柚皮素的用途、柚皮素纳米脂质体及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了柚皮素的用途、柚皮素纳米脂质体及其制备方法与应用。本发明柚皮素应用于制备治疗非酒精性脂肪肝药物中。本发明柚皮素纳米脂质体，包括柚皮素和纳米脂质体；纳米脂质体包括磷脂和胆固醇；柚皮素、磷脂和胆固醇的质量比为1：4～9：1～2。其制备方法，包括如下步骤：1)将柚皮素、磷脂和胆固醇溶于溶剂中，混合，然后除去溶剂，得到混合物；2)将步骤1)得到的混合物用水性介质水化，得到柚皮素纳米脂质体粗悬液；3)将步骤2)得到的柚皮素纳米脂质体粗悬液依次进行水浴超声和探头超声，即得到柚皮素纳米脂质体。本发明柚皮素纳米脂质体能提高柚皮素的口服的生物利用度，并提高柚皮素对非酒精性脂肪肝的防治效果。

权利要求

1.柚皮素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用；

所述非酒精性脂肪肝为MCD饮食诱导的非酒精脂肪肝。

2.一种柚皮素纳米脂质体，其特征在于：它包括柚皮素和纳米脂质体；

所述纳米脂质体包括磷脂和胆固醇；

所述磷脂为蛋磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、牛胆酸钠、β-谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种；

所述柚皮素、所述磷脂和所述胆固醇的质量比为1：4～9：1～2。

3.权利要求2所述的柚皮素纳米脂质体的制备方法，包括如下步骤：1)将所述柚皮素、所述磷脂和所述胆固醇溶于溶剂中，混合，然后除去所述溶剂，得到混合物；

2)将步骤1)得到的所述混合物用水性介质水化，得到柚皮素纳米脂质体粗悬液；

3)将步骤2)得到的所述柚皮素纳米脂质体粗悬液依次进行水浴超声和探头超声，即得到柚皮素纳米脂质体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述溶剂为氯仿、甲醇、无水乙醇、乙醚和石油醚中的至少一种；

所述柚皮素的质量与所述溶剂的体积比为1g：100～400mL。

5.根据权利要求3或4中所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中除去所述溶剂采用减压蒸馏的方法，所述减压蒸馏的温度为35～50℃。

6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述水性介质是纯水或缓冲溶液，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、生理盐水；

所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.002～0.02mol/L；

所述柚皮素的质量与所述水性介质的体积比为1g：200～600mL。

7.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述水化的温度为30～60℃；

所述水化的时间为20～60min。

8.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述水浴超声的温度为20～50℃；

所述水浴超声的时间为2～40min；

所述水浴超声功率为50～100W。

9.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述探头超声在冰水浴中进行；

所述探头超声的时间为10～20min，

所述探头超声的振幅为满输出功率振幅的50～100％。

10.权利要求2所述的柚皮素纳米脂质体在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

说明书

柚皮素的用途、柚皮素纳米脂质体及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及柚皮素的用途、柚皮素纳米脂质体及其制备方法与应用，属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种遗传-环境-代谢应激相关性疾病，是以肝细胞脂肪变性和脂肪过度蓄积为主要病理特征，但无过量饮酒史的临床综合征。近几年，随着我国生活水平的提高和生活方式与饮食结构的改变，这一过去在西方国家较为常见的肝脏疾病在中国的患病率呈逐年上升趋势，因此日益受到人们的关注。NAFLD的发病机制主要包括以胰岛素抵抗为主的“一次打击”和以氧化应激、肝细胞大量死亡和纤维化为主的“二次打击”。目前，临床上还没有治疗NAFLD的明确方案和药物，一般的治疗主要是以改变生活方式、调节饮食，合理运动等为主，而针对病因和发病机制的药物治疗主要有降脂药(他汀类)、降糖药(噻唑烷二酮类、二甲双胍等)、抗氧化剂(普罗布考、乙酰半胱氨酸、维生素E)等)，此外还有一些保肝药如水飞蓟宾等也用于非酒精性脂肪肝的治疗。然而现有的这些治疗药物都不是针对非酒精性脂肪肝发病机制的特效制剂，且缺乏大样本多中心临床研究。因此，临床上急需寻找有效的药物来有效预防和治疗NAFLD。

[0003] 柚皮素(Naringenin,NRG)是一种广泛存在于芸香科等植物中的天然黄酮类化合物。但由于柚皮素属于难溶性药物，口服给药后在胃肠道中的溶出较低，导致药物损失与浪费，且易发生不良反应事件，影响柚皮素的临床疗效及应用。目前已有药学研究者致力于通过制剂技术提高柚皮素溶解度的研究。已经报道的剂型包括固体分散剂、多室脂质体、β-环糊精复合物、磷脂复合物、纳米自乳化给药体系、可降解纳米粒等。上述剂型都在一定程度上提高了NRG的溶解度和口服生物利用度，但依然存在很多问题有待解决。如：制备过程中的有机溶剂残留；液体制剂的储存稳定性；表面活性剂的口服安全性，粒径过大等。

[0004] 纳米脂质体(nanoliposome)是目前最常用的一种纳米制剂，它是由排列有序的脂质双分子层组成的多层微囊，具有类似生物膜双分子层的近晶型液晶结构。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径通常为几十纳米到几十微米不等。脂质体的主要成分为磷脂和胆固醇，具有较好的生物相容性和较低的体内外毒性。基于脂质体的优良特性，我们构建了柚皮素的纳米脂质体剂型(NRG-nanoliposome)，以期改善柚皮素的溶解和吸收特性，减少药物使用剂量，在达到相同的治疗效果时降低药物的毒副作用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供柚皮素的用途、柚皮素纳米脂质体及其制备方法与应用。本发明柚皮素能用于制备治疗非酒精性脂肪肝药物，柚皮素纳米脂质体能提高柚皮素的口服的生物利用度，并提高柚皮素对非酒精性脂肪肝的防治效果。

[0006] 本发明提供的柚皮素应用于制备治疗非酒精性脂肪肝药物中。

[0007] 本发明还提供了一种柚皮素纳米脂质体，它包括柚皮素和纳米脂质体；

[0008] 所述纳米脂质体包括磷脂和胆固醇；

[0009] 所述磷脂为蛋磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、牛胆酸钠、β-谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种；

[0010] 所述柚皮素、所述磷脂和所述胆固醇的质量比为1：4～9：1～2。

[0011] 本发明还提供了上述的柚皮素纳米脂质体的制备方法，包括如下步骤：1)将所述柚皮素、所述磷脂和所述胆固醇溶于溶剂中，混合，然后除去所述溶剂，得到混合物；

[0012] 2)将步骤1)得到的所述混合物用水性介质进行水化，得到柚皮素纳米脂质体粗悬液；

[0013] 3)将步骤2)得到的所述柚皮素纳米脂质体粗悬液依次进行水浴超声和探头超声，即得到柚皮素纳米脂质体。

[0014] 上述的制备方法中，所述溶剂为氯仿、甲醇、无水乙醇、乙醚和石油醚中的至少一种；

[0015] 所述柚皮素的质量与所述溶剂的体积比为1g：100～400mL，具体可为1g：238～313mL或1g：150～350mL。

[0016] 本发明中，所述溶剂可为氯仿和甲醇的混合溶剂，所述氯仿和所述甲醇的体积比为1:0.5～2，具体可为2:1或1:2。

[0017] 上述的制备方法中，步骤1)中除去所述溶剂采用减压蒸馏的方法，所述减压蒸馏的温度为35～50℃，具体可为37℃、40℃或37～40℃。

[0018] 上述的制备方法中，所述水性介质是纯水或缓冲溶液，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、生理盐水；

[0019] 所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.002～0.02mol/L，具体可为0.01mol/L；

[0020] 所述柚皮素的质量与所述水性介质的体积比为1g：200～600mL，具体可为1g：313～476mL。

[0021] 上述的制备方法中，所述水化的温度可为30～60℃，具体可为40℃或30～50℃；

[0022] 所述水化的时间可为20～60min，具体可为30min、25～30min或25～50min。

[0023] 上述的制备方法中，所述水浴超声的温度可为20～50℃，具体可为40℃、20～40℃、40～50℃或35～45℃；

[0024] 所述水浴超声的时间可为20～40min，具体可为25min、30min或25～30min。

[0025] 所述水浴超声功率可为50～100W，具体可为50W、80W或50～80W。

[0026] 上述的制备方法中，所述探头超声在冰水浴中进行；

[0027] 所述探头超声的时间可为10～20min，具体可为15min、20min或15～20min；

[0028] 所述探头超声的振幅可为满输出功率振幅的50～100％；具体可为50％、80％或50～80％。

[0029] 本发明所述柚皮素纳米脂质体在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

[0030] 本发明具有以下优点：

[0031] 本发明所涉及柚皮素纳米脂质体制备方法简便、易于控制和操作、清洁安全、无有毒有机溶剂残留，且可连续化批量生产；

[0032] 本发明制得的柚皮素纳米脂质体平均粒度均一，包封率高，稳定性好；

[0033] 本发明柚皮素纳米脂质体改善了柚皮素的溶解和吸收特性，能减少药物使用剂量，提高药物生物口服利用率，并提高柚皮素对非酒精性脂肪肝的防治效果，在达到相同的治疗效果时降低药物的毒副作用。

附图说明

[0034] 图1为本发明柚皮素纳米脂质体的粒径分布图。

[0035] 图2为本发明柚皮素纳米脂质体的体外释放曲线。

[0036] 图3为柚皮素、柚皮素纳米脂质体在C57BL/6体内的血浆总柚皮素浓度-时间曲线图。

[0037] 图4为小鼠血清ALT和AST水平，图4A为ALT水平，图4B为AST水平。其中，图4中平行试验次数n＝5，*表示P<0.05，***表示P<0.001。

[0038] 图5为小鼠肝脏形态学切片油红O染色结果图；图5A为对照组；图5B为MCD模型组；图5C为NRG组；图5D为NRG-Nanolipo组。

[0039] 图6为小鼠肝脏脂质抽提结果，图6中平行试验次数n＝5，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

具体实施方式

[0040] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0042] 实施例1、柚皮素纳米脂质体的制备

[0043] 准确称取0.0126g柚皮素、0.1127g大豆磷脂、0.0124g胆固醇，加入2mL氯仿和1mL甲醇，充分溶解，37℃水浴条件下减压旋转蒸发除去溶剂，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入3mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)在40℃水化30min，于80W，40℃水浴超声30min得到柚皮素纳米脂质体粗悬液。于冰浴下超声15min(满振幅的80％)得浅蓝色乳光的本发明柚皮素纳米脂质体。

[0044] 实施例2、柚皮素纳米脂质体的制备

[0045] 准确称取0.0056g柚皮素、0.0617g大豆磷脂、0.0143g胆固醇，加入1mL氯仿和2mL甲醇，充分溶解，37℃水浴条件下减压旋转蒸发除去溶剂，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入3mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)在40℃水化30min，于50W，40℃水浴超声30min得到柚皮素纳米脂质体粗悬液。于冰浴下超声15min(满振幅的50％)得浅蓝色乳光的本发明柚皮素纳米脂质体。

[0046] 实施例3、柚皮素纳米脂质体的制备

[0047] 准确称取0.0096g柚皮素、0.0629g大豆磷脂、0.0146g胆固醇，加入2mL氯仿和1mL甲醇，充分溶解，40℃水浴条件下减压旋转蒸发除去溶剂，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入3mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)在40℃水化25min，于80W，30℃水浴超声25min得到柚皮素纳米脂质体粗悬液。于冰浴下超声20min(满振幅的50％)得浅蓝色乳光的本发明柚皮素纳米脂质体。

[0048] 实施例4、柚皮素纳米脂质体的制备

[0049] 准确称取0.0249g柚皮素、0.2251g大豆磷脂、0.0250g胆固醇，加入2mL氯仿和1mL甲醇，充分溶解，37℃水浴条件下减压旋转蒸发除去溶剂，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入6mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)在40℃水化30min，于80W，40℃水浴超声30min得到柚皮素纳米脂质体粗悬液。于冰浴下超声15min(满振幅的80％)得浅蓝色乳光的本发明柚皮素纳米脂质体。

[0050] 实施例5、柚皮素纳米脂质体的应用试验

[0051] 1、柚皮素纳米脂质体的质量评价

[0052] 粒径测定：取本发明实施例1适量柚皮素纳米脂质体，采用Malvern Zeta电位仪测定其粒径，测得粒径为(98±5)nm，其粒径分布图如图1所示。

[0053] 包封率EE(％)测定：

[0054] (1)HPLC法建立柚皮素标准曲线：

[0055] 色谱条件：测定仪器：LC-15型高效液相色谱仪(日本岛津公司)(配有紫外检测器)；色谱柱：C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇/0.2％磷酸水＝71:29(V/V)；体积流量为0.7mL/min；进样量为20μL，检测波长289nm。

[0056] 建立标准曲线得到回归方程如下：

[0057] A＝120766C+8544.7，R为0.9998，

[0058] 上式中，A为峰面积，C为柚皮素浓度(μg/mL)。

[0059] (2)包封率和载药量的测定

[0060] 取所制得的柚皮素纳米脂质体溶液100μL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，超声(频率：40kHz，功率：100W)破乳10min。稀释一定倍数后于上述色谱条件下进样20μL，根据峰面积及标准曲线，计算脂质体总含药量。所制得的脂质体溶液200μL超速离心(30000r/min，2h，4℃)后，精密吸取上清液100μL，用流动相定容至一定浓度后，进样20μL，根据峰面积及标准曲线，计算脂质体处方中的游离药量。可以根据公式：包封率＝(总药量-游离药物含量)/总药量×100％计算柚皮素脂质体包封率。根据公式：载药量＝[脂质体中药物量/(脂质体中药物+载体总量)]×100％计算柚皮素脂质体的载药量。测得本发明实施例1中柚皮素纳米脂质体的包封率为97.85％，载药量为8.16％。

[0061] 按照与上相同的方法，测得本发明实施例2、3、4中柚皮素纳米脂质体的包封率分别为76.43％，86.93％，97.40；载药量分别为3.99％，5.12％，8.95％。

[0062] 2、柚皮素纳米脂质体体外释放考察

[0063] 将本发明实施例1柚皮素纳米脂质体溶液0.5mL置于透析袋中，透析袋两端扎牢，-1置于37℃恒温的250mL释放介质中磁力搅拌(200r·min )。分别于0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、
12.0、24.0、48.0h取透析袋外释放介质1mL，同时补充等量相同温度下的新鲜释放介质。
HPLC法检测各个时间点的释放介质中NRG的含量。以累积释放百分数为纵坐标，时间为横坐标绘制柚皮素纳米脂质体的体外释放曲线图，如图2所示。

[0064] 由图2可知，本发明柚皮素纳米脂质体的体外释药结果表明NRG-nanoliposome在最初8h内释药率达到62.84±5.38％，随后缓慢释放，24h累计释放达到73.63±7.34％。

[0065] 3、柚皮素纳米脂质体药代动力学研究

[0066] 25±2g雄性C57BL/6小鼠20只，分两组，每组10只。给药前禁食12h，自由饮水。两组小鼠分别一次性腹腔注射相当于25mg·kg-1剂量的柚皮素或柚皮素纳米脂质体。两组小鼠于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24h分别眼眶取血约0.1mL，置于肝素离心管中，4000r/min离心10min，分离上清液，测定血药浓度。药时曲线如图3所示，计算药动学参数，药动学参数结果如表1所示。

[0067] 表1 小鼠单次腹腔注射柚皮素(25mg/kg)的药代动力学参数(Mean±SD，n＝5)[0068]

[0069] 由表1可知，本发明柚皮素纳米脂质体显著增加了柚皮素在体内的AUC及Cmax，表明本发明柚皮素纳米脂质体改善柚皮素体内生物利用度。

[0070] 4、柚皮素(NRG)对蛋氨酸、胆碱缺乏(methionine choline deficient diet,MCD)饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型实验

[0071] (1)8周龄的雄性C57BL/6小鼠，体重平均23g，随机分成四组，对照组(control)给予普通繁殖饲喂饲7天，同时每天灌胃PBS 200μL；模型组给予单纯MCD饲料喂饲7天诱导非酒精性脂肪肝模型，同时每天PBS 200μL灌胃(MCD+PBS组)；药物组给予单纯MCD饲料喂饲7天，同时每天分别给予25mg/kg NRG原料药(MCD+NRG组)或25mg/kg NRG-Nanolipo(MCD+NRG-Nanolipo)灌胃。所有动物7天后取材。

[0072] (2)动物处死取材

[0073] 上述(1)中动物连续给药7天后，过夜禁食，称重，并用毛细管内眦取血，分离血清用于测定谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)。小鼠麻醉致死，完整分离小鼠肝脏，称量肝脏总重。然后肝脏分别用于形态性分析、肝脏脂质抽提。

[0074] 肝脏血清学检测结果显示(如图4所示)，MCD饮食诱导下，血清的AST和ALT水平显著升高，预示小鼠肝脏收到严重损失。给予NRG对肝脏ALT、AST的升高有一定抑制作用，而本发明中NRG包载在纳米脂质体中，其保护肝脏的效果更显著。

[0075] (3)组织形态学实验方法

[0076] 上述(2)中取材后小心取一部分新鲜肝组织放入4％多聚甲醛溶液中固定，固定2小时后取出，转移至20％蔗糖溶液中，过夜后包埋于OCT中，放入液氮中冷冻，进行冰冻切片，每片厚度7μm。对小鼠肝脏冰冻切片进行油红O染色，通过染色深浅判断肝细胞内脂质沉积多少。

[0077] (4)小鼠肝脏冰冻切片油红O染色

[0078] 冰冻切片用PBS冲洗3分钟，2次；4％多聚甲醛固定10分钟；双蒸水浸泡2分钟，3次；60％异丙醇10分钟(脱水)；油红O中染色30分钟；60％异丙醇中迅速过数次洗去浮色；双蒸水冲洗数次(保存在水中即可)；苏木精染细胞核1分钟；双蒸水冲洗数次；90％甘油封片，显微镜下观察拍照。

[0079] 油红O配制方法：0.5％储存液(母液)由1g油红O粉末加入200mL异丙醇制成。60％工作液是将母液(6份)加入双蒸水中(4份)，激烈震荡，静置10分钟后过滤使用。(现用现配，2小时内用完)

[0080] 4％多聚甲醛配制方法：称取4g多聚甲醛，加入0.01M 100mL的PBS，60℃水浴过夜，溶解。

[0081] 如图5所示，肝脏切片油红O染色结果显示，对照组小鼠的肝脏无脂质蓄积，MCD模型组小鼠肝脏的脂质蓄积严重，柚皮素原料药对肝脏脂质蓄积有一定降低效果，柚皮素纳米脂质体增加了柚皮素对于肝脏脂质蓄积的抑制作用，而空白脂质体对肝脏脂质蓄积没有抑制作用，说明本发明柚皮素纳米脂质体对肝脏脂质蓄积的抑制作用是通过提高柚皮素本身的生物利用度实现的，而非脂质体本身的作用。

[0082] (5)小鼠肝脏脂质抽提

[0083] 另取一块新鲜肝组织用作肝脏脂质抽提，称重，放入1mL预冷的PBS中匀浆，将匀浆液转移至10mL干净、干燥的玻璃管中，加入2：1的氯仿/甲醇4mL，充分涡旋30s后，4℃，2000转，离心30min。将上层水相转移至新玻璃管中称为水相管，转移下层有机相至另一套新玻璃管中称为有机管。往水相管中加入氯仿/甲醇3mL，充分涡旋30秒，4℃，2000转，离心30分钟。将下层有机相转移至有机管中，通风橱氮气吹干。加入3％TritonX-100(v-v)500μL溶解，反复吹打，恒温50℃摇床震荡30分钟，使脂质溶解，测总甘油三脂(TG)含量，以TG含量比上脂质抽提的肝脏重量，作为该样品肝细胞内脂质的含量。

[0084] 如图6所示，小鼠肝脏脂质抽提结果显示，与油红O染色结果一致，模型组小鼠肝脏内TG水平显著升高，空白脂质体对TG含量没有降低作用，柚皮素原料药在所使用剂量下对TG含量没有显著降低作用，但本发明柚皮素纳米脂质体显著降低了肝脏内TG的蓄积(63％)。