一种治疗心肌缺血再灌注损伤的环孢霉素A递药系统

摘要

本发明公开了一种治疗心肌缺血再灌注损伤的环孢霉素A递药系统，其特征是该递药系统是基质金属蛋白酶和活性氧双响应的高载药量聚合物胶束，由嵌段共聚物聚乙二醇‑基质金属蛋白酶底物肽‑聚天冬氨酸‑苯硼酸自组装得到，嵌段共聚物通过配合作用包裹环孢菌素A从而自组装得到载药胶束。此递药系统可通过被动靶向作用于缺血心肌组织，在基质金属蛋白酶和活性氧的作用下快速释放出环孢菌素A，发挥对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，为心肌缺血再灌注损伤的防治提供新策略。

权利要求

1.一种治疗心肌缺血再灌注损伤的环孢霉素A递药系统，其特征是该递药系统是基质金属蛋白酶和活性氧双响应的高载药量聚合物胶束，由嵌段共聚物聚乙二醇-基质金属蛋白酶底物肽-聚天冬氨酸-苯硼酸自组装得到，嵌段共聚物通过配合作用包裹环孢霉素A从而自组装得到载药胶束；其中（1）聚乙二醇-MMP-PEP-NH2的制备方法是：

将序列为GPLGVRGK的基质金属蛋白酶底物肽MMP-PEP溶于二甲基亚砜中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，上述反应液在氮气保护下室温反应

1h；随后将其滴入mPEG-NH2的二甲基亚砜溶液中，混合液继续室温反应24h，反应结束后，加入5倍反应液量的水，过滤，滤液置于透析膜中透析1天，冻干即得聚乙二醇-MMP-PEP-NH2；

（2）聚乙二醇-MMP-PEP-聚天冬氨酸-苯硼酸的制备方法

将L-天冬氨酸溶解在含有一定量磷酸的环丁砜中，170℃下搅拌10h，上述反应液在氮气保护下进行，反应产生的水通过冷凝除去；反应结束后，用甲醇沉淀反应产物，并用水将反应液pH洗至中性，80℃干燥即得聚琥珀酰亚胺；

将聚琥珀酰亚胺溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，将聚乙二醇-MMP-PEP-NH2和三乙基胺溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，并滴加入聚琥珀酰亚胺的溶液中，在60℃下反应搅拌反应48h，然后将N-(3-氨丙基)咪唑和对氨甲基苯硼酸加入反应液中，继续反应24h；反应结束后，将反应液置于透析膜中透析3天，冻干即得聚乙二醇-MMP-PEP-聚天冬氨酸-苯硼酸；

（3）聚乙二醇-MMP-PEP-聚天冬氨酸-苯硼酸聚合物胶束的制备方法是：

称取适量的环孢霉素A溶于甲醇中，称取适量的聚乙二醇-MMP-PEP-聚天冬氨酸-苯硼酸聚合物溶于二甲基亚砜中，两者混合搅拌4h，然后将其滴加入蒸馏水中，室温搅拌6h后，置于透析袋中透析2天，收集透析液，冻干即得载环孢霉素A的聚乙二醇-MMP-PEP-聚天冬氨酸-苯硼酸聚合物胶束。

说明书

一种治疗心肌缺血再灌注损伤的环孢霉素A递药系统

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基质金属蛋白酶和活性氧双响应的高载药量纳米胶束递药系统的处方组成及应用方案，此递药系统为包裹环孢菌素A的聚乙二醇-基质金属蛋白酶底物肽-聚天冬氨酸-苯硼酸胶束。

背景技术

[0002] 随着溶栓治疗、经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention,PCI)、冠状动脉旁路移植术(coronary artery by pass grafting,CABG)等在临床的大量应用，随之而引发的心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MI/RI)越来越受到广泛关注。环孢霉素A(CyclosporinA,CsA)是最经典的mPTP抑制剂之一，它能与CyP-D结合并形成复合物，阻碍CyP-D与ANT结合，从而抑制mPTP开放，降低caspase-3活性，减少细胞凋亡，起到心肌保护作用，并在多种动物体内得到证实。但用传统的环孢菌素脂肪乳制剂会导致缺血预处理产生的心脏保护作用丢失。因此，需要研究新型的环孢菌素A(CsA)制剂，保证其作用的发挥。除此之外，研究表明，环孢菌素A发挥MI/RI保护作用的血药浓度应该在0.4-2μmol/L，当血药浓度高于5μmol/L时，保护作用就消失，说明环孢菌素A(CsA)的治疗窗非常窄。许多研究发现发挥保护作用的最优剂量是2.5mg/kg，与之相反，很多证据又表明环孢菌素A发挥保护作用呈现剂量依赖性。这可能与环孢菌素A在不同群体体内的代谢差异有关。而且，环孢菌素A(CsA)本身也作为免疫抑制剂应用，在其他部位的分布会产生较大的免疫抑制作用。因此，为了最大限度发挥环孢菌素A(CsA)的作用，需要设计递药系统，将其靶向的递送至缺血心肌细胞，使其能够在作用部位释放，发挥疗效。

[0003] 因此，根据心肌缺血再灌注发生后，心肌组织MMP-2升高，ROS增加的特点，我们设计纳米胶束，通过被动靶向作用于缺血心肌组织，在MMP-2的作用下，肽键断裂，PEG丢失，胶束表面呈现正电荷，增加入胞效率，然后在ROS的作用下，释放出环孢菌素A(CsA)，使其作用于缺血心肌细胞，抑制mPTP开放，从而发挥MI/RI防治的作用。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种治疗心肌缺血再灌注损伤的环孢霉素A递药系统，是一种基质金属蛋白酶和活性氧双响应的高载药量纳米胶束递药系统。通过递药系统的设计，可提高环孢菌素A在缺血心肌细胞的有效浓度，降低药物在正常组织的分布，为心急缺血再灌注损伤的防治提供新的思路。

[0005] 本发明的技术方案是：一种治疗心肌缺血再灌注损伤的环孢霉素A递药系统，其特征是该递药系统是基质金属蛋白酶和活性氧双响应的高载药量聚合物胶束，由嵌段共聚物聚乙二醇-基质金属蛋白酶底物肽-聚天冬氨酸-苯硼酸自组装得到，嵌段共聚物通过配合作用包裹环孢菌素A从而自组装得到载药胶束；其中

[0006] (1)聚乙二醇-MMP-PEP-NH2的制备方法是：

[0007] 将基质金属蛋白酶底物肽(MMP-PEP，序列为GPLGVRGK)二甲基亚砜(DMSO)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，上述反应液在氮气保护下室温反应1h，随后将其滴入mPEG-NH2的DMSO溶液中，混合液继续室温反应24h，反应结束后，加入5倍反应液量的水，过滤，滤液置于透析膜中透析1天，冻干即得聚乙二醇-MMP-PEP-NH2。

[0008] (2)聚乙二醇-MMP-PEP-聚天冬氨酸-苯硼酸(PEG-MMP-PASP-PP)的制备方法[0009] 将L-天冬氨酸溶解在含有一定量磷酸的环丁砜中，170℃下搅拌10h，上述反应液在氮气保护下进行，反应产生的水通过冷凝除去。反应结束后，用甲醇沉淀反应产物，并用水将反应液pH洗至中性。80℃干燥即得聚琥珀酰亚胺(PSI)。

[0010] 将聚琥珀酰亚胺(PSI)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将聚乙二醇-MMP-PEP-NH2和三乙基胺(TEA)溶解于DMF中，并滴加入PSI的溶液中，在60℃下反应搅拌反应48h，然后将N-(3-氨丙基)咪唑(API)和对氨甲基苯硼酸加入反应液中，继续反应24h；反应结束后，将反应液置于透析膜中透析3天，冻干即得聚乙二醇-MMP-PEP-聚天冬氨酸-苯硼酸(PEG-MMP-PASP-PP)。

[0011] (3)PEG-MMP-PASP-PP聚合物胶束的制备方法

[0012] 称取适量的环孢菌素A溶于甲醇中，称取适量的PEG-MMP-PASP聚合物溶于DMSO中，两者混合搅拌4h，然后将其滴加入蒸馏水中，室温搅拌6h后，置于透析袋中透析2天，收集透析液，冻干即得载环孢菌素A的PEG-MMP-PASP聚合物胶束。

[0013] 本发明构建了一种新型纳米递药系统，此递药系统为聚合物纳米胶束，胶束材料为聚乙二醇-MMP-PEP-聚天冬氨酸-苯硼酸(PEG-MMP-PASP-PP)，包裹环孢菌素A得到载药胶束。该胶束可通过基质金属蛋白酶和活性氧双响应，递送更多的药物至缺血心肌细胞并快速释放出药物。从而发挥心急缺血再灌注损伤的防治作用。

附图说明

[0014] 图1是载药PEG-MMP-PASP-PP聚合物胶束在不同浓度H2O2溶液中的CsA释药曲线图，其中n＝3。

[0015] 图2是载药PEG-MMP-PASP-PP聚合物胶束对于缺氧复氧损伤H9C2细胞的保护作用。

[0016] 图3是CsA和CsA载药胶束对于H9C2缺氧复氧损伤细胞线粒体膜电位的影响。

[0017] 图4是CsA和CsA载药胶束对于大鼠心肌缺血再灌注损伤后梗死区面积的影响。

[0018] 图5CsA和CsA载药胶束对于大鼠心肌缺血再灌注损伤后危险区面积的影响。

具体实施方式

[0019] 环孢菌素A双响应纳米胶束的制备及其对心肌缺血再灌注损伤的防治作用[0020] 1目的：评价包裹CsA的聚合物胶束对MIRI的防治作用。

[0021] 2研究方法：

[0022] 2.1包封率及载药量测定

[0023] 将胶束溶于DMSO中，破坏胶束结构，HPLC-DAD法检测包封率和载药量。

[0024] 载药量＝(递药系统中包裹的药物量/载药递药系统重量)×100％

[0025] 包封率＝(实际载药量/投药量)×100％

[0026] 2.2 ROS响应特性评价

[0027] 称取适量载药胶束溶于不同释药介质，置于透析袋内，于设定时间点下取样，通过HPLC-DAD测定不同浓度H2O2下递药系统的释药情况。

[0028] 2.3细胞保护作用评价

[0029] 取对数生长期的H9C2细胞接种于96孔板中，密度为1×104，培养36h后加入缺血液，在95％N2，5％CO2的条件下37℃孵育3h，然后取出后吸除缺血液，分别加入不含血清的培养液、环孢菌素A及载药胶束，不加缺血液的细胞设为正常对照组，4h后加入20μL MTT继续孵育4h，弃去培养液，用150μL DMSO重新溶解紫色结晶，酶标仪于490nm下读取OD值，绘制细胞存活率曲线图，按公式计算细胞存活率。

[0030] 细胞存活率(％)＝(试验组OD值/空白对照组OD值)×100％

[0031] 2.4药物对缺氧复氧H9C2细胞线粒体膜电位的影响

[0032] 取对数生长的H9C2细胞接种至载有载玻片的细胞培养板中，36h后加入缺血液，在95％N2，5％CO2的条件下37℃孵育3h，然后取出后吸除缺血液，分别加入不含血清的培养液、环孢菌素A及载药胶束，不加缺血液的细胞设为正常对照组，继续孵育4h后，除去培养液，加入JC-1染色30min，除去染料，PBS冲洗3遍，多聚甲醛固定，激光共聚焦显微镜观察红绿荧光，通过计算红绿荧光的比值反映细胞线粒体膜电位的变化。

[0033] 2.5药物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的防治作用评价

[0034] 24只SD大鼠随机分成4组，每组6只。经腹腔注射3％的戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉后，仰卧位固定在手术台上。将针形电极插入四肢皮下，全程记录标准肢体Ⅱ导联心电图。备皮、常规消毒。于颈部正中行气管切开，插入气管套管，连接呼吸机控制通气，呼气末正压通气参数为：潮气量2ml,呼吸频率40-50次/min，呼：吸比为2:1。在胸骨正中左侧约0.5mm处纵行切开，钝性分离各层肌肉，暴露3至5肋间，用血管钳夹断4、5肋骨后，放置开睑器撑开切开部位，剪破心包膜，暴露跳动的心脏。以左冠状动脉主干为标志，用小圆针在左心耳根部下方约2mm处穿过左冠状动脉前降支心肌层，穿5-0丝线备用，待心电图恢复正常后记录正常心电图。在左冠状动脉前降支穿线处表面放置一带凹槽的细小塑料管(便于松开结扎线)，连同细管结扎冠脉，sham组只穿线不结扎。结扎左冠状动脉前降支使心肌缺血30min后，松开结扎线，使缺血心肌再灌注2h。持续正压通气至再灌注结束，分别记录心肌缺血及再灌注时心电图。于再灌注开始前5min经颈静脉注射给药。

[0035] 试验结束后，结扎心脏，经颈动脉注射Evans Blue 2ml，取下心脏后，-80℃冷冻过夜，切片后进行TTC染色。拍照并测量心梗面积。

[0036] 3实验结果：

[0037] 3.1包封率及载药量

[0038] 载药胶束的包封率及载药量如表1所示。结果提示本专利设计的胶束递药系统具有较高的载药量及包封效率。

[0039] 表1递药系统的载药量及包封率

[0040]

[0041] 3.2 ROS响应特性评价

[0042] 观察载药聚合物胶束的释药曲线发现，CsA胶束的释放呈H2O2浓度依赖特性，2mM H2O2条件下孵育2h后，约80％的包裹药物可从胶束中释放出来，提示载药聚合物胶束进入缺血心肌细胞后，能够快速释放CsA，为治疗心肌缺血再灌注损伤提供可能。

[0043] 3.3细胞保护作用评价

[0044] 通过对比载药胶束和游离药物的细胞保护作用发现，载药胶束具有较强的细胞保护作用，其对于缺氧复氧H9C2细胞的保护作用高于游离CsA，提示载CsA聚合物胶束可提高体外抗损伤效果。

[0045] 3.4药物对缺氧复氧H9C2细胞线粒体膜电位的影响

[0046] 激光共聚焦结果显示，与游离药物相比，载药胶束对于线粒体膜电位的提高作用更为明显。提示此递药系统可将CsA更多地递送至缺血心肌细胞内，抑制mPTP的开放，从而抑制线粒体膜电位的降低。

[0047] 3.5药物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的防治作用评价

[0048] 相比于同剂量游离CsA，载药胶束能够显著地减少心肌梗死区和危险区面积。说明纳米胶束能够提高环孢菌素A在缺血心肌组织和细胞的分布，从而提高治疗效果。

[0049] 4结论：

[0050] 体内外的实验结果表明，与游离环孢菌素A相比，负载环孢菌素A的聚合物胶束PEG-MMP-PASP-PP可显著提高环孢菌素A对于心肌缺血再灌注损伤的保护作用，具有一定的开发前景。

[0051] 序列表

[0052] <110>中国人民解放军第四军医大学

[0053] <120>一种治疗心肌缺血再灌注损伤的环孢霉素A递药系统

[0054] <160>1

[0055] <210>1

[0056] <211>8(长度)

[0057] <212>DAN(类型)

[0058] <213>人工序列(来源)

[0059] <400>1

[0060] Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys