力可能由于角膜不透明度而完全丧失。尽管死亡的内皮细胞被邻近细胞所取代，它们变得更大并且迁移到间隙中，以继续确保内皮的紧密度和功能。然而，这种修复机制非常有限。

[0004] 角膜内皮细胞损失目前仅限于通过医疗措施对抗。经常使用的方法是在所谓的穿孔角膜移植术中用供体角膜替代整个老化的角膜。然而，经常发生临床并发症，其导致眼睛的停止恢复或缺乏恢复，例如慢性干燥的眼睛，角膜血管变性，并且在最坏的情况下排斥外源供体材料。

[0005] 除了这种整体替换之外，现在已经建立了方法，其中在局部去除损伤的内皮与其角膜后界膜(Descemetorhexis)之后，紧接着通过角膜巩膜-角膜隧道，将由角膜内皮和附着的角膜后界膜组成的层状移植物和一部分临近的后基质从供体角膜引入到接受者的前室。通过这种特定移植，移植的常见风险和手术的副作用相对于整体移植减少了。然而，还有一些尚未解决的技术问题。

[0006] 这种角膜组织同种异体移植的问题是内皮细胞的丧失。供体眼的制备技术，储存方式和使用的营养培养基，输送以及对供体组织的围手术期处理总是导致移植物中内皮细胞的或多或少明显的损失。除了外来组织的免疫反应性排异之外，这些因素也可能导致原发性移植失败，使得移植的内皮组织不起作用并且不康复。

发明内容

[0007] 本发明的目的是克服角膜内皮组织的临床修复中的这些缺点。特别地，同种异体移植物的已知缺点，同时特别是外植体供体组织中内皮细胞的细胞死亡问题应当减少。

[0008] 本发明提供了用于生产新型的生物内皮植入物的方法和手段，其克服了已知移植物的上述缺点：在新型人造角膜后界膜上的，从分离的细胞组织培养中重新产生的角膜内皮组织。

[0009] 发明人惊奇地发现，通过一种特别的人造构造物，其特定地复制存在于健康角膜中的角膜后界膜，分离的全能或多能干细胞可以被激活，以高细胞密度重新形成功能性角膜内皮组织，其与本发明的人造后界膜构造物本身可以一起植入患者的眼睛，以完全替代失去的角膜内皮的功能。

[0010] 因此，本发明提供了一种人造的后界膜构造物，其特别适用于支持或实现机械力转导分化生物细胞，特别是多能或全能细胞，在体外形成角膜内皮组织。

[0011] 不希望受理论束缚，在将分离的细胞接种到根据本发明的后界膜构造物之后，发生这些细胞的机械力转导分化，从而形成功能性角膜内皮组织。因此，可以使用接受者本身的自体细胞，特别是多能性细胞或全能细胞。因此，可以提供由接受者自己的细胞组成的人造角膜植入物，并且其中通过体外组织培养中的合适的培养措施，可以选择细胞数量和细胞密度，使得可能的周围或术后细胞死亡可以补偿。在移植后，移植的内皮组织的功能被长期保留，并且可以实现完全的长期康复。

[0012] 根据本发明，后界膜构造物由大致球罩形的基体，在该基体表面的内凹侧(空腔)上形成有蜂窝结构体。基体表面的空间蜂窝结构可以通过合适的微结构化方法产生。

[0013] 在本发明的上下文中，“球盖”或“球盖形”不应仅仅理解为一个球形截面，而是包括与这种形式基本相对应的形式和形状，包括半壳或半穹顶形状，例如旋转椭圆体的截面或盖，旋转抛物面，以及其中间形式。根据本发明，人造后界膜构造物特别具有与角膜相对应的形状，通过或借着该构造物形成的植入物嵌入在角膜中。

[0014] 特别地，蜂窝结构可以假想为由重复的几何基本元件或蜂窝构成，蜂窝结构优选地无间隙相邻布置，每个假想的基本元件具有中心凹部和将它与相邻的基本元件分隔的横向腹板。优选地，腹板高度以及中心凹部的深度为0.3至1μm。腹板宽度优选为1至8μm。由这些腹板包围的中央凹部的宽度优选为10至20μm。

[0015] 优选地，基本元件各自具有六边形的基本形状，并因此形成经典的蜂窝结构。在替代实施例中，重复的基本元件的基本形式是圆形或基本圆形。在替代变型中，基本形状基本上是矩形或正方形。在替代变型中，基本形状是通常的多边形。优选地，多角形交替地具有不同数目的角，优选地具有五到九个角。这些蜂窝结构体特别优选由六边形和五边形构成。

[0016] 在一个特定的变型中，蜂窝结构是严格规则的，也就是说，其基本上是均匀的，优选基本相同的基本元件。在替代和优选的变型中，蜂窝结构是不规则的。也就是说，假想的基本元件各自具有不同的尺寸和/或不同的单个形状，其中基本元件的尺寸优选地(准)随机分布在蜂窝结构中。因此，一组6至约24个临近的基本元件的平均尺寸保持恒定。在这种情况下，不超过上述优选尺寸范围。

[0017] 优选地，腹板，即基本元件的侧壁，其各自优选地垂直于基体的结构化表面的基本平面布置。在另一种变型中，基本元件的侧壁会锥形地聚到其凹陷的底部。为此，特别地，侧壁的厚度朝向凹部的底部增加。因此，凹部封闭了多边形金字塔末端的形状，或者，在基本圆形的横截面的情况下，锥体末端的形状。

[0018] 在一个变型中，提供了从半壳突出的圆周边缘。这不需要结构化。它用于在细胞培养中后界膜构造物更方便的处理，一方面在微结构化过程中，另一方面在后界膜构造物的使用中。如果需要，可以在细胞培养阶段完成之后或在植入后界膜构造物之前将边界作为植入物的一部分分离。

[0019] 在优选的实施方案中，根据本发明的后界膜构造物包含生物或生物相容性聚合物，优选完全由其组成。生物或生物相容性聚合物优选是弹性和柔性的。在另一种变型中，它基本上是非弹性的却是柔性的。

[0020] 对于生物或生物相容性聚合物的选择，重要的是，当后界膜构造物作为体外植入物的一部分植入眼中时，它可以在术后替代天然后界膜的物理化学功能。特别地，这包括水(腔水)从基质向主动抽吸内皮组织的渗透性(被动扩散)。特别规定，通过选择材料组分的极性和/或通过多孔或透孔结构(分子筛)，实现这种扩散。

[0021] 此外，人造后界膜构造物在植入后可部分或完全再吸收。在这种情况下，优选地保留一种残留结构，其承担了天然基底膜的功能，而后界膜构造物中尤其用于植入物机械稳定的材料在植入后立即可再吸收。还提供了术后由人造后界膜构造物形成的基底膜。

[0022] 进一步规定，选择生物或生物相容性聚合物的机械性能，以使得达到天然后界膜的机械性能。特别地，需要后界膜构造物的机械刚度，以便一方面能够实现在体外组织培养物中从分离的细胞中重新形成角膜内皮组织的机械力转导的形成，另一方面，确保在术周围和术后在接受者眼睛中，在植入期间有足够的稳定性。在一个变型中，在体外培养和/或术后改变构造物的机械性能。为此，组合物选自表现出不同吸收或与内皮细胞相互作用的多种成分。

[0023] 构造物中的生物相容性聚合物可以是全部或部分来源于合成。它们可以以已知的方式进行官能化，特别是可以与粘附支持蛋白质或肽结合。

[0024] 聚合物优选包含胶原或胶原混合物或优选由上述组成。优选的胶原蛋白是I型和/或II型胶原。尤其优选的是VIII型和/或IV型胶原。或者，优选的是这些的混合物。另外还优选含有层粘连蛋白。此外，优选含有纤连蛋白。在生物学上，天然的后界膜主要由IV型和VIII型胶原，纤连蛋白和层粘连蛋白组成。优选地，这些细胞外基质组分优选根据标准方法，并且优选重组来制备。调整组分的混合比例，使人造构造物中的孔径和扩散电位达到天然后界膜。优选使用具有天然纳米结构的胶原或胶原混合物。这提高了根据本发明的后界膜构造物的微结构化的机械转导效应，并加速和稳定了分离的细胞分化成内皮组织。

[0025] 另外或替代地，该生物材料包含重组制备的蛋白质，它由动物或人体的婴儿或成人天然后界膜已知，或者由其组成。蛋白质可以是异源的或同种异体的。优选的是重组产生的人胶原或其胶原混合物。或者或另外，后界膜构造物含有丝蛋白或由其构成。在一个变型中，构造物包含非生物来源的生物相容性聚合物或仅由它们组成。

[0026] 在替代方案中，后界膜构造物的材料是合成聚合物和弹性体，如硅氧烷弹性体或PMMA，聚乙烯，聚酰胺，PVA，以及官能化聚合物，混聚物和共聚物。特别优选的是热敏或热反应性聚合物，特别是N-异丙基丙烯酰胺，以及其修饰物或衍生物，以及N,N-二乙基丙烯酰胺(PDEAAm)，N-乙烯基己内酰胺(PVCL)等。

[0027] 优选地，这样的合成聚合物的至少表面通过例如涂覆或化学或物理处理聚合物来官能化，以便以已知的方式实现与其上培养的生物细胞的相容性。聚合物可以通过血浆灭菌过程，与层粘连蛋白和/或纤连蛋白或其他细胞粘附蛋白，通过氢键结合连接。聚合物可以通过化学偶联(例如EDC/NHS反应)与粘附促进蛋白(参见上文)共价偶联。

[0028] 根据本发明，后界膜构造物通过微结构化的方法制备。这些优选地选自光刻结构方法，光解消融，微机械消融以及模制和成形。

[0029] 微结构化优选通过所谓的除蚀工艺进行，通过材料去除来加工出所需的蜂窝结构。优选的是基于激光的方法(光解消融)。在激光导向结构中，聚焦的激光束被引导到工件表面上，其中通过靠近边缘的表面的吸收，将入射激光的能量转换成热能。该转化的效率取决于材料对所用的激光波长的吸收程度，表面粗糙度，入射角和温度等。另外，辐射能量可能直接破坏化学键。或者或另外，材料的去除包括在材料中从固体到液体并随后到气态的相转化。在所有情况下，在聚焦激光束材料的区域，材料以颗粒和/或材料熔体的形式被去除。在脉冲激光器的情况下，这主要以旋转抛物线(“阱”)的形式产生每个激光脉冲的单个几何形状。

[0030] 相关结构的产生通过激光束在工件表面上的适当运动来实现。这优选地通过所谓的激光扫描器来实现，该激光扫描器包括通过快速电机操作的一个或多个可动反射镜。与可实现的结构尺寸，结构清晰度和精度有关的去除质量可以通过选择适当的激光源来选择。重要的是激光的波长，输出功率(脉冲激光器的情况下为单脉冲能量)和光源的波束质量。

[0031] 优选的替代的微结构方法是机械除屑工艺，特别是具有微晶线工具的微金刚石铣刀。亚微米范围内的结构尺寸只能由特殊机器技术和高分辨工具组合加工。该范围内的结构尺寸运用了所谓的超精密技术。为此，优选单晶金刚石工具，由于它们的硬度和清晰度，并且通过它们的精确切割使得能够产生所需的结构。旋转加工过程中的超精密部件的加工优选限制于旋转对称表面的加工。扩展到所谓的非圆形加工，也可以产生不与旋转轴线对称的表面和结构。

[0032] 或者，用于微结构化后界膜构造物体的优选方法是所谓的生成方法，其中根据本发明的蜂窝结构体是通过涂覆材料，在基体上的局部材料积聚或材料固化而形成的。优选的方法是双光子光刻，干涉光刻和灰度光刻。

[0033] 双光子光刻(2PL)基于双光子吸收(2PA)的物理效应，并允许以150nm的横向分辨率和400nm的轴向分辨率制造三维结构。波长为780nm的飞秒光纤激光器的扩展光束被耦合到倒置的显微镜透镜中，因此被聚焦到液体光敏聚合物。由于激光被聚焦和脉冲，所以聚焦强度足够高，以允许焦点内的双光子吸收。在相应的区域中，代替红外辐射，发射波长为390nm的紫外线。作为构造物的基体的组成部分的液体光聚合物仅在高能UV光线曝光期间才交联，使得液体聚合物固化在发生双光子吸收的区域中的基体上，因此蜂窝结构可以形成。

[0034] 在干涉光刻的情况下，使用双光束或多光束干涉来将相应的干涉图案成像并存储在光敏表面。为此，将激光束(氩离子激光器)放大(例如通过分光镜立方体)分成两个部分光束。它们以一定角度与镜(平面或凹面镜)叠加，使得依赖于该角度以及所使用的波长，产生具有特定晶格常数的条纹图案。通过重复施加，特别是在基体旋转之后，可以形成蜂窝结构体。

[0035] 灰度光刻是基于掩模的曝光，它的图案通过曝光存储在光敏聚合物中。不同深度的结构通过掩模上的不同灰度实现。在掩模后面，对应于掩模上的灰度分布形成强度分布。使用正性抗蚀剂，结构在强度最高处最深。对于负性抗蚀剂，这种关系是相反的。

[0036] 特别优选用于制备生物或生物相容性和可植入的后界膜构造物是压印或浇铸方法及其组合，其中首先通过上述除蚀或生成方法在优选聚合物材料中产生所需后界膜构造物的阴性形式(模板)，随后，后界膜构造物本身从生物或生物相容的聚合物中，通过在先前生产的模板上，通过铸造和/或压印作为正模制备。通过这种优选的两步法，微结构也可以实现在生物或生物相容的聚合物上，因为它们不适用于直接物理微结构化过程。成型特别适用于经受固化或聚合过程的所有生物材料，即通过固化从液体可倾倒的聚集体状态获得凝胶状或固体状态。在成型过程中，它固化在阴模(铸造)上，或者将阴模压入材料(压印)中。除了生物来源的纯生物材料之外，还提供了本文所述的合成聚合物用于成型。

[0037] 本发明还提供了一种生产人造后界膜构造物的方法，至少包括以下步骤：(1)提供聚合物基体，和(2)通过微结构方法在基体表面形成三维蜂窝结构体。该方法优选选自：光刻结构化，光解消融，微机械消融，铸造成型和压印成型。

[0038] 优选地，形成空间蜂窝结构的步骤包括以下步骤：(2.1)通过微结构方法形成蜂窝结构的负形状(模)，然后(2.2)通过所产生的负形状在生物相容性或生物聚合物中，通过铸造或压印，形成最终的蜂窝结构。

[0039] 根据本发明，本文所述的人造后界膜构造物用于人或动物的体外的“组织工程”方法，以从单个细胞再生内皮组织。因此，本发明还涉及人造后界膜构造物的用途，用于特别是间充质前体或干细胞在体外机械转导分化为角膜内皮组织。

[0040] 在后界膜构造物上，根据本发明重新形成角膜内皮组织的细胞优选为真核细胞前体细胞，特别是成体干细胞，胚胎干细胞和诱导多能干细胞。优选间充质细胞，特别优选间充质干细胞。这些优选从接受者的组织分离。为此目的，优选从患者的自体脂肪组织以最小的侵入取出成体干细胞。

[0041] 对于体外分化，将细胞接种在根据本发明的后界膜构造物的结构化表面上并在那里培养。细胞接种密度优选至少为5×105/cm2。为了支持体外细胞的分化，最终还可以应用已知的化学因子，其支持细胞在根据本发明的微结构化后界膜构造物上的机械转导。然而特别的是，细胞的分化仅通过机械转导的方式在根据本发明的人造后界膜构造物的微结构上发生。因此获得的新生成的角膜内皮组织基本上不受化学或其他物理分化因子的影响，一方面使分化稳定，另一方面降低这些细胞的死亡率或术后的去分化。

[0042] 本发明还涉及从分离的生物细胞生产新生成的角膜内皮植入物的方法，包括以下步骤：(1)使分离的生物细胞与人造后界膜构造物接触，(2)在后界膜构造物上培养所述细胞，其中细胞的分化发生在角膜内皮的内皮细胞中，和(3)使用根据本发明的后界膜构造物，获得分裂为新生成的角膜内皮的组织，作为人造后界膜体外角膜内皮植入物。

[0043] 因此，在该变型中，将人造后界膜构造物与分化为内皮的细胞一起用作修复患者角膜内膜缺陷的植入物。在该变型中，上述生物材料优选作为后界膜构造物的材料。

[0044] 本发明的另一个实施方案是将人造后界膜构造与其上形成的角膜内皮组织一起提供为体外组织植入物。后者可植入接受者眼睛，脊椎动物眼睛，特别是哺乳动物眼睛，特别是人眼，以代替被破坏的角膜内皮组织的功能。因此，本发明还提供了包括由分离的细胞组成的角膜内皮组织和人工后界膜构造物的体外植入物。粘附于根据本发明的后界膜构造物的分化的新生成的角膜内皮组织可用作成型的体外植入物，通过已知的手术技术，特别是DMEK(后界膜内皮角膜移植术)或DMAEK(后界膜自动内皮角膜移植术)转移到受体眼中。

[0045] 本发明还提供了用于从分离的生物细胞产生新生成的角膜内皮植入物的方法，其包括以下步骤：(1)使分离的生物细胞与人造后界膜构造物接触，(2)在后界膜构造物上培养所述细胞，其中细胞的分化发生在角膜内皮的内皮细胞中，(3)在根据本发明的后界膜构造物上获得分化为角膜内皮的组织，(4)从后界膜构造物中分离角膜内皮组织并获得分离的角膜内皮组织作为体外角膜内皮植入物。

[0046] 因此，在该替代变型中提供了在接种的细胞分化为内皮组织后，可以再次分离，并且利用分离的内皮组织作为植入物，来修复病人角膜上的内皮缺陷。

[0047] 内皮组织从人造后界膜构造物的分离可以根据从体外组织培养中已知的方法进行。这样包括溶剂酶的应用，阻止剂等。可以提供，细胞用温和的酶如细胞消化液处理。除了需要防止促进内皮细胞与基体粘附的粘附蛋白质的破坏之外，还需要防止内皮细胞之间的“紧密连接”的破坏，这也将损害组织的功能完整性。

[0048] 或者或另外，优选地，后界膜构造物的表面，至少与内皮细胞接触的一侧，被特异性地涂覆或官能化，以减少粘附因子的形成并促进分离。

[0049] 在特别优选的变型中，可替换地或另外地，后界膜构造物的合成聚合物是本文所述的热敏或热分解聚合物，优选N-异丙基丙烯酰胺。在这种材料中，可以通过温度来控制内皮细胞与基体的粘附或分离，即后界膜构造物。优选为了分离内皮细胞，在培养/分化阶段完成后，将含有内皮细胞的后界膜构造物放置到约20℃以下的低温。结果，热敏底物经历状态变化，这导致整个内皮组织的分离或者继续支持它。

[0050] 因此，本发明进一步提供了如在体外形成的角膜内皮组织作为体外组织植入物。这可以植入到接受者，脊椎动物眼睛，特别是哺乳动物眼睛尤其是人类的眼睛中，以代替破坏的角膜内皮组织的功能。因此，本发明还提供了包括由分离的细胞组成的角膜内皮组织。
分离的新生成的角膜内皮组织可通过已知的手术技术，特别是DMEK(后界膜内皮角膜移植术)或DMAEK(后界膜自动内皮角膜移植术)转移到受体眼中。

具体实施方式

[0051] 参考以下附图和具体实施例的实施例更详细地描述本发明。

[0052] 附图作为示例示意性地示出了后界膜构造物的结构。在图中参照图1和图2，没有标注尺寸。另外，相对于构造物的整体尺寸，蜂窝状结构被放大数倍示出。图1示出了根据本发明的圆顶形后界膜构造物的内凹侧12的平面图。图2示出了根据图1的后界膜构造物的横截面图。为了说明结构的空间性，图1中的蜂窝结构体朝向边缘透视地倾斜。后界膜构造物具有圆顶或半壳形式的基体10，圆顶的对应球半径适应接收者眼睛中角膜的半径。微结构化的蜂窝结构由假想的重复基体元件20组成，它们各自具有中心凹部22和形成为阳性腹板24的横向边界。在后界膜构造物的所示实施例中，其在边缘上具有周向突出的边缘14。在圆顶状构造体10的内凹处12的表面上，设置有由重复的基本元件20构成的蜂窝结构，每一个均具有凹部22和横向腹板24。在图示的实施例中，在圆顶状基体10的上边缘上形成周向大致平滑的边缘14。

[0053] 实施例1：人造后界膜构造物的制备

[0054] 1.基板的光刻制备

[0055] 1.1 双光子光刻

[0056] 双光子光刻(2PL)基于双光子吸收(2PA)的物理效应，并允许以150nm的横向分辨率和400nm的轴向分辨率制造三维结构。波长为780nm的飞秒光纤激光器的扩展光束被耦合到倒置的显微镜透镜中，因此被聚焦到液体光敏聚合物。由于激光被聚焦和脉冲，所以聚焦强度足够高，以允许焦点内的双光子吸收。在相应的区域中，代替红外辐射，发射波长为390nm的紫外线。作为构造物的基体的组成部分的液体光聚合物仅在高能UV光线曝光期间才交联，使得在发生双光子吸收的区域中的基体上，液体聚合物固化。

[0057] 通过感光聚合物相对于焦点的移动，可以生产任何结构的聚合物，如IP-Dip，IP-L，IP-G，OrmoComp，AR-P3120，SU8。最终的显影步骤从溶剂中溶解未被曝光的材料以获得结构。

[0058] 双光子光刻有四种变化，每种都可用于生产相关结构：

[0059] a)在常规方法中，激光束通过玻璃板聚焦到光敏聚合物中。此外，在显微镜的物镜和玻璃板之间有浸渍油，以将尽可能多的激光引入聚合物，并以此使分辨率最大化。在该方法的这种变型中，物镜的工作距离限制了的最大结构高度。该结构从基板的上侧向上构建。

[0060] b)浸入式激光光刻(DiLL)还允许使用不透明的基底，例如金属或硅。这里，激光束聚焦在基板的下侧，感光性聚合物位于显微镜物镜和基板之间，同时用作浸渍介质。该结构从基体的底部向下构建。由压电控制产生的最大结构高度为300μm。通过使用显微镜物的z-驱动，可以实现更高的结构。

[0061] c)第三种变化包括使用空气物镜。这个原理与常规方法相符，但不使用浸渍油。

[0062] d)使用基于电泳扫描仪的附件，通过同时写入几个焦点可以将写入速度提高到200倍。

[0063] 要使用2PL制造的结构必须首先编程。为此，可以使用使用GWL编程语言的软件(对于其他系统也可以是 )，或者将对应结构编程为.stl文件，然后传输到 程序。由于感光性聚合物不适合作为细胞分化的材料，所以制备了后界膜的倒置结构并形成合适的材料。使用硅橡胶，或人或动物的胶原。相应地，制造出直径和高度不同并且随机排列的六边形结块。

[0064] 结构的生产程序如下：

[0065] ·将胶水 固定在样品架上

[0066] ·分别在基板的上侧(用于常规工艺和空气物镜)或下侧(用于DiLL工艺)滴落各自的光聚合物

[0067] ·对于常规方法，另外将浸渍油施加到基材的下侧

[0068] ·将样品固定在2PL装置中

[0069] ·通过结构的编程开始写入过程，根据编程的结构，样品相对于激光的焦点移动[0070] 1.2 干涉光刻

[0071] 在干涉光刻的情况下，使用双光束或多光束干涉来将相应的干涉图案成像并存储在光敏表面。为此，将激光束(氩离子激光器)放大(例如通过分光镜立方体)分成两个部分光束。它们以一定角度与镜(平面或凹面镜)叠加，使得依赖于该角度以及所使用的波长，产生具有特定晶格常数的条纹图案。

[0072] 位于干涉图案中的感光样品由基体(金属，硅，玻璃)组成，通过旋涂(层厚度，自旋程序)将光敏聚合物的光滑层沉积在基体上。在这里，可以使用正漆或负漆，其中负漆在它们被曝光的地方交联。在正漆的情况下，聚合物的未曝光部分形成结构。

[0073] 为了将条形干涉图案存储在聚合物层中，将样品(具有抗蚀剂层的基板)用干涉图案来曝光。后续的显影步骤(在正性抗蚀剂的情况下)从层中溶解被曝光的聚合物。为了使用这种方法生产六边形结块，相同的样品必须用干涉图案曝光三次，每次曝光后样品旋转60°。在显影步骤之后产生由聚合物组成的六角形结块，这也可以用于另一种材料中的后界膜构造物的成型。步骤如下：用光聚合物涂布基体；根据不同的聚合物，将样品烘烤在“热板”上；将样本定位在光学装置中的干涉图案的位置，将样品用干涉图案曝光三次，每次曝光后，以相同的方向旋转样品60°，并在相应的显影剂浴中显影样品。

[0074] 1.3灰度光刻

[0075] 灰度光刻是基于掩模的曝光，它的图案通过曝光存储在光敏聚合物中。不同深度的结构通过掩模上的不同灰度实现。在掩模后面，对应于掩模上的灰度分布形成强度分布。使用正性抗蚀剂，结构在强度最高处最深。对于负性抗蚀剂材料，这种关系是相反的。

[0076] 为了通过灰度光刻产生反转的后界膜构造物，必须设计一个掩模，以灰色调将结构成像。当使用正性抗蚀剂材料时，六角形的轮廓是明亮的，并向中心变暗。如果使用负的抗蚀剂材料，掩模上的六边形在中间是亮的，并且朝向外部变暗。为了确保掩模的平面照明，将掩模在加宽和聚焦的激光束中垂直于光轴定位。通过聚焦，掩模在样本上按比例缩小成像，使得结构的尺寸忠于原始尺寸。这里，步骤如下：用光聚合物涂布基材；根据不同的聚合物，将样品烘烤在“热板”上，将样本定位在光学装置中的干涉图案的位置，将样品用加宽和聚焦的激光束曝光，该激光束在灰度掩模膨胀后立即穿过掩模，以及在相应的显影剂浴中显影样品。

[0077] 2.形成最终的生物后界膜构造物

[0078] 由于材料特性对于细胞分化是非常重要的，所以将光刻产生的结构在较软的材料中成型，这里使用硅橡胶或动物或人的胶原蛋白，以此在该材料中形成再生的后界膜结构。为了从生物相容性材料生产可植入的后界膜构造物，使用可浇注的胶原蛋白组合物，首先生产聚合物的结构化的模板。

[0079] 实施例2：体外角膜内皮组织的制备

[0080] 先前从脂肪组织中取出和分离的间充质干细胞以至少5×105个细胞/cm2的细胞密度接种在根据实施例1预处理的人造后界膜构造物上。为了均匀分布和粘附，将构造物在回转摇动。

[0081] 完全粘附后，将膜夹入生物反应器(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中，并培养直到干细胞完全分化，并实现角膜内皮细胞的功能(可通过内皮细胞特异性标记物或功能测试)。培养期取决于特定干细胞的分化率。使用含有10％血清和1％抗生素的基础培养基用于培养。

[0082] 在完成培养后，在后界膜构造物上获得完全分化的新生成的角膜内皮组织。该组织粘附于后界膜构造物，并与后界膜构造物一起形成用于修复接受者眼中角膜内皮缺损的体外植入物。