本发明公开了一种氨基甲酸酯和菊酯类多残留检测抗原、抗体的制备方法及应用。本发明填补了本领域长期以来的技术空白，提供了一种同时检测氨基甲酸酯类和菊酯类多残留的联合抗原，基于所述联合抗原，有效建立一种同时检测氨基甲酸酯类和菊酯类多残留的检测方法。具有广阔的应用前景。所述氨基甲酸酯和菊酯类多残留检测抗原，其结构式如式（Ⅰ）所示：（Ⅰ）。
1.一种氨基甲酸酯和菊酯类多残留检测抗原，其结构式如式(Ⅰ)所示：
2.权利要求1所述氨基甲酸酯和菊酯类多残留检测抗原的制备方法，其特征在于，是采用活泼酯法将氨基甲酸酯类半抗原与牛血清白蛋白偶联，然后将偶联后的产物继续通过活泼酯法与菊酯类半抗原进行偶联，制备获得氨基甲酸酯类和菊酯类多残留检测抗原。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将氨基甲酸酯类半抗原溶于DMF，形成混合溶液，然后加入EDC和NHS，于室温下搅拌反应；待反应结束后，将上述反应液加入到载体蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，继续反应，然后将反应液于室温下透析，制得氨基甲酸酯类完全抗原；
S2.将菊酯类半抗原溶于DMF中，形成混合溶液，然后加入EDC和NHS，于室温下搅拌反应；
S3.将步骤S1制得的氨基甲酸酯类完全抗原溶于DMF溶液中，然后加入步骤S2制备的反应液，于室温下反应，待反应结束后，将反应液进行透析，即得到所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留检测抗原；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述氨基甲酸酯类半抗原与载体蛋白的质量比为12:1；步骤S1所述氨基甲酸酯类半抗原与EDC和NHS的反应时间为8～24h；步骤S1所述氨基甲酸酯类半抗原与载体蛋白的反应时间为6～24h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2反应时间为8～12h；步骤S3所述菊酯类半抗原与氨基甲酸酯类完全抗原的质量比为10:1；步骤S3反应时间为6～8h；所述DMF、EDC和NHS的质量比按照10:2:1确定。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氨基甲酸酯类半抗原通过以下步骤制备得到：S11.将呋喃酚溶于二氯甲烷，然后加入吡啶形成混合溶液，然后向混合溶液中滴加溶于二氯甲烷的对硝基苯氯甲酸酯溶液，整个体系保持4℃以下冰盐浴，待反应结束后，反应液先用稀盐酸振荡洗涤，过柱纯化，得到产物；
S12.将步骤S11制得的产物溶于四氢呋喃，形成四氢呋喃混合溶液，将4-氨基丁酸溶于碳酸氢钠溶液，于冰浴下将四氢呋喃混合溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液，待反应结束后，继续于冰浴下加入稀盐酸调反应液pH至4.0，然后用乙酸乙酯提取反应液，然后向提取液中加入无水硫酸钠进行脱水，浓缩，然后进行过柱纯化，收集目标组分，减压蒸馏除去溶剂即得氨基甲酸酯类半抗原。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菊酯类半抗原通过以下方法制备得到：S21.将四氯化碳、乙腈和水按照10：10:15的体积比混合后，形成四氯化碳、乙腈和水的混合物备用；
S22.在反应瓶中加入氯氰菊酯2.2g，三氯化钌0.12g，高碘酸钠4.3g和35mL上述制备的混合液，加热，反应，反应结束后，蒸干有机溶剂，将剩余溶液的pH值调为酸性，用乙酸乙酯萃取、水洗；取有机相过柱纯化即制得菊酯类半抗原。
8.权利要求1所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗原或权利要求2至7所述方法制备得到的氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗原在制备氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗体或检测氨基甲酸酯类和菊酯类农药残留方面的应用。
9.采用权利要求1所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗原或权利要求2至7所述方法制备得到的氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗原制备得到的氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗体。
10.权利要求9所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗体在检测氨基甲酸酯类和菊酯类中的应用。
氨基甲酸酯和菊酯类多残留检测抗原、抗体及其制备方法及
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及食品安全技术领域，更具体地，涉及一种氨基甲酸酯和菊酯类多残留检测抗原、抗体及其制备方法及应用。
背景技术
[0002] 我国是一个农业大国，每年农产品的产量和消耗量均居于世界前列，然而农药残留问题一直困扰着我国农业发展。氨基甲酸酯类农药和菊酯类农药是我国农业生产中常见的两类农药，为此研究人员针对这两类农药开发了一系列的检测方法，其中免疫检测法由于具有灵敏度高、特异性强、前处理简单、检验周期短、适用于大批量样品检测等优点，已成为近年来研究的热点。然而受特异性的思维定势的限制，现有的免疫分析方法只适用于其中一类农药的检测，而无法同时满足对多种农药的检测，造成了无用的重复劳动和资源的浪费。因此开发一种能够同时检测氨基甲酸酯类农药和菊酯类农药的同时快速检测方法具有重要的意义。
发明内容
[0003] 本发明要解决的技术问题是克服现有氨基甲酸酯类农药和菊酯类农药残留同时检测分析的技术空白，提供一种同时检测氨基甲酸酯类农药和菊酯类农药残留用的抗原。
[0004] 本发明还一要解决的技术问题是同时检测氨基甲酸酯类农药和菊酯类农药残留用的半抗原和抗原的制备方法。
[0005] 本发明要解决的另一技术问题是提供同时检测氨基甲酸酯类农药和菊酯类农药残留用的抗体。
[0006] 本发明还一要解决的技术问题是同时检测氨基甲酸酯类农药和菊酯类农药残留用的抗原和抗体的应用。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
[0008] 提供一种氨基甲酸酯类和菊酯类联合抗原，其结构式如式(Ⅰ)所示：
[0009]
[0010] 优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白。
[0011] 本发明同时提供所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗原的制备方法，是采用活泼酯法将氨基甲酸酯类半抗原与载体蛋白偶联，然后将偶联后的产物继续通过活泼酯法与菊酯类半抗原进行偶联，制备获得氨基甲酸酯类和菊酯类多残留检测抗原。
[0012] 具体地，所述氨基甲酸酯类和菊酯类联合抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0013] S1.将氨基甲酸酯类半抗原溶于DMF，形成混合溶液，然后加入EDC和NHS，于室温下搅拌反应；待反应结束后，将上述反应液加入到载体蛋白的磷酸盐(pH7.4)缓冲溶液中，继续反应，然后将反应液于室温下透析，制得氨基甲酸酯类完全抗原；
[0014] S2.将菊酯类半抗原溶于DMF中，形成混合溶液，然后加入EDC和NHS，于室温下搅拌反应；
[0015] S3.将步骤S1制得的氨基甲酸酯类完全抗原溶于DMF溶液中，然后加入步骤S2制备的反应液，于室温下反应，待反应结束后，将将反应液进行透析，即得到所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留检测抗原。
[0016] 优选地，步骤S1所述氨基甲酸酯类半抗原与载体蛋白的质量比为12:1。
[0017] 优选地，步骤S1所述氨基甲酸酯类半抗原与EDC和NHS的反应时间为8～24h。
[0018] 优选地，步骤S1所述氨基甲酸酯类半抗原与载体蛋白的反应时间为6～24h。
[0019] 优选地，步骤S2所述反应时间为8～12h。
[0020] 优选地，步骤S3所述菊酯类半抗原与氨基甲酸酯类抗原的质量比为10:1。
[0021] 优选地，步骤S3所述反应时间为6～8h。
[0022] 上述制备方法中，DMF、EDC和NHS的质量比按照10:2:1确定。
[0023] 上述制备方法中，载体蛋白的磷酸盐缓冲溶液的组成为50mg BSA用6mL PBS溶解后再加入3.75mLDMF，用量为50mg。
[0024] 优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白。
[0025] 所述氨基甲酸酯类半抗原具有式(Ⅱ)所示分子结构：
[0026]
[0027] 所述菊酯类半抗原具有式(Ⅲ)所示分子结构：
[0028]
[0029] 优选地，所述氨基甲酸酯类半抗原通过以下步骤制备得到：
[0030] S11.将呋喃酚溶于二氯甲烷，然后加入吡啶形成混合溶液，然后向混合溶液中滴加对硝基苯氯甲酸酯溶液(对硝基苯氯甲酸酯溶于二氯甲烷)，整个体系保持4℃以下冰盐浴，待反应结束后，反应液先用稀盐酸振荡洗涤，过柱纯化，得到产物；所述产物为淡黄色的晶体；
[0031] S12.将步骤S11制得的产物溶于四氢呋喃，形成四氢呋喃混合溶液，将4-氨基丁酸溶于碳酸氢钠溶液，于冰浴下将四氢呋喃混合溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液，待反应结束后，继续于冰浴下加入稀盐酸调反应液pH至4.0，然后用乙酸乙酯提取反应液，然后向提取液中加入无水硫酸钠进行脱水，浓缩，然后进行常规过柱纯化，收集目标组分，减压蒸馏除去溶剂即得氨基甲酸酯类半抗原。
[0032] 优选地，步骤S12所述乙酸乙酯提取反应液的次数为3次。
[0033] 优选地，所述菊酯类半抗原通过以下方法制备得到：
[0034] S21.将四氯化碳、乙腈和水按照10：10:15的体积比混合后，形成四氯化碳、乙腈和水的混合物备用；
[0035] S22.在反应瓶中加入氯氰菊酯2.2g，三氯化钌0.12g，高碘酸钠4.3g和35mL上述制备的混合液，加热，反应，反应结束后，蒸干有机溶剂，将剩余溶液的pH值调为酸性，用乙酸乙酯萃取、水洗；取有机相过柱纯化即制得菊酯类半抗原。
[0036] 优选地，步骤S22所述加热的温度为60℃，反应的时间为2h。
[0037] 本发明同时提供所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗原在制备氨基甲酸酯类和菊酯类多残留抗体或检测氨基甲酸酯类和菊酯类农药残留方面的应用。
[0038] 本发明同时提供采用所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留检测抗原制备得到的氨基甲酸酯类和菊酯类多残留检测抗体，以及所述抗体在检测氨基甲酸酯类和菊酯类中的应用。
[0039] 本发明的有益效果：
[0040] 本发明填补了本领域长期以来的技术空白，提供了一种同时检测氨基甲酸酯类和菊酯类多残留的联合抗原，基于所述联合抗原，有效建立一种同时检测氨基甲酸酯类和菊酯类多残留的检测方法，具有广阔的应用前景。
[0041] 为实现本发明目的，本发明同时提供了两种半抗原，并提供了所述半抗原的制备方法，基于所述两种半抗原，非常简单易行地制备得到所述氨基甲酸酯类和菊酯类多残留的特异性抗原，为本发明检测技术方案打下技术基础。
[0042] 本发明制备方法条件温和，易于推广。
附图说明
[0043] 图1氨基甲酸酯类半抗原合成路线图。
[0044] 图2氨基甲酸酯类半抗原质谱图。
[0045] 图3菊酯类半抗原合成路线图。
[0046] 图4菊酯类半抗原质谱图。
[0047] 图5克百威icELISA标准曲线。
[0048] 图6氯氰菊酯icELISA标准曲线。
具体实施方式
[0049] 下面结合具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的生物材料、试剂原料为常规市购或商业途径获得的生物材料和试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
[0050] 实施例1氨基甲酸酯类、菊酯类半抗原的制备方法
[0051] (1)氨基甲酸酯类半抗原的合成
[0052] S11.称取0.8g呋喃酚溶于15mL二氯甲烷中，然后加入0.58mL吡啶形成混合溶液，然后向混合溶液中滴加1g对硝基苯氯甲酸酯溶液(溶于10mL二氯甲烷)，于4℃冰盐浴下反应3h；反应结束后，用3％的盐酸于分液漏斗中对反应液进行振荡洗涤，洗涤液过柱纯化，得到淡黄色的晶体。
[0053] S12.取0.4g上述反应产物，溶于12mL四氢呋喃中，取0.16g 4-氨基丁酸溶于12mL pH8.2的碳酸氢钠溶液中，然后于冰浴下将四氢呋喃溶液逐滴加入到碳酸氢钠溶液中，于室温下反应4.5h。反应结束后，于冰浴下继续加入4mol/L的盐酸溶液，调反应液pH至4，然后反应液用乙酸乙酯提取3次，有机相用无水Na2SO4脱水，然后经过柱纯化、减压蒸馏除去溶剂即制得氨基酸甲酯类半抗原。氨基酸甲酯类半抗原的质谱图如图2所示。证明其具有式(Ⅱ)所示分子结构：
[0054]
[0055] (2)菊酯类半抗原合成
[0056] S21.将四氯化碳、乙腈和水按照10：10：15的体积混合后，形成四氯化碳、乙腈和水的混合溶液；
[0057] S22.取2.2g氯氰菊酯，0.12g三氯化钌，4.3g高碘酸钠和35mL上述混合溶液，加热至60℃反应2h，待反应结束后，蒸干有机溶剂，将剩余溶液pH值调至酸性，然后用乙酸乙酯进行萃取，然后水洗，取有机相过柱纯化即制得菊酯类半抗原。菊酯类半抗原的质谱图如图4所示。证明其具有式(Ⅲ)所示分子结构：
[0058]
[0059] 实施例2氨基甲酸酯类和菊酯类联合抗原的制备
[0060] S1.称取实施例1制得的氨基甲酸酯类半抗原29mg溶于1mL DMF中，搅拌加入36mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，25mg N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),于室温下搅拌反应8h，反应结束后，取0.25mL反应液加入到50mg pH7.4BSA磷酸盐缓冲溶液中，于室温下搅拌6h后，将反应液装入透析袋中，用pH7.4磷酸盐缓冲溶液透析3d，每天换水
2～3次，制得氨基甲酸酯完全抗原；
[0061] S2.称取实施例1制得的菊酯类半抗原37mg溶于1mL DMF中，搅拌加入36mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),25mg N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应8h，得反应液；
[0062] S3.取0.25mL反应液加入到氨基甲酸酯类完全抗原的DMF溶液中，于室温下搅拌6h后，装入透析袋，用pH7.4磷酸盐缓冲溶液透析3d，每天换水2～3次，透析结束后即制得氨基甲酸酯类和菊酯类多残留检测抗原。
[0063] 实施例3抗体的制备及鉴定
[0064] 将免疫原与等剂量的免疫佐剂混合(第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫军用弗氏不完全佐剂)，用搅拌器完全乳化后，背部多点免疫健康大白兔，以后每隔两周加强免疫一次，利用间接ELISA测定血清效价和抑制率，待效价稳定后，再加强免疫一次。最后一次免疫后10天心脏采血，离心保留血清。采用辛酸-硫酸铵盐析法对血清进行纯化得到高特异性的抗体。
[0065] 实施例4酶联免疫方法的建立
[0066] 通过方阵滴定法确定抗原和抗体的工作浓度，包被原的工作浓度为0.5μg/mL，氨基甲酸酯和菊酯抗体的稀释倍数为1/40000。
[0067] 用不同浓度的氨基甲酸酯和菊酯溶液做实验溶液，梯度稀释下进行竞争，采用9组平行实验(n＝3)。间接竞争性ELISA方法：用上述工作浓度的包被酶标板，将实验溶液与抗体溶液同时加入到酶标板小孔中，同时设置空白孔和阴性对照孔，37℃温育40min，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打：加入稀释好的酶标二抗溶液，37℃温育20min，用洗涤液洗涤5次，拍干：加入底物显色溶液，37℃温育10min，加入终止液终止显色，用酶标仪在波长450nm处测定吸光值OD，以吸光值OD为纵坐标，以氨基甲酸酯和菊酯实验溶液浓度的log10值为横坐标，绘制半对数标准曲线图，见附图5或图6所示氨基甲酸酯和菊酯ELISA竞争标准曲线(分别以克百威和氯氰菊酯为例)。
[0068] 结果表明标准曲线具有完整的反S形状，并且有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数3次，实验重复性良好，相对标准偏差却在15％以内。
[0069] 由同样的方法绘制标准曲线计算其它氨基甲酸酯和菊酯农药的最低检测限(LOD值)，半数抑制量(IC50值)，线性范围，见表1所示。说明本发明方法准确度和灵敏度较好，可用于农产品和食品样品中氨基甲酸酯和菊酯的检测。
[0070] 表1抗体检测5个药物的LOD、IC50、LR值
[0071]药物名称 LOD(mg/L) IC50(mg/L) LR(mg/L)
克百威 0.51 61.1 6.6～521.8
氯氰菊酯 1.24 74.77 7.88～519.50
溴氰菊酯 3.3 143.2 13.2～1556.0
甲氰菊酯 7.54 531.9 15.50～1824.8
联苯菊酯 14.21 824.3 27.19～2499.1
