血清48-lncRNA作为肝脏慢性疾病诊断标记物的应用

摘要

本发明公开了血清48‑lncRNA标记物作为肝脏慢性疾病诊断靶标的应用。发明人抽提了训练组109例血清样本的RNA，进行lncRNA表达谱芯片杂交，通过芯片扫描，数据提取，数据标准化处理后，经过SAM分析，挑选出181个在正常人和病人（包括慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者）之间表达变化倍数大于1.5及p

权利要求

1.用于肝脏慢性疾病诊断的lncRNA标签组，该标签组由AK055007、ASLNC12707、ASLNC17006、ASLNC18330、ASLNC21223、ASLNC21612、AW605175、AW815311、AW995682、BE061397、BE062667、BF326935 、BF336844 、BF363576、BF364158、BF368575 、BF768642 、BF851650 、BF896662 、BF986336 、BG004232、CK327022 、GSO_1539211_047 、GSO_

1539211_123 、GSO_1539211_167 、GSO_1539211_385 、GSO_1539296_151、snaR、XLOC_

000214 、XLOC_001332 、XLOC_001435 、XLOC_001771 、XLOC_003261 、XLOC_004243 、XLOC_005105 、XLOC_006039、XLOC_006476、XLOC_007051 、XLOC_007869 、XLOC_009207 、XLOC_009614、XLOC_010577、XLOC_010632、XLOC_010898、XLOC_011110、XLOC_011486 、XLOC_013095 和XLOC_014362共计48个血清lncRNA组成；

所述肝脏慢性疾病是指原发性肝细胞癌、肝硬化、慢性乙型肝炎。

2.根据权利要求1所述的lncRNA标签组，其特征在于：肝脏慢性疾病的判别公式为通过判别分析构建的Fisher's 判别函数公式。

3.定量血清lncRNA表达量的试剂组在制备肝脏慢性疾病诊断试剂中的应用，其中，定量血清lncRNA表达量的试剂由定量AK055007、ASLNC12707、ASLNC17006、ASLNC18330、ASLNC21223、ASLNC21612、AW605175、AW815311、AW995682、BE061397、BE062667、BF326935 、BF336844 、BF363576、BF364158、BF368575 、BF768642 、BF851650 、BF896662 、BF986336 、BG004232、CK327022 、GSO_1539211_047 、GSO_1539211_123 、GSO_1539211_167 、GSO_

1539211_385 、GSO_1539296_151、snaR、XLOC_000214 、XLOC_001332 、XLOC_001435 、XLOC_001771 、XLOC_003261 、XLOC_004243 、XLOC_005105 、XLOC_006039、XLOC_006476、XLOC_007051 、XLOC_007869 、XLOC_009207 、XLOC_009614、XLOC_010577、XLOC_010632、XLOC_010898、XLOC_011110、XLOC_011486 、XLOC_013095 和XLOC_014362共计48个血清lncRNA的试剂组成；

所述肝脏慢性疾病是指原发性肝细胞癌、肝硬化、慢性乙型肝炎。

说明书

血清48-lncRNA作为肝脏慢性疾病诊断标记物的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种肝脏慢性疾病的诊断靶标，特别是涉及血清lncRNA标志物作为原发性肝细胞癌、肝硬化、慢性乙型肝炎诊断靶标的应用。

背景技术

[0002] 据统计2012年全球有782，500例新发肝癌病例并且有745，500肝癌患者死亡，这些新发和死亡的肝癌患者大约50％发生在中国。研究表明乙肝病毒感染是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要致病因素。全世界超过2.4亿慢性乙型肝炎患者，其中部分将发展成肝癌。在中国，乙肝病毒携带者占总人口数的10％，每年不伴有肝硬化的慢性乙肝患者的肝癌发病率在0.01-1.4％，而伴有肝硬化的慢性乙肝患者的肝癌发病率高达0.9-5.4％，这表明肝硬化是导致肝癌的危险因素。更值得关注的是，肝癌病人发病隐匿毫无症状，当有症状时大多数都已进入晚期，从而失去了手术治愈的机会。由此可见，早期诊断、早期发现和早期治疗是减少肝癌病人死亡、提高生存的最主要的途径。目前，为了早期发现和早期诊断肝癌，推荐的方法是：肝硬化患者最好每半年做一次肝脏B超检查以及验血查甲胎蛋白(AFP)。然而，B超检查有一定的局限性，往往难以确定肿块的性质，而且B超检查结果容易受到检查者经验和分辨率的限制，这些因素都将影响诊断结果的准确性；AFP对肝癌的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后判断等均具有重要价值，但其诊断肝癌的阳性率仅60-70％，其敏感度和特异性均受到限制。所以，找出在肝癌发生发展中起关键作用的生物标记物，根据其在肝癌中的作用和变化开发出新的血清学分子诊断试剂以应用于临床，将提高肝癌早期诊断的灵敏度和特异性，进而将极大地提高肝癌病人的生存时间和生存质量。

[0003] 最近的研究表明，长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)可以作为人类疾病包括癌症的生物标志物。长链非编码RNA是指长度超过200bp的非编码RNA，一般不编码蛋白质，起初人们认为lncRNA是一种无意义的转录副产物，在人体的生命过程中没有特殊的意义，但是随着深入的研究，人们发现lncRNA在人体的很多功能中都发挥了重要的作用，比如转录激活、转录干扰、X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、核内运输等细胞和分子过程中lncRNA都发挥着重要功能。研究显示，lncRNA在人体体液中稳定存在，因此，它们是癌症诊断和预后判断的理想的候选生物标志物。Xie等发现lncRNA-HULC在肝癌患者血浆中高表达，HULC可以作为肝癌诊断的标志物。2015年，Lu等研究表明血清lncRNA-uc003wbd和lncRNA-AF085935在肝癌患者与乙肝患者血清中的表达，和正常对照组相比，均显著增加，提示两者可能是肝癌和慢性乙型肝炎诊断的潜在生物标志物。同年，Tang等利用lncRNA表达谱芯片检测了3例HCC患者和3例正常对照的血浆样本，鉴定出一个3-lncRNA(RP11–160H22.5，XLOC_014172和LOC149086)组成的分子标签，它可以作为肝癌诊断的潜在生物标记物。

[0004] 然而，已经报道的单个或少数几个lncRNA构成的标签对肝脏慢性疾病诊断和鉴别诊断的准确性有限，达不到临床应用的要求。因此，目前临床上急需开发出一种检测结果更为准确的血清lncRNA分子标签。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一组具有更高准确性的用于肝脏慢性疾病诊断的lncRNA分子标签，该分子标签由48-lncRNA组成，可以高准确性地区分正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌四个人群。

[0006] 本发明所采取的技术方案是：

[0007] 用于肝脏慢性疾病诊断的lncRNA标签组，该标签组由AK055007、ASLNC12707、ASLNC17006、ASLNC18330、ASLNC21223、ASLNC21612、AW605175、AW815311、AW995682、BE061397、BE062667、BF326935、BF336844、BF363576、BF364158、BF368575、BF768642、BF851650、BF896662、BF986336、BG004232、CK327022、GSO_1539211_047、GSO_1539211_123、GSO_1539211_167、GSO_1539211_385、GSO_1539296_151、snaR、XLOC_000214、XLOC_001332、XLOC_001435、XLOC_001771、XLOC_003261、XLOC_004243、XLOC_005105、XLOC_006039、XLOC_006476、XLOC_007051、XLOC_007869、XLOC_009207、XLOC_009614、XLOC_010577、XLOC_
010632、XLOC_010898、XLOC_011110、XLOC_011486、XLOC_013095和XLOC_014362共计48个血清lncRNA组成。

[0008] 肝脏慢性疾病选自原发性肝细胞癌、肝硬化、慢性乙型肝炎。

[0009] 肝脏慢性疾病的判别公式为通过判别分析构建的Fisher's判别函数公式。

[0010] 定量血清lncRNA表达量的试剂组在制备肝脏慢性疾病诊断试剂中的应用，其中，定量血清lncRNA表达量的试剂由定量AK055007、ASLNC12707、ASLNC17006、ASLNC18330、ASLNC21223、ASLNC21612、AW605175、AW815311、AW995682、BE061397、BE062667、BF326935、BF336844、BF363576、BF364158、BF368575、BF768642、BF851650、BF896662、BF986336、B、G004232、CK327022、GSO_1539211_047、GSO_1539211_123、GSO_1539211_167、GSO_1539211_385、GSO_1539296_151、snaR、XLOC_000214、XLOC_001332、XLOC_001435、XLOC_001771、XLOC_003261、XLOC_004243、XLOC_005105、XLOC_006039、XLOC_006476、XLOC_007051、XLOC_
007869、XLOC_009207、XLOC_009614、XLOC_010577、XLOC_010632、XLOC_010898、XLOC_
011110、XLOC_011486、XLOC_013095和XLOC_014362共计48个血清lncRNA的试剂组成。

[0011] 本发明的有益效果是：

[0012] 1)48-lncRNA可以很好的区分正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌四种人群；

[0013] 2)在175例样本中，48-lncRNA分子标签诊断肝癌的灵敏度和特异性分别是97.82％和98.45％，与之相对照的，AFP的灵敏度和特异性分别是65.22％和90.7％；

[0014] 3)在13例肝癌直径小于3厘米的患者中，48-lncRNA分子标签诊断小肝癌的正确率是100％，与之相对照的，AFP的正确率只有61.5％。

附图说明

[0015] 图1.48-lncRNA分子标签判别训练组109个样本的二维功能空间聚类图；1：正常；2：慢性乙型肝炎；3：肝硬化；4：肝癌；

[0016] 图2.48-lncRNA分子标签判别训练组109个样本的原始判别结果；

[0017] 图3.48-lncRNA分子标签判别训练组109个样本的交叉验证结果；

[0018] 图4.48-lncRNA分子标签判别验证组66个样本的结果；

[0019] 图5.训练组48-lncRNA分子标签与AFP诊断肝癌的ROC曲线比较图；

[0020] 图6.验证组48-lncRNA分子标签与AFP诊断肝癌的ROC曲线比较图；

[0021] 图7.Real time qRT-PCR验证芯片结果。

具体实施方式

[0022] 发明人首先抽提了训练组109例血清样本(包括23例正常(HC)人、30例慢性乙型肝炎(CHB)患者、30例肝硬化(LC)患者、26例肝癌(HCC)患者)的RNA，进行lncRNA表达谱芯片杂交，通过芯片扫描，数据提取，数据标准化处理后，经过SAM分析，挑选出181个在正常人和病人(包括慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者)之间表达变化倍数大于1.5及p<0.001的lncRNA。接着，发明人采用Fisher判别分析(逐步回归法)对这181个差异表达的lncRNA进行筛选，签定出一组48个lncRNA组成的分子标签，结果显示这个标签可以100％的判别正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌。

[0023] 为了验证此48-lncRNA标签的诊断作用，发明人在训练组进行了一次交叉验证(cross-validation)，同时收集另外66个血清样本组成验证组(包括15例正常人、15例慢性乙型肝炎、16例肝硬化和20例肝癌患者)进行了验证，结果表明，48-lncRNA分子标签的诊断的准确率与训练组原始诊断正常率类似。此外，为了证实芯片数据可靠，使用实时荧光定量RT-PCR(Real time qRT-PCR)对3个lncRNA的表达水平进行检测，结果显示3个lncRNA的表达趋势与芯片结果一致。

[0024] 下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

[0025] 材料和方法

[0026] 1.试验材料

[0027] 本实验所用的正常人和肝癌患者血清来自中山大学附属肿瘤医院，慢性乙型肝炎和肝硬化患者的血清来自广州市第八人民医院。抽提血清RNA的试剂盒购自NorgenBiotek公司。所需的探针、引物由life公司合成。qRT-PCR试剂盒购自Promega公司。所需的Cyanine-5-dUTP购自Enzo Life Sciences。

[0028] 2.实验方法

[0029] 2.1血清RNA抽提纯化

[0030] 血清RNA抽提参照NorgenBiotek说明书。

[0031] 2.2表达谱芯片探针的设计

[0032] 从lncRNA数据库找出lncRNA序列，将序列导入Array Designer 2.0软件，连接网络，设置探针设计参数，让软件自动寻找合适的探针，探针设计好后交由life公司合成，引物采用脱盐纯化。

[0033] 2.3总RNA荧光标记

[0034] RNA荧光标记的原理为通过逆转录将带荧光的dUTP碱基渗入到cDNA中，使逆转录合成的cDNA带上荧光，再与芯片上的探针进行杂交。

[0035] ①在PCR管中加入以下试剂：

[0036] Total RNA约500ng

[0037] 6mer Random primer(5ug/ul)  1ul

[0038] Nuclease-Free Water补至     7.5ul

[0039] ②置PCR仪中70℃、5min，立即放入冰上静置至少2分钟；

[0040] ③再在上述PCR管中依次加入以下试剂：

[0041]

[0042]

[0043] 用枪头小心吸打混匀，瞬间离心将管壁上的液体收集于管底；

[0044] ④置PCR仪中42℃、60min；

[0045] ⑤置PCR仪中70℃、5min灭活酶活性后。

[0046] 2.4纯化荧光染料标记的RNA

[0047] ①取出Micro Bio-Spin 30column柱子，将柱子放入配套的收集管中；

[0048] ②1000Xg，离心2min，弃收集液体；

[0049] ③将柱子倒放入一干净的收集管中；

[0050] ④1000Xg，离心4min收集管中剩余的标记cDNA。

[0051] 2.5表达谱芯片杂交

[0052] ①取25μl标记纯化好的cDNA与等体积的2×杂交液混合；

[0053] ②在杂交盒两侧小孔内各滴加50μl超纯水，将芯片置于杂交盒内；

[0054] ③盖上杂交用盖玻片，将混合好的杂交液从盖玻片的侧面加入；

[0055] ④密封杂交盒，水平置于杂交仪中，46℃，过夜(约16h)；

[0056] ⑤取出杂交盒，芯片置于1×SSC和0.1％SDS中振荡清洗10min；

[0057] ⑥0.5×SSC及0.2×SSC洗1min(各2次)；

[0058] ⑦1000rpm离心1min，甩干芯片。

[0059] 2.6芯片扫描

[0060] ①打开扫描仪电源，开启电脑进入windows界面；

[0061] ②双击进入软件界面，此时SCAN指示灯变绿，说明已准备好扫描；

[0062] ③在软件中点击芯片托架按钮，以使扫描仪上的托架弹出；

[0063] ④将芯片固定于托架上，操作托架进入扫描仪内；

[0064] ⑤选择Preview，50μm分辨率预扫全张芯片；

[0065] ⑥选择合适的扫描强度及分辨率进行正式扫描；

[0066] ⑦保存获得的扫描图像。

[0067] 2.7数据提取

[0068] ①打开genepix 6.0软件；

[0069] ②打开保存的扫描图像；

[0070] ③打开相应的gal文件；

[0071] ④利用程序的自动定位功能进行探针点的定位；

[0072] ⑤手动调整自动定位没有定位准确的探针点；

[0073] ⑥提取数据，保存为.gpr文件。

[0074] 2.8数据去背景和标准化及SAM分析

[0075] 将所有样本的gpr文件导入GPR分析软件，先去除背景值，然后再对数据进行标准化，将标准化后的数据用SAM软件筛选出差异表达的lncRNA。

[0076] 2.9判别分析

[0077] 将筛选出的差异表达的lncRNA导入SPSS 20.0，采用Fisher判别分析方法(逐步回归法)得到Fisher判别函数。

[0078] 2.10ROC曲线

[0079] 将48-lncRNA和AFP判别肝癌的结果导入MedCalc软件，选择统计分析中ROC曲线。

[0080] 2.11实时荧光定量RT-PCR

[0081] ①RNA反转录

[0082] 将RT primer(5μM)稀释为浓度500nM。

[0083] 将试剂放置于冰上融化，分别加入以下试剂：

[0084] Total RNA    200ng

[0085] RT Primer    1μl

[0086] DEPC H2O     补至5μl

[0087] 瞬时离心，70℃孵育10分钟，立即放进冰浴

[0088] 瞬时离心，分别加入以下试剂：

[0089]

[0090] 42℃孵育60分钟

[0091] 70℃孵育10分钟

[0092] 4℃放置，终止反应。

[0093] ②实时定量PCR扩增

[0094] 配置15μl的qPCR反应体系：

[0095]

[0096] 瞬时离心。

[0097] ③PCR扩增反应程序：

[0098] 95℃/10min，然后95℃/15s，60℃/60s，扩增45个循环。

[0099] ④已GAPDH作为内参，以Threshold cycle(CT)法进行表达水平的比较分析，以2-△△Ct方法计算相对定量。

[0100] 实验结果如下：

[0101] 表1.正常人与病人(慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者)之间差异表达的181个lncRNA

[0102]

[0103]

[0104]

[0105]

[0106]

[0107]

[0108] *lncRNA差异表达的倍数在正常人与慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者之间都是显著的，P<0.001；

[0109] #lncRNA在慢性乙型肝炎和/或肝硬化患者中的平均表达值低于正常人；

[0110] 加粗显示的lncRNA是48-lncRNA分子标签中的lncRNA。

[0111] 在训练组样本的23例正常人和30例慢性乙型肝炎、30例肝硬化、26例肝细胞癌血清中，根据训练组109例样本表达谱芯片数据，SAM分析发现与正常人相比，慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌患者中有181个差异表达的lncRNA(筛选标准：FDR＝0；Fold change≥1.5)(表1)。为了有效区分正常人、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌，应用判别分析法对训练组109例样本中的四类人群进行判别分类。采用判别分析，从181个差异表达的lncRNA中筛选出一组由48个lncRNA组成的分子标签构建的四个Fisher's判别函数公式。将训练组
109例每个样本中的48个lncRNA的表达值分别代入4个Fisher's判别函数公式，哪一个判别函数值最大，该样本就属于哪一类人群，如表2和图2所示，48-lncRNA可以100％的准确判别四类人群。

[0112] 表2. 48-lncRNA判别训练组109个样本的原始判别数值

[0113]

[0114]

[0115]

[0116]

[0117] 表3. 48-lncRNA判别训练组109个样本的交叉验证数值

[0118]

[0119]

[0120]

[0121]

[0122] 表4. 48-lncRNA判别验证组66个样本的判别数值

[0123]

[0124]

[0125] 表5. 48-lncRNA分子标签和AFP诊断46例肝癌和129例非肝癌的结果列表[0126]

[0127] 表6.比较48-lncRNA分子标签和AFP诊断肝癌的效率

[0128]

[0129] 结果根据表5的数据计算得到。

[0130] 表7.比较48-lncRNA分子标签和AFP诊断小肝癌的准确性

[0131]

[0132] 使用SPSS 20.0软件中Fisher discriminant analysis(Stepwise discriminant method)筛选出此组48-lncRNA组成的分子标签。

[0133] 图1.48-lncRNA分子标签判别训练组109个样本的二维功能空间聚类图：1：正常；2：慢性乙型肝炎；3：肝硬化；4：肝癌；从图中可以看出，四类人群各自分布集中，各自聚成一类，可被清楚识别，提示48-lncRNA的分子标签可很好地判别四类人群。

[0134] 图2.48-lncRNA分子标签判别训练组109个样本的原始判别结果；结果显示48-lncRNA可以100％的准确判别四类人群。

[0135] 为了验证此48-lncRNA标签的诊断作用，发明人在训练组109中进行了交叉验证(cross-validation)。验证结果如图3所示。图3为48-lncRNA分子标签判别训练组109个样本的交叉验证结果；结果表明，48-lncRNA分子标签诊断的准确率与训练组原始诊断准确率相近。

[0136] 为了验证此48-lncRNA标签的诊断作用，同时收集另外66个血清样本组成了验证组。图4是48-lncRNA分子标签判别验证组66个样本的结果；结果表明，48-lncRNA分子标签诊断的准确率与训练组原始诊断准确率相近。

[0137] 发明人对训练组109例样本进行了ROC曲线分析，训练组48-lncRNA分子标签与AFP诊断肝癌的ROC曲线比较图如图5所示；结果显示48-lncRNA分子标签诊断肝细胞癌的效率显著高于AFP。

[0138] 发明人对验证组66例样本进行了ROC曲线分析，验证组48-lncRNA分子标签与AFP诊断肝癌的ROC曲线比较图如图6所示；结果显示48-lncRNA分子标签诊断肝细胞癌的效率显著高于AFP。

[0139] 为了证实芯片数据，使用qRT-PCR进行验证。从筛选出的181个差异表达的lncRNA中随机挑选3个lncRNA进行验证Real time qRT-PCR验证芯片结果如图7所示。qRT-PCR结果显示lncRNA-XLOC-001771，lncRNA-XLOC-002977，lncRNA-XLOC-011938与芯片数据结果相对应。