肺癌和肺部结节蛋白特征谱及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种肺癌和肺部结节蛋白特征谱及其构建方法与应用。该方法包括：分别从肺癌/肺部结节患者组和健康对照者组的血浆中提取总蛋白，胰蛋白酶酶解，iTRAQ标记，二维液相色谱和串联质谱检测，相对定量分析，获得肺癌/肺部结节相关蛋白特征谱；肺癌相关蛋白特征谱中，肺癌患者组和健康对照者组中表达差异的蛋白为上调蛋白(SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH)；肺部结节相关蛋白特征谱中，肺部结节患者组和健康对照者组中表达差异的蛋白为上调蛋白(SERPINA1和CRP)和下调蛋白(SAA1、IGHG4和CFH)。本发明有助于研究肺癌和肺部结节生物学本质，对肺癌和肺部结节规范分型有重要意义。

权利要求

1.用于检测SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白表达量的物质以及记载有下述内容的可读性载体在制备辅助诊断肺癌的试剂盒中的应用：若与健康对照者相比，待测者的离体血浆样本中所述5种蛋白的表达量均上调，则所述待测者为或候选为肺癌患者；反之，则所述待测者不为或候选不为肺癌患者。

2.用于检测SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白表达量的物质以及记载有下述内容的可读性载体在制备辅助诊断肺部结节的试剂盒中的应用：若与健康对照者相比，待测者的离体血浆样本中所述SERPINA1和所述CRP这2种蛋白的表达量均上调，且所述SAA1、所述IGHG4和所述CFH这3种蛋白的表达量均下调，则所述待测者为或候选为肺部结节患者；反之，则所述待测者不为或候选不为肺部结节患者。

3.用于辅助诊断肺癌的系统，包括用于检测SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白表达量的物质和数据处理装置；所述数据处理装置内设模块1和模块2，所述模块1具有如下（a1）所示功能，所述模块2具有如下（a2）所示功能：（a1）分别比较取自待测者和健康对照者的离体血浆中的所述5种蛋白的表达量；

（a2）根据（a1）的比较结果按照如下确定所述待测者是否为肺癌患者：若与所述健康对照者相比，所述待测者的离体血浆样本中所述5种蛋白的表达量均上调，则所述待测者为或候选为肺癌患者；反之，则所述待测者不为或候选不为肺癌患者。

4.用于辅助诊断肺部结节的系统，包括用于检测SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白表达量的物质和数据处理装置；所述数据处理装置内设模块1和模块2，所述模块1具有如下（a1）所示功能，所述模块2具有如下（a2）所示功能：（a1）分别比较取自待测者和健康对照者的离体血浆中的所述5种蛋白的表达量；

（a2）根据（a1）的比较结果按照如下确定所述待测者是否为肺部结节患者：若与所述健康对照者相比，所述待测者的离体血浆样本中所述SERPINA1和所述CRP这2种蛋白的表达量均上调，且所述SAA1、所述IGHG4和所述CFH这3种蛋白的表达量均下调，则所述待测者为或候选为肺部结节患者；反之，则所述待测者不为或候选不为肺部结节患者。

5.根据权利要求3或4所述的系统，其特征在于：所述系统中还包括如下中的至少一种：（1）用于从离体血浆中进行总蛋白抽提所需的试剂和/或仪器；

（2）胰蛋白酶；

（3）iTRAQ试剂盒；

（4）二维液相色谱仪；

（5）串联质谱仪；

（6）用于去除高丰度蛋白的色谱柱；

（7）C18反向硅胶吸附脱盐柱。

说明书

肺癌和肺部结节蛋白特征谱及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于医学和蛋白质组学领域，涉及一种肺癌和肺部结节蛋白特征谱及其构建方法与应用。

背景技术

[0002] 肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺部结节是一种病因未明的肺部肉芽肿性疾病，近来已引起国内广泛注意。

[0003] 目前，肺癌的诊断方法有X线检查、支气管镜检查、细胞学检查、剖胸探查术、ECT检查、纵隔镜检查等。然而这些检查存在着各种弊端，或费时费力、或会给病人带来极大痛苦。

[0004] 蛋白质组学是在1994年由Williams和Wilkins提出的，通过寻找特异性蛋白质，为研究疾病机制提供线索。近年来随着人类蛋白质组学计划的全面启动，蛋白质组学的研究也产生了巨大进展，蛋白质组学研究中应用的定量方法主要有两种，一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量，另外一种是基于质谱检测技术的定量，包括标记定量技术(iTRAQ)和非标记定量技术(Label free quantification)两种。iTRAQ结合二维凝胶色谱与串联质谱是将iTRAQ同位素标记技术、二维液相色谱技术、串联质谱技术相联用，能对所有蛋白质进行同位素标记，与质谱联用时，信号离子表现为不同质荷比的峰，根据波峰的高度及面积可得到准确的蛋白质定量信息，适合对多样本的平行分析，可用于发现更多与疾病相关的蛋白质。

[0005] SAA1：血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)是一种急性时限反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12000。在急性时限反应中，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000倍，但半衰期极短，只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白A与高密度脂蛋白(HDL)有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。血清淀粉样蛋白A一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。

[0006] SERPINA1：α-1抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin，SERPINA1)是一种糖蛋白。含糖10％～20％，主要由肝脏合成，广泛分布于正常人血清和体液中。它是血清中最主要的蛋白酶抑制剂，对凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用；也是一种急性时相反应蛋白，在炎症性疾患时，α-1抗胰蛋白酶可透过毛细血管进入组织液，在炎症局部往往浓度很高，对急性炎性疾病有一定限制作用。

[0007] CRP：人类C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。CRP在健康人血清中浓度很低(<5mg/L)，而在细菌感染或组织损伤时，其浓度显著升高，故被认为其最有价值。

[0008] IGHG4：IgG4为IgG中一个亚型，属于一种免疫球蛋白，占IgG总量的1～7％。IgG4相关性疾病是一种与IgG4淋巴细胞密切相关的疾病，该类疾病以血清IgG4水平升高以及IgG4阳性细胞浸润多种器官和组织为特征，常见受累器官包括泪腺、胰腺和腹膜后间隙等，累及的器官或组织由于慢性炎症及纤维化进程可导致弥漫性肿大。

[0009] CFH：补体因子H(Complement Factor H，CFH)是巨噬细胞、血小板产生的补体抑制因子，补体因子H为单链结构，能与C3b结合，抑制补体激活旁路途径的C3转化酶，并作为补体I因子的辅助因子水解C3b。补体因子H的产生赋予体内肿瘤细胞一种选择性生长优势，让细胞逃逸宿主免疫系统监视，帮助肿瘤细胞逃脱人体内在调控避免凋亡。

发明内容

[0010] 本发明的第一个目的是提供一种肺癌相关蛋白特征谱的构建方法。

[0011] 本发明所提供的肺癌相关蛋白特征谱的构建方法为非诊断目的的方法，具体可包括如下步骤：分别从肺癌患者组和健康对照者组的离体血浆中提取总蛋白，用胰蛋白酶进行酶解，对酶解所得多肽进行iTRAQ标记，然后进行二维液相色谱和串联质谱检测，对检测结果进行相对定量分析，根据分析结果获得肺癌相关蛋白特征谱；

[0012] 所述肺癌相关蛋白特征谱中，所述肺癌患者组和所述健康对照者组中表达差异的蛋白质为表达上调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质为SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH。

[0013] 本发明的第二个目的是提供一种肺部结节相关蛋白特征谱的构建方法。

[0014] 本发明所提供的肺部结节相关蛋白特征谱的构建方法为非诊断目的的方法，具体可包括如下步骤：分别从肺部结节患者组和健康对照者组的离体血浆中提取总蛋白，用胰蛋白酶进行酶解，对酶解所得多肽进行iTRAQ标记，然后进行二维液相色谱和串联质谱检测，对检测结果进行相对定量分析，根据分析结果获得肺部结节相关蛋白特征谱；

[0015] 所述肺部结节相关蛋白特征谱中，所述肺部结节患者组和所述健康对照者组中表达差异的蛋白质为表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质有SERPINA1和CRP；所述下调的蛋白质有SAA1、IGHG4和CFH。

[0016] 在上述两种方法中，在提取总蛋白之后，还可包括去除高丰度蛋白的步骤。其中，所述高丰度蛋白主要为白蛋白和IgG。在本发明的一个实施例中，具体是采用默克多重吸附去高丰度蛋白液相色谱柱去除高丰度蛋白的。

[0017] 在上述两种方法中，在对酶解所得多肽进行iTRAQ标记之后，在进行二维液相色谱和串联质谱检测之前，还可包括对样品进行C18柱子脱盐处理的步骤。其中，流动相为由流动相A和流动相B混合而成；流动相A的配方如下：0.1％甲酸水溶液(％表示体积百分含量)；流动相B的配方如下：0.08％甲酸乙腈水(乙腈:水＝80:20，v/v，％表示体积百分含量)。分离梯度如下(％表示体积百分含量)：

[0018]

[0019] 在所述方法中，所述相对定量分析过程中，采用ProteinPilot软件对所述串联质谱数据进行定量分析，筛选出比值≥1.5的蛋白为表达上调的蛋白，比值≤0.67的蛋白为表达下调的蛋白，所述比值为所述肺癌患者组或所述肺部结节患者组的蛋白表达量与所述健康对照者组的蛋白表达量的比值(二级质谱中报告离子的峰面积比值即可表示同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值)。

[0020] 所述二维液相色谱为二维纳升液相色谱，具体条件如下：上样体积8μl，夹心法上样；装载泵流速2μl/min，15min；流动相为由流动相A和流动相B混合而成；流动相A的配方如下：0.1％甲酸水溶液(％表示体积百分含量)；流动相B的配方如下：0.08％甲酸乙腈水(乙腈:水＝80:20，v/v，％表示体积百分含量)；分离流速0.3μl/min，分离梯度具体如下：

[0021]

[0022]

[0023] 所述串联质谱的条件如下：(1)源气参数：离子喷射电压：2.3kv；GS1气帘：4；Curtain gas气帘：30或者35；(2)飞行时间质谱：质荷比：350-1250；累积时间：0.25s；(3)离子扫描：质荷比：100-1500；累积时间：0.1s；动态排除时间：25s；滚动电子：enabled；Adjust CE when using iTRAQ reagent：enabled；CES：5。

[0024] 本发明的第三个目的是提供一种肺癌相关蛋白特征谱。

[0025] 本发明所提供的肺癌相关蛋白特征谱为非诊断目的的肺癌相关蛋白特征谱，所述特征谱中差异表达的蛋白质为表达上调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质为SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH。

[0026] 本发明的第四个目的是提供一种肺部结节相关蛋白特征谱。

[0027] 本发明所提供的肺部结节相关蛋白特征谱为非诊断目的的肺部结节相关蛋白特征谱，所述特征谱中差异表达的蛋白质为表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质有SERPINA1和CRP；所述下调的蛋白质有SAA1、IGHG4和CFH。

[0028] 本发明的第五个目的是提供一种应用。

[0029] 本发明所提供的应用具体为如下(A)或(B)：

[0030] (A)用于检测SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白表达量的物质以及记载有下述内容的可读性载体在制备辅助诊断肺癌的试剂盒中的应用：

[0031] 若与健康对照者相比，待测者的离体血浆样本中所述5种蛋白的表达量均上调，则所述待测者为或候选为肺癌患者；反之，则所述待测者不为或候选不为肺癌患者；

[0032] 所述上调为所述待测者的蛋白表达量与所述健康对照者的蛋白表达量的比值≥1.5。

[0033] (B)用于检测SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白表达量的物质以及记载有下述内容的可读性载体在制备辅助诊断肺部结节的试剂盒中的应用：

[0034] 若与健康对照者相比，待测者的离体血浆样本中所述SERPINA1和所述CRP这2种蛋白的表达量均上调，且所述SAA1、所述IGHG4和所述CFH这3种蛋白的表达量均下调，则所述待测者为或候选为肺部结节患者；反之，则所述待测者不为或候选不为肺部结节患者；

[0035] 所述上调为所述待测者的蛋白表达量与所述健康对照者的蛋白表达量的比值≥1.5；所述下调为所述待测者的蛋白表达量与所述健康对照者的蛋白表达量的比值≤0.67。

[0036] 本发明的第六个目的是提供一种系统。

[0037] 本发明所提供的系统为如下(C)或(D)：

[0038] (C)用于辅助诊断肺癌的系统，包括用于检测SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白表达量的物质和数据处理装置；所述数据处理装置内设模块1和模块2，所述模块1具有如下(a1)所示功能，所述模块2具有如下(a2)所示功能：

[0039] (a1)分别比较取自待测者和健康对照者的离体血浆中的所述5种蛋白的表达量；

[0040] (a2)根据(a1)的比较结果按照如下确定所述待测者是否为肺癌患者：若与所述健康对照者相比，所述待测者的离体血浆样本中所述5种蛋白的表达量均上调，则所述待测者为或候选为肺癌患者；反之，则所述待测者不为或候选不为肺癌患者；所述上调为所述待测者的蛋白表达量与所述健康对照者的蛋白表达量的比值≥1.5。

[0041] (D)用于辅助诊断肺部结节的系统，包括用于检测SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白表达量的物质和数据处理装置；所述数据处理装置内设模块1和模块2，所述模块1具有如下(a1)所示功能，所述模块2具有如下(a2)所示功能：

[0042] (a1)分别比较取自待测者和健康对照者的离体血浆中的所述5种蛋白的表达量；

[0043] (a2)根据(a1)的比较结果按照如下确定所述待测者是否为肺部结节患者：若与所述健康对照者相比，所述待测者的离体血浆样本中所述SERPINA1和所述CRP这2种蛋白的表达量均上调，且所述SAA1、所述IGHG4和所述CFH这3种蛋白的表达量均下调，则所述待测者为或候选为肺部结节患者；反之，则所述待测者不为或候选不为肺部结节患者；所述上调为所述待测者的蛋白表达量与所述健康对照者的蛋白表达量的比值≥1.5；所述下调为所述待测者的蛋白表达量与所述健康对照者的蛋白表达量的比值≤0.67。

[0044] 在所述系统中，还可包括如下中的至少一种：(1)用于从离体血浆中进行总蛋白抽提所需的试剂和/或仪器；(2)胰蛋白酶；(3)iTRAQ试剂盒；(4)二维液相色谱仪；(5)串联质谱仪；(6)用于去除高丰度蛋白的色谱柱；(7)C18反向硅胶吸附脱盐柱。

[0045] 在本发明中，所述SAA1为氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；所述SERPINA1为氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质；所述CRP为氨基酸序列为序列表中序列3所示的蛋白质；所述IGHG4为氨基酸序列为序列表中序列4所示的蛋白质；所述和CFH为氨基酸序列为序列表中序列5所示的蛋白质。

[0046] 本发明应用iTRAQ标记定量蛋白质组技术，研究肺癌和肺部结节的差异蛋白质，最终发现SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白在肺癌和肺部结节患者的血浆样本中的表达量与健康对照者相比存在显著差异。本发明有助于研究肺癌和肺部结节的生物学本质，对肺癌和肺部结节规范分型，探讨生物学本质有重要意义。

附图说明

[0047] 图1为SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4、CFH这5种特征蛋白质在正常人、肺癌和肺部结节患者中的相对含量变化图。其中，以正常人的表达量为内参，其他组都与正常人组进行比较，看差异变化倍数。

具体实施方式

[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0050] SAA1为氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；所述SERPINA1为氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质；所述CRP为氨基酸序列为序列表中序列3所示的蛋白质；所述IGHG4为氨基酸序列为序列表中序列4所示的蛋白质；所述和CFH为氨基酸序列为序列表中序列5所示的蛋白质。

[0051] 实施例1、肺癌和肺部结节蛋白特征谱的构建

[0052] 一、样本和仪器

[0053] 5例健康成年者血浆样本，5例未经治疗的肺部结节患者血浆样本，5例经手术治疗的肺癌患者血浆样本，5例未经治疗的肺癌患者血浆样本。各参试者均为自愿参与，其健康及疾病状态均有实验室及临床诊断报告确定。所有的血浆样本均在清晨空腹下抽取，采用一次性真空抗凝管，采集外周血3.0ml，4小时内离心(3000r/min，10min，4℃)，吸取上清后分装成各50μl，保存于-80℃低温冰箱中。

[0054] 试验所用仪器设备如下：默克公司生产的去高丰度蛋白的柱子；美国AB Sciex公司生产的iTRAQ试剂盒；waters公司生产的C18反相硅胶吸附脱盐柱；美国AB Sciex公司生产的质谱仪triple tof 5600systems；美国ABI公司生产的ProteinPilot软件(AB SCIEX)。

[0055] 二、蛋白提取

[0056] 将步骤一获得的血浆样本从-80℃冰箱取出后，在4℃自然溶解，然后用默克公司生产的去高丰度蛋白的柱子去除高丰度蛋白质(所述高丰度蛋白主要包括血清白蛋白、免疫球蛋白G)，然后收集第一个峰，流出柱子后蛋白质进行3000Da分子量截留超滤去除洗脱液中的盐，再用丙酮在-20℃沉淀过夜，最后蛋白沉淀再用Lysis裂解液(配方：8.0M脲，50mM NH4HCO3，1×蛋白酶抑制剂)溶解。

[0057] 三、蛋白的酶解及iTRAQ标记

[0058] 将步骤二所得蛋白质样品进行胰蛋白酶消化，之后用美国AB Sciex公司生产的iTRAQ试剂盒进行样本标记。具体操作如下：

[0059] 1、蛋白质定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中，用8M UA将体系定至125μl。

[0060] 2、加入现配的5μl 1M DTT溶液至体系中，混匀后，37℃，1h。

[0061] 3、加入现配的20μl 1M IAA溶液至体系中，混匀后，避光，室温反应1h。

[0062] 4、吸取所有样品加入到10kD超滤管中，12000rpm(不超过14000×g)离心20min，弃掉收集管底部溶液。

[0063] 5、加入100μl UA至超滤管中，12000rpm离心10min，重复2次。

[0064] 6、加入iTRAQ试剂盒中的Dissolution Buffer 100μl，12000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次。

[0065] 7、更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量2-4μg(与蛋白质量比1:50-100)，体积50μl，37℃反应过夜。

[0066] 8、次日，12000rpm离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部。

[0067] 9、再向超滤管中加入50μl Dissolution Buffer，离心并且和上一步的滤液合并。

[0068] 10、从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl有机溶剂(4标试剂为乙醇，8标试剂为异丙醇，保证和样品混合后有机相的比例大于70％)，涡旋振荡，离心至管底。本发明采用4标iTRAQ试剂盒，具体如下：114：健康对照者组；115：未治疗的肺部结节患者组；116：经手术治疗的肺癌患者组；117：未治疗的肺癌患者组。

[0069] 11、取酶解样品的一半蛋白溶液(即100μg)转移到新的离心管中，余下的蛋白冷冻保存备用；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应1h。加入100μl水终止反应。

[0070] 12、为了检测标记效率及定量准确性，从4组样品中各取出1μl混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI鉴定，确认标记反应良好。

[0071] 13、混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用。

[0072] 四、C18柱子脱盐处理

[0073] 将经上述步骤三标记好的混合样本用waters公司生产的C18反相硅胶吸附脱盐柱进行脱盐处理，去除标记过程中带入的标记试剂盒相关的盐成分，以便于后续分析。具体操作如下：

[0074] 1、使用400μg多肽段混合物或者E.coli蛋白抽提物进行分离，检测系统情况。

[0075] 2、将步骤三标记抽干后的样品用150μl流动相A复溶，涡旋振荡，12000rpm离心20min，吸取上清上样；准备48个空白1.5ml离心管，依次标记为1-48，用于收集分离得到的组份1-48；流速0.8ml/min；流动相为由流动相A和流动相B混合而成；流动相A的配方如下：
0.1％甲酸水溶液(％表示体积百分含量)；流动相B的配方如下：0.08％甲酸乙腈水(乙腈:
水＝80:20，v/v，％表示体积百分含量)。分离梯度如下(％表示体积百分含量)：

[0076]

[0077] 3、从第5分钟开始，依次收集每分钟洗脱物到1-48号离心管中，根据出峰时峰强度多少，进行合并，出峰多就多分几管，出峰少就长时间收集一管。真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用。

[0078] 五、二维纳升液相色谱检测及串联质谱检测

[0079] 1、根据紫外监测情况，将步骤四得到的48个组分合并为10个组分，合并时采用30μl“2％ACN，0.1％FA(％表示体积百分含量)”，加入第一个离心管，涡旋振荡并离心后，转入第二个离心管，依次直至合并组份最后一管；每组样品30μl复溶。

[0080] 2、12,000rpm，10min，吸取上清上样；一般吸取20μl。

[0081] 3、上样体积8μl，采取夹心法上样。

[0082] 4、装载泵流速2μl/min，15min。

[0083] 5、流动相为由流动相A和流动相B混合而成；流动相A的配方如下：0.1％甲酸水溶液(％表示体积百分含量)；流动相B的配方如下：0.08％甲酸乙腈水(乙腈:水＝80:20，v/v，％表示体积百分含量)。分离流速0.3μl/min，分离梯度根据组分1-4和5-10稍作调整，具体梯度如下(％表示体积百分含量)：

[0084]

[0085]

[0086] 6、串联质谱检测

[0087] 每份样品经nano高效液相色谱分离后用AB SCIEX TripleTOF 5600质谱仪进行质谱分析。

[0088] 由于iTRAQ试剂是等量的，即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量完全相同，用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子(precursor ion)进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团，不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度，即报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值。同时，多肽内的酰胺键断裂，形成一系列b离子和y离子，得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体。

[0089] 质谱参数设置如下：

[0090] (1)源气参数(根据不同仪器状态进行优化)，以下为建议值：

[0091] Ion spray voltage离子喷射电压：2.3kv

[0092] GS1气帘：4；

[0093] Curtain gas气帘：30或者35；

[0094] (2)TOF MS飞行时间质谱：

[0095] m/z质荷比：350-1250；

[0096] accumulation time累积时间：0.25s。

[0097] (3)Product ion scan离子扫描：

[0098] m/z质荷比：100-1500；

[0099] accumulation time累积时间：0.1s；

[0100] Dynamic exclusion time动态排除时间：25s；

[0101] Rolling CE滚动电子：enabled；

[0102] Adjust CE when using iTRAQ reagent：enabled；

[0103] CES：5。

[0104] 六、proteinpilot软件鉴定分析差异蛋白质

[0105] 采用proteinpilot软件鉴定、分析差异蛋白质。具体如下：导出步骤五获得的ms/ms谱，质谱分析原始数据为RAW文件，并用swissprot human数据库，软件ProteinPilot(AB SCIEX)会对每种蛋白质进行查库鉴定及定量分析(搜库参数如表1所示，结果过滤参数为：Peptide FDR≤0.01)，有一个以上肽段且95％置信度的蛋白进行数据分析，通过软件获得蛋白质id，并根据同一种蛋白质在不同组别中的质谱峰面积获得蛋白质比值，并分析蛋白质生物学功能等信息。

[0106] 表1搜库参数

[0107]

[0108] 七、挑选肺癌和肺部结节的特征蛋白质

[0109] 按照如下挑选肺癌和肺部结节的特征蛋白质：对比健康正常对照组、未治疗的肺部结节组和未治疗的肺癌组，之间进行蛋白质比较，找出肺癌和肺部结节特征表达蛋白质，蛋白质比值大于等于1.5的表明其表达显著上调，蛋白质比值小于等于0.67的表明其差异表达的蛋白质下调。所谓比值为与健康对照者相比的比值。

[0110] 八、结果

[0111] 结果显示：经上述检测分析得到肺癌和肺部结节5种特征蛋白质，分别为SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH。这5种的蛋白的置信度等值和unused protscor值如表2所示。肺癌和肺部结节中这5种特征性蛋白质在各组间的比值如表3所示。SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4、CFH这5种特征蛋白质在正常人、肺癌和肺部结节患者中的相对含量变化图如图1所示。

[0112] 表2肺癌和肺部结节5种特征血清蛋白质的置信度等值和unused protscor值[0113]

[0114] 表3肺癌和肺部结节5种特征性血清蛋白质在各组间的比值

[0115]

[0116] 注：114：正常对照；115：肺部节组织未治疗；116：肺癌组手术治疗；117：肺癌组未治疗。

[0117] 从表3可见，与健康正常对照组相比，未经治疗的肺癌患者组的血浆样本中SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH这5种蛋白均表现为上调(与健康正常对照组的蛋白质比值大于等于1.5)。与健康正常对照组相比，未经治疗的肺部结节患者组的血浆样本中SERPINA1和CRP这2种蛋白均表现为上调(与健康正常对照组的蛋白质比值大于等于1.5)；SAA1、IGHG4和CFH这3种蛋白均表现为下调(与健康正常对照组的蛋白质比值小于等于0.67)。