一种选择性氧化壳聚糖及其非均相制备方法

摘要

本发明公开了一种选择性氧化壳聚糖及其非均相制备方法，其特征在于：该氧化壳聚糖的制备是将大分子壳聚糖溶解在离子液体中，加入无水乙醇析出离子液体中的壳聚糖，以无水乙醇浸渍和超声波振荡充分置换出沉淀中的离子液体后得到多孔壳聚糖；再将多孔壳聚糖在离子液体中进行润涨，形成一定粘度的半固态凝胶，然后采用浓硝酸‑浓磷酸‑亚硝酸钠体系在离子液体介质中将壳聚糖吡喃糖环中C6位的部分或全部羟基选择性氧化成羧基而获得。本发明方法操作简便，氧化反应速率快，壳聚糖氧化度易于控制，氧化产物易于分离且收率高，所制备的羧基壳聚糖具有良好的抗菌活性和水溶性，且离子液体可回收循环利用，绿色环保。

权利要求

1.一种选择性氧化壳聚糖的非均相制备方法，其特征在于：

所述的选择性氧化壳聚糖是由壳聚糖分子中C6位伯羟基部分或全部被选择性氧化成羧基而得到，结构式如式(1)所示：所述选择性氧化壳聚糖粘均分子量为5～32万，脱乙酰度≥85.2％，C6位羧基度为

0.341～0.778，在水中的溶解度≥15g/100mL；

所述的选择性氧化壳聚糖的非均相制备方法为：

(1)首先将粘均分子量为75～100万、脱乙酰度≥92％的大分子壳聚糖按浴比1:10～20溶解在离子液体中，然后加入体积量为所述离子液体体积2倍的无水乙醇析出壳聚糖沉淀，过滤，过滤后的沉淀浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗1～2h，以充分置换出沉淀中的离子液体，再经过滤、干燥、粉碎、过150目筛网后得到多孔壳聚糖；

(2)将多孔壳聚糖干燥后，按浴比1:8～16于20～45℃下在离子液体中润涨1～8h，形成半固态凝胶；然后加入由浓硝酸和浓磷酸按体积比1:0.5～4构成的混合酸与亚硝酸钠，于室温、避光密闭的持续搅拌条件下非均相氧化反应0.5～6h；

反应结束后，立即向反应液中加入体积为反应液体积2～3倍的无水乙醇终止氧化反应，然后过滤；过滤后的产物浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗3次，每次0.5～1h，然后再经丙酮洗净、过滤、真空干燥和球磨粉碎后，即得到目标产物选择性氧化壳聚糖产物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述多孔壳聚糖的质量与所述混合酸的体积的比为1:2～4.5g/mL；所述亚硝酸钠的质量与所述混合酸的体积的比为

0.005～0.016g/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的离子液体各自独立的选为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-氢-3-甲基咪唑氯盐、1-磺酸丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、甘氨酸盐酸盐或1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述选择性氧化壳聚糖产物收率为

81.25～98.14％。

说明书

一种选择性氧化壳聚糖及其非均相制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种选择性氧化壳聚糖及其非均相制备方法，尤其是涉及采用离子液体溶涨技术，利用混合选择性氧化体系制备高收率羧基壳聚糖的方法，属于功能壳聚糖的改性技术。

背景技术

[0002] 壳聚糖又称脱乙酰甲壳质，化学名(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，是甲壳素脱去乙酰基后的产物，广泛存在于微生物、酵母、蘑菇的细胞壁中及昆虫的表皮、贝壳等软体动物的骨骼内，每年生物合成量约100亿吨，产量仅次于纤维素，是地球上第二大生物资源[Rinaudo  Marguerite.Chitin  and  chitosan:Properties  and applications.Progress in Polymer Science,2006,31:603-632]。壳聚糖具有抗炎、抗过敏、杀菌等功效，对金黄色葡萄球菌、链球菌和白喉、枯草、炭疽、副伤寒及痢疾等杆菌均有很强的抑制作用。由于壳聚糖具有独特的生物活性、优越的生物相容性、反应性及通用性，已广泛用于生物医学、化工、环境、高分子材料、纺织印染、食品、化妆品等领域[Benhabiles S,Salah R,Lounici H,et al.Antibacterial activity of chitin,chitosan and its oligomers prepared from shrimp shell waste.Food Hydrocolloids,2012,29(1):48-
56；Morimoto M,Saimoto H,Shigemasa Y.Control of functions of chitin and chitosan by chemical modifications.Trends in Glycoscience&Glycotechnology,
2002,14:205-222]。

[0003] 壳聚糖分子中存在活泼的羟基、氨基、吡喃环、氧桥等基团，在一定条件下，可发生烷基化、磺化、硝化、卤化、酰基化、氧化还原、缩合、络合等化学反应，而这些反应的关键是壳聚糖的溶解。但壳聚糖分子内和分子间极强的氢键作用使其难溶于水、碱及多数有机溶剂中，只能溶于醋酸、盐酸、多元羧酸等酸性溶液，极大限制了壳聚糖的应用,且这些酸具有易挥发、难回收、腐蚀性强、污染环境等缺点，难以符合绿色环保要求[Yoo S H,Lee J S,Park S V,et al.Effects of selective oxidation of chitosan on physical and biological properties.International Journal of Biological Macromolecules,2005,35:27-31]。因此，寻找能够高效直接溶解壳聚糖的绿色溶剂仍是壳聚糖化学改性研究中亟待解决的难题。

[0004] 近年来，离子液体作为一种新型的绿色溶剂体系，因其稳定的物理和化学性质、无毒无污染、不挥发、溶解性强、易与产物分离、易回收及可循环使用等优点，在化学合成、生物催化、萃取分离和生物质溶解等领域被视为传统挥发性溶剂的理想替代品，为天然壳聚糖的溶解与应用开辟了新途径。采用1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(BmimCl)离子液体和1-氢-3-甲基咪唑氯盐(HmimCl)离子液体按9:1的质量比混合来溶解壳聚糖，90℃下4h可溶解3％的壳聚糖。1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐(BmimAc)离子液体在110℃时溶解壳聚糖或甲壳素可达3～6％。氨基酸离子液体[Gly]Cl在常温常压下溶解壳聚糖达到6.32％，且溶解再生的壳聚糖没有衍生化，离子液体可作为壳聚糖的直接良溶剂[Xie H B,Zhang S B,Li S H.Chitin and chitosan dissolved in ionic liquids as reversible sorbents of CO2.Green Chemistry,2006,8:630-633；梁升,纪欢欢,李露,等.氨基酸离子液体对壳聚糖溶解性能的影响.高分子材料科学与工程,2010,26(2):70-72]。

[0005] C6位选择性氧化壳聚糖是壳聚糖衍生物的一种，具有良好的生物相容、生物降解、水溶性、反应性、环境友好和无毒等特性，已被广泛应用。目前，已有研究者使用N2O4气体在CCl4中对壳聚糖进行C6位选择性氧化，制备单羧基壳聚糖，但氧化羧基度低[Whistler R L,Kosik M.Anticoagulant activity of oxidized and N-and O-sulfated chitosan.Archives of Biochemistry and Biophysics,1971,142(1):106-110]；利用气态NO2在稀无机酸或有机酸溶液中选择性氧化壳聚糖，获得6-羧基壳聚糖氧化度提高，但NO2气体与溶液中游离水反应生成硝酸使壳聚糖氧化降解较严重[杨越冬,于九皋,周永国,等.6-羧基壳聚糖的制备及血液相容性研究.中国生物医学工程学报,2007,26(4):605-609；中国发明专利公开号:CN1425695A、CN101230109A]。运用浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠体系选择性氧化溶解在稀乙酸中的壳聚糖，得到较高氧化度的壳聚糖，但硝酸水溶液氧化降解壳聚糖，导致氧化产物收率少(≤69.3％)[中国发明专利公开号:CN105061637A]。采用TEMPO-NaClO-NaBr体系在水中选择性氧化壳聚糖，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH为10.8左右，制得羧基度较高的水溶性羧基壳聚糖，但氧化产物收率很低[Nicolas B,Stephane G,et al.Advances on selective C-6oxidation of chitosan by TEMPO.Biomacromolecules,
2008,9(9):2377-2382]。由于壳聚糖是一种易结晶的天然高聚物，分子间存在强烈的氢键作用，反应过程中氧化剂很难进入壳聚糖内部，多数反应只能在聚合物表面无定形区进行，导致氧化反应时间长、壳聚糖氧化度低，且氧化中释放出的大量水分子易使酸性氧化剂降解壳聚糖，羧基壳聚糖产物收率少；同时，用于溶解壳聚糖的无机酸和有机酸存在易挥发、难回收和环境污染等问题。因此，探究绿色环保、高收率的选择性氧化壳聚糖制备的新方法具有重要意义。

[0006] 本发明将大分子壳聚糖溶于离子液体后再用无水乙醇析出，以无水乙醇浸泡并超声波振荡充分置换出沉淀中的离子液体，由于乙醇的挥发性强、表面张力小，在干燥时乙醇挥发的过程中可以减弱壳聚糖分子间的氢键力，使壳聚糖结晶度降低，内部结构变得疏松，在壳聚糖中形成较蓬松的孔隙。当多孔壳聚糖在离子液体介质中与浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠体系进行非均相氧化反应时，壳聚糖与离子液体界面间的亲润性好，壳聚糖易发生润涨，有利于氧化剂渗透进入多孔壳聚糖颗粒的内部而增加反应的可及度；且离子液体介质中没有水，氧化反应中产生的游离水还能被离子液体吸收，大大降低了硝酸水溶液对壳聚糖的氧化降解副反应，因此产物的氧化度和收率均有很大的提高。此外，浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠氧化体系反应条件温和、氧化选择性高、催化反应速度较快，能制备高收率和氧化度的羧基壳聚糖产物；C6位选择性氧化壳聚糖为两性多糖，分子链中同时含有羧基(-COOH)和氨基(-NH2)，其大分子结构及性质与蛋白质相似，具有优异的生物相容性、水溶性和抗菌性。本发明涉及的C6位非均相选择性氧化壳聚糖的制备方法未见任何报道。

发明内容

[0007] 鉴于现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种选择性氧化壳聚糖及其非均相制备方法。所述的选择性氧化壳聚糖是以大分子壳聚糖为原料，将壳聚糖溶于离子液体后用无水乙醇析出，再用无水乙醇浸渍和超声波振荡充分置换出沉淀中的离子液体后制得多孔壳聚糖；利用离子液体润涨多孔壳聚糖形成一定粘度的半固态凝胶，然后使用浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠体系在离子液体介质中选择性氧化壳聚糖C6位的羟基得到。采用离子液体润涨多孔壳聚糖，增加了氧化剂分子渗入到壳聚糖内部进行氧化反应的可及性，且离子液体介质中的非均相氧化不含水，反应中产生的游离水还能被离子液体吸收，减少了硝酸水溶液而引起的壳聚糖氧化降解，很大程度上提高了C6位氧化壳聚糖的羧基度和产物收率。与普通壳聚糖相比，C6位选择性氧化壳聚糖具有水溶性好、抗菌活性高、生物相容性高等优点，且作为反应介质的离子液体能被回收并重复利用，对环境污染小。

[0008] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

[0009] 一种选择性氧化壳聚糖，其是由壳聚糖分子中C6位伯羟基部分或全部被选择性氧化成羧基而得到，其结构式如式(1)所示：

[0010]

[0011] 所述选择性氧化壳聚糖粘均分子量为5～32万，脱乙酰度≥85.2％，C6位羧基度为0.341～0.778，在水中的溶解度≥15g/100mL。

[0012] 如图1所示，上述的非均相选择性氧化壳聚糖的制备方法为：

[0013] (1)首先将粘均分子量为75～100万、脱乙酰度≥92％的大分子壳聚糖按浴比1:10～20溶解在离子液体中，然后加入体积量为所述离子液体体积2倍的无水乙醇析出壳聚糖沉淀，过滤，过滤后的沉淀浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗1～2h，以充分置换出沉淀中的离子液体，再经过滤、干燥、粉碎、过150目筛网后得到多孔壳聚糖；

[0014] (2)将多孔壳聚糖干燥后，按浴比1:8～16于20～45℃下在离子液体中润涨1～8h，形成半固态凝胶；然后加入由浓硝酸和浓磷酸按体积比1:0.5～4构成的混合酸与亚硝酸钠，于室温、避光密闭的持续搅拌条件下非均相氧化反应0.5～6h；

[0015] 反应结束后，立即向反应液中加入体积为反应液体积2～3倍的无水乙醇终止氧化反应，然后过滤；过滤后的产物浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗3次，每次0.5～1h，然后再经丙酮洗净、过滤、真空干燥和球磨粉碎后，即得到选择性氧化壳聚糖产物。

[0016] 步骤(2)中，所述多孔壳聚糖的质量与所述混合酸的体积的比为1:2～4.5g/mL；所述亚硝酸钠的质量与所述混合酸的体积的比为0.005～0.016g/mL。

[0017] 通过优化氧化反应的时间、混合酸的体积比、亚硝酸钠质量与混合酸体积的比例，以及所加入混合酸体积与多孔壳聚糖质量的比例，可以获得一系列不同羧基度的高收率氧化壳聚糖产物。

[0018] 本发明所述的浴比是壳聚糖质量(g)与离子液体体积(mL)的比值。

[0019] 本发明步骤(1)和步骤(2)中所述的离子液体各自独立的选为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-氢-3-甲基咪唑氯盐、1-磺酸丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、甘氨酸盐酸盐或1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。

[0020] 通过本发明的制备方法，所述选择性氧化壳聚糖产物收率为81.25～98.14％。

[0021] 与现有技术相比，本发明有益效果体现在：

[0022] 1、本发明使用浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠氧化体系，HNO3是氧化剂、NaNO2为氧化反应的引发剂、H3PO4是反应催化剂，由于H3PO4是弱酸，对壳聚糖氧化降解作用弱；因而该体系氧化选择性高，反应条件温和，催化反应速度快且易于控制，氧化剂用量少，能制备高收率和羧基度的氧化产物，羧基壳聚糖产物的水溶性更高。

[0023] 2、本发明将大分子壳聚糖溶于离子液体后再用无水乙醇析出，以无水乙醇浸泡并超声波振荡充分置换出沉淀中的离子液体，由于乙醇的挥发性强、表面张力小，在干燥时乙醇挥发的过程中可以减弱壳聚糖分子间的氢键力，使壳聚糖结晶度降低，内部结构变得疏松，在壳聚糖中形成较蓬松的孔隙。当多孔壳聚糖在离子液体介质中与浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠体系进行非均相氧化反应时，壳聚糖与离子液体界面间的亲润性好，壳聚糖易发生润涨，有利于氧化剂渗透进入多孔壳聚糖颗粒的内部而增加反应的可及度；且离子液体介质中不含水，氧化反应中产生的游离水还能被离子液体吸收，大大降低了硝酸水溶液对壳聚糖的氧化降解副反应，因此产物的氧化度和收率均有很大的提高。

[0024] 3、本发明选择性氧化壳聚糖C6位伯羟基为羧基，不影响壳聚糖环骨架和壳聚糖作为碱性多糖的特性，且氧化壳聚糖C6位的羧基在空间构象上可自由旋转，空间位阻小，使羧基壳聚糖的化学活性高。羧基壳聚糖环中的氨基可被羧基质子化而带有正电荷(-NH3+)，使氧化壳聚糖获得高效耐久、可再生的抗菌活性，利用浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠体系非均相选择性氧化技术可根据需要控制壳聚糖吡喃糖环中C6位的羧基含量，制得不同水溶性和抗菌性的羧基壳聚糖。C6位选择性氧化壳聚糖为两性多糖，分子链中同时含有羧基(-COOH)和氨基(-NH2)，其大分子结构及性质与蛋白质相似，具有优异的生物相容性、生物降解性，其刺激性、过敏性、慢性毒性、亚急性毒性和急性毒性通过实验证明是合格的，可以安全使用。因此羧基壳聚糖可作为一种水溶性绿色抗菌剂被广泛应用。

[0025] 4、本发明采用离子液体作为溶剂和氧化反应介质，离子液体性质稳定、无毒无污染、无蒸发压不挥发、易与产物分离。多孔壳聚糖在离子液体中发生润涨形成半固态凝胶，经浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠体系氧化后，加入无水乙醇可使氧化壳聚糖与离子液体瞬间发生相分离，羧基壳聚糖产物形成沉淀而易于过滤分离。过滤后的离子液体在高温下烘燥除去无水乙醇，然后又可以作为壳聚糖的溶剂和多孔壳聚糖的氧化反应介质，具有回收重复利用和绿色环保等优势。

附图说明

[0026] 图1是本发明选择性氧化壳聚糖的非均相制备路线图；

[0027] 图2是本发明测试项1中多孔壳聚糖和氧化壳聚糖样品的扫描电镜图；

[0028] 图3是本发明测试项2中非均相选择性氧化壳聚糖的红外光谱图。

具体实施方式

[0029] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，以下所述的参考实施例仅用于解释说明的目的，但不以任何形式限制本发明。

[0030] 一、非均相选择性氧化壳聚糖的制备

[0031] 实施例1

[0032] 称取4.0g粘均分子量为100万、脱乙酰度为92％的壳聚糖按浴比1:15(w/v)于90℃搅拌2h，溶解在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐中，冷却至室温后加入120mL无水乙醇析出壳聚糖沉淀，过滤后的壳聚糖沉淀浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗1h，然后过滤、干燥、粉碎、过150目筛网后制得多孔壳聚糖粉末；

[0033] 将干燥的多孔壳聚糖于40℃下在40mL离子液体1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐中润涨3h，形成一定粘度的半固态凝胶；然后加入15mL由浓硝酸和浓磷酸构成的混合酸(V浓硝酸:
V浓磷酸＝1:1)和与混合酸的质量体积比为0.007g/mL的亚硝酸钠，于避光密闭容器中，在室温下持续搅拌反应2h。反应结束后立即加入165mL无水乙醇终止氧化反应，然后过滤；过滤后的产物浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗3次，每次30min，然后经丙酮洗净、过滤、真空干燥和球磨粉碎后，得到粘均分子量为27万、羧基度为37.86％的浅黄色氧化壳聚糖，4℃保存备用。经测试，本实施例所得氧化壳聚糖的脱乙酰度为88.7％，在水中的溶解度为15.8g/
100mL，等电点时的pH为5.6左右，氧化壳聚糖产物收率为95.34％。

[0034] 实施例2

[0035] 称取4.0g粘均分子量为100万、脱乙酰度为92％的壳聚糖按浴比1:15(w/v)于90℃搅拌2h，溶解在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐中，冷却至室温后加入120mL无水乙醇析出壳聚糖沉淀，过滤后的壳聚糖沉淀浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗1h，然后过滤、干燥、粉碎、过150目筛网后制得多孔壳聚糖粉末；

[0036] 将干燥的多孔壳聚糖于40℃下在40mL离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐中润涨5h，形成一定粘度的半固态凝胶；然后加入15mL由浓硝酸和浓磷酸构成的混合酸(V浓硝酸:
V浓磷酸＝2:1)和与混合酸的质量体积比为0.014g/mL的亚硝酸钠，于避光密闭容器中，在室温下持续搅拌反应3h。反应结束后立即加入165mL无水乙醇终止氧化反应，然后过滤；过滤后的产物浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗3次，每次30min，然后经丙酮洗净、过滤、真空干燥和球磨粉碎后，得到粘均分子量为11万、羧基度为52.38％的深黄色氧化壳聚糖，4℃保存备用。经测试，本实施例所得氧化壳聚糖的脱乙酰度为90.5％，在水中的溶解度为18.2g/
100mL，等电点时的pH为5.1左右，氧化壳聚糖产物收率为89.62％。

[0037] 实施例3

[0038] 称取4.0g粘均分子量为100万、脱乙酰度为92％的壳聚糖按浴比1:15(w/v)于90℃搅拌4h溶解在离子液体1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐中，冷却至室温后加入120mL无水乙醇析出壳聚糖沉淀，过滤后的壳聚糖沉淀浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗1h，然后过滤、干燥、粉碎、过150目筛网后制得多孔壳聚糖粉末；将干燥的多孔壳聚糖于40℃下在40mL离子液体1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐中润涨3h形成一定粘度的半固态凝胶，然后加入15mL由浓硝酸和浓磷酸构成的混合酸(V浓硝酸:V浓磷酸＝2:1)和与混合酸的质量体积比为0.014g/mL的亚硝酸钠于避光密闭容器中，在室温下持续搅拌反应6h，反应结束后立即加入165mL无水乙醇终止氧化反应，然后过滤；过滤后的产物浸渍在无水乙醇中超声波振荡清洗3次，每次30min，然后经丙酮洗净、过滤、真空干燥和球磨粉碎后，得到粘均分子量为6.3万、羧基度为
77.14％的深黄色氧化壳聚糖，4℃保存备用。经测试，本实施例所得氧化壳聚糖的脱乙酰度为86.4％，在水中的溶解度为21.3g/100mL，等电点时的pH为4.9左右，氧化壳聚糖产物收率为81.56％。

[0039] 二、对上述实施例所得样品进行检测试验

[0040] 测试项1：选择性氧化前后的壳聚糖扫描电镜分析

[0041] 运用扫描电镜(6000×)观察多孔壳聚糖和非均相选择性氧化壳聚糖的表面形貌情况。取壳聚糖样品4份，第1份为不做任何氧化处理的空白样品(粘均分子量100万的大分子壳聚糖)，第2份为将大分子壳聚糖溶解于离子液体中再用无水乙醇析出所获得的多孔壳聚糖，第3份为按实施例1的方法对多孔壳聚糖进行非均相选择性氧化所获得的羧基度37.86％的氧化壳聚糖，第4份按实施例3的方法对多孔壳聚糖进行非均相选择性氧化所获得的羧基度77.14％的氧化壳聚糖，测试结果依次参见图2(a)～(d)。

[0042] 由图2显示，空白样品大分子壳聚糖(a)是单斜晶的β-壳聚糖，每单位晶胞内含一根分子链的二糖重复单元，其分子链平行排列而形成的微纤结构清晰可见。而多孔壳聚糖样品(b)是先将大分子壳聚糖溶于离子液体后再用无水乙醇析出，以无水乙醇充分置换出壳聚糖沉淀中的离子液体，由于乙醇的挥发性强，在乙醇挥发干燥的过程中可以减弱壳聚糖分子间形成氢键作用，使壳聚糖的结晶度降低，样品内部形成蓬松的孔隙，因此，当多孔壳聚糖润涨在离子液体中与HNO3/H3PO4-NaNO2体系进行非均相氧化反应时，氧化剂容易渗透到壳聚糖颗粒的内部而增加氧化反应的可及度，有利于提高壳聚糖的氧化度。多孔壳聚糖在离子液体中润涨再经非均相选择性氧化后，氧化壳聚糖分子中生成羧基，可与分子内的氨基、羟基等极性基团形成内盐键及分子内氢键，使氧化壳聚糖分子在溶液中成卷曲状，从乙醇中析出时不再形成微纤结构，而是以球状晶体析出(图2c和d)。

[0043] 测试项2：壳聚糖的均相与非均相选择性氧化对比分析

[0044] 取粘均分子量为100万、脱乙酰度为92％的壳聚糖分别按照中国发明专利[公开号：CN105061637A]所述方法进行壳聚糖的均相选择性氧化与实施例1～3的方法进行壳聚糖的非均相选择性氧化，对均相和非均相选择性氧化壳聚糖在不同反应时间的羧基度及产物收率进行测试，测试结果参见表1。

[0045] 由表1所示的测试数据分析后可以看到，均相选择性氧化得到的羧基壳聚糖氧化度及产物收率都很低，而将本发明离子液体润涨多孔壳聚糖应用于制备非均相选择性氧化壳聚糖，氧化壳聚糖的羧基度和产物收率均有很大程度的提高；与壳聚糖在稀乙酸溶液中的均相选择性氧化相比，HNO3/H3PO4-NaNO2体系在离子液体中非均相选择性氧化壳聚糖是制备高收率和氧化度羧基壳聚糖的有效方法，且离子液体可回收重复利用和绿色环保。

[0046] 表1壳聚糖的均相和非均相选择性氧化性能分析

[0047]

[0048]

[0049] 测试项3：羧基壳聚糖的红外光谱表征

[0050] 采用红外光谱分析羧基壳聚糖中的分子基团情况。取壳聚糖4份，第1份为不做任何氧化处理的壳聚糖样品A(粘均分子量为100万、脱乙酰度为92％的壳聚糖)，第2份为按中国发明专利[公开号：CN105061637A]所述方法进行均相选择性氧化6h的羧基壳聚糖B，第3份为按实施例2的方法进行非均相选择性氧化3h的羧基壳聚糖C，第4份为按实施例3的方法进行非均相选择性氧化6h的羧基壳聚糖D，测试结果参见图3。

[0051] 从图3可见，原壳聚糖的红外曲线中的O-H伸缩和N-H伸缩振动在3424.3cm-1处出现一个强而宽的吸收峰。壳聚糖中残余的乙酰基在1653.9cm-1处有一酰胺I的吸收带；1600.8cm-1是-NH2的弯曲振动峰；1410.1cm-1处的吸收峰是-CH3和-CH2的C-H变形振动所致；
-1 -1 -1
1070.9cm 处和1028.2cm 处分别为仲羟基和伯羟基的C-O伸缩振动吸收带；位于895.6cm是β-吡喃糖苷键的伸缩振动吸收峰。而非均相氧化壳聚糖的红外光谱中在1732.6cm-1处出现了明显的羧基C＝O伸缩振动峰，且峰值强度随氧化壳聚糖的羧基度提高而显著增强(图
3C和D)；羧基中-OH的面内弯曲振动吸收与-COO-对称伸缩振动吸收重叠在1380.1cm-1处显示出一个强而宽的吸收带；同时1028.2cm-1处的伯羟基C-O伸缩吸收峰强度比原壳聚糖中的峰值显著减弱；在895.6cm-1处的β-吡喃糖苷键的伸缩振动吸收带和其它吸收峰位置基本无变化。此外，由于多孔壳聚糖在离子液体中润涨后进行非均相氧化反应，羧基壳聚糖红外曲线中在2067.3cm-1处出现较强的CO2吸收峰，且-COO-反对称伸缩振动吸收出现在1532.3cm-1附近。以上红外分析说明壳聚糖分子在保持其链结构基本不变的条件下，非均相选择性氧化的壳聚糖分子中葡萄糖单元基环上的C6位伯羟基被氧化成羧基。

[0052] 从均相法和非均相法氧化相同时间制备的羧基壳聚糖的红外谱图比较(图3B和D)可看出，非均相氧化法制备的羧基壳聚糖(图3D)在1733.8cm-1处羧基C＝O伸缩振动吸收峰、1632.4cm-1处羧基C-O缩振动吸收峰以及1380.1cm-1处羧基中-OH的弯曲振动吸收峰明显强于均相氧化法制备的羧基壳聚糖(图3B)，这也表明非均相选择性氧化法制备的羧基壳聚糖的氧化度明显高于均相选择性氧化法。

[0053] 综上所述，将大分子壳聚糖溶解在离子液体中，加入无水乙醇析出壳聚糖并置换出沉淀中的离子液体后得到多孔壳聚糖，然后采用浓硝酸-浓磷酸-亚硝酸钠体系在离子液体介质非均相选择性氧化润涨后的多孔壳聚糖，制备出产物收率高、水溶性好、氧化度高的羧基壳聚糖。本发明采用的非均相氧化反应速率快，操作简便，成本低廉，壳聚糖氧化度易于控制，氧化产物易于分离且收率高，离子液体可回收循环利用，绿色环保。所制备的C6位选择性氧化壳聚糖为两性多糖，分子链中同时含有羧基(-COOH)和氨基(-NH2)，其大分子结构及性质与蛋白质相似，具有优异的生物相容性，生物降解性，无刺激性，无毒性，且羧基壳聚糖化学活性高、水溶性好、杀菌性能优异，因此C6位选择性氧化壳聚糖在生物、医学、化工、抗菌材料、食品、包装等领域的应用潜力巨大。

[0054] 以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。