基因工程改造的耐热人溶菌酶

摘要

本发明公开了一种基因工程改造的耐热人溶菌酶；包括R41H和A92L两个氨基酸位点的突变:其中R41H可以提高人溶菌酶的耐热性，A92L提高了对变性剂的耐受度，而且R41H和A92L组合以后不仅可以更大幅度的提高人溶菌酶的耐热性，而且能够提高人溶菌酶对变性剂的耐受度；将本发明还公开了一种基因工程改造的耐热人溶菌酶在高温造粒型饲料制备中的应用，所述的基因工程改造的耐热人溶菌酶的耐热性相对来说要高于一般的酶，在温度80‑85℃的高温造粒过程中，在至少前8‑30min内的活性能够维持在50％以上；本发明还公开了一种基因工程改造的耐热人溶菌酶在食品保鲜中的应用，以耐热人溶菌酶为主要活性成分的保鲜剂，用于水产或肉制品的保鲜，可以延长低温肉制品的保质期一倍以上。

权利要求

1.一种基因工程改造的耐热人溶菌酶，其中，所述耐热人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码基因工程改造的耐热人溶菌酶的基因HLM，其特征在于，编码所述耐热人溶菌酶的基因HLM的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种含有如权利要求2所述的耐热人溶菌酶的基因HLM的真核表达载体pPicZαA-HLM。

4.一种如权利要求1所述的耐热人溶菌酶在高温造粒型饲料制备中的应用，其特征在于，高温造粒过程的温度为85℃。

5.一种如权利要求1所述的耐热人溶菌酶在食品保鲜中的应用，其特征在于，在巴氏灭菌前向奶制品中添加所述耐热人溶菌酶，所述耐热人溶菌酶的添加量为所述奶制品的质量百分含量的1%-3%。

6.一种如权利要求1所述的耐热人溶菌酶在食品保鲜中的应用，其特征在于，向加热煮制前的果蔬中添加所述耐热人溶菌酶，所述耐热人溶菌酶的添加量为所述果蔬的质量百分含量的1%-3%。

说明书

基因工程改造的耐热人溶菌酶

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，更具体地说，本发明涉及一种基因工程改造的耐热人溶菌酶。

背景技术

[0002] 来源于人体的溶菌酶是一种由人体产生的，对芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰阳性菌都有抗菌作用的酶，由130个氨基酸组成，动物原的溶菌酶在结构和功能上有较强的保守性，作用机理都是可以破坏细菌细胞壁的主要结构：N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键，进而杀死细菌。由于革兰氏阳性致病菌的细胞壁主要结构由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸组成，而革兰氏阴性菌细胞壁在这两种物质组成的细胞壁之外，还有一层脂多糖的结构，因此溶菌酶对革兰氏阳性菌有很强的杀灭作用，对于革兰氏阴性菌也有较强的抑制作用。

[0003] 目前应用最广的溶菌酶为鸡蛋清溶菌酶，它在蛋清中含量丰富，抑菌功能显著，还具有易于提取，生产成本低等优点。但是蛋清溶菌酶的热稳定性和对变性剂的耐受性较差，而在饲料造粒等生产过程中，往往要有高温造粒的步骤，所以蛋清溶菌酶作为饲料添加剂等生产过程中涉及高温造粒或者喷雾干燥等工艺的应用受到了很大的限制。而且鸡蛋清溶菌酶的单位活性只有人溶菌酶的三分之一。

[0004] 虽然人溶菌酶相对于其他溶菌酶对于高温和变性剂的耐受性相对较好，但是仍然不能完全满足饲料添加造粒等严苛工艺，造粒过程通常采用80摄氏度以上的高温，在此温度下，绝大多数蛋白质和酶都会因为高温变性而失活。溶菌酶的耐热性相对来说要好于一般的酶，先前文献报导人溶菌酶可以在一定时间内耐受70-75℃的高温，但是这对很多温度高于80℃的工业后处理显然还不够，因此构建筛选更加耐热和耐变性剂的新型重组溶菌酶具有重要的应用价值和广阔的市场前景。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

[0006] 本发明的另一个目的是提供一种耐热人溶菌酶，其耐热性和耐变性剂能力比野生型明显提高，所述耐热人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；

[0007] 本发明还有一个目的是提供一种编码所述耐热人溶菌酶的基因HLM，所述基因HLM的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示；

[0008] 本发明还有一个目的是提供一种耐热人溶菌酶的应用，所述耐热人溶菌酶应用于养殖业，具有多方面优益效果，特别是作为饲料添加剂在80℃以上的高温造粒过程中能够保持较高的活性；用于食品保鲜，不仅具有高效的抑菌性能而且对人体安全性高。

[0009] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基因工程改造的耐热人溶菌酶，其中，所述耐热人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

[0010] 一种编码所述的基因工程改造的耐热人溶菌酶的基因HLM，其中，编码所述耐热人溶菌酶的基因HLM的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

[0011] 一种含有所述的耐热人溶菌酶的基因HLM的真核表达载体pPicZαA-HLM。

[0012] 一种所述的耐热人溶菌酶在饲料制备中的应用，其中，所述耐热人溶菌酶在饲料中的添加量为1-10万IU/kg。

[0013] 一种所述的耐热人溶菌酶在高温造粒型饲料制备中的应用。

[0014] 优选的是，高温造粒过程的温度为80-85℃，高温造粒过程的时间为8-30min，高温造粒过程后，颗粒饲料中耐热人溶菌酶的活性大于50%。

[0015] 一种所述的耐热人溶菌酶在食品保鲜中的应用。

[0016] 优选的是，在巴氏灭菌前向奶制品中添加所述耐热人溶菌酶，所述耐热人溶菌酶的添加量为所述奶制品的质量百分含量的1%-3%。

[0017] 优选的是，在包装前向新鲜果蔬中添加所述耐热人溶菌酶，所述耐热人溶菌酶的添加量为所述新鲜果蔬的质量百分含量的0.1%-0.3%；

[0018] 或，向加热煮制前的果蔬中添加所述耐热人溶菌酶，所述耐热人溶菌酶的添加量为所述果蔬的质量百分含量的1%-3%。

[0019] 一种应用所述的耐热人溶菌酶制备获得的保鲜剂，其中，所述保鲜剂采用喷雾法或浸渍法用于水产品或肉制品的保鲜，所述保鲜剂中的所述耐热人溶菌酶的使用的质量百分比浓度为1%-3%。

[0020] 本发明至少包括以下有益效果：

[0021] 本发明通过基因工程改造的方法得到一种耐热性和耐变性剂能力比野生型明显提高的耐热人溶菌酶；筛选得到了人溶菌酶两个位点的突变: R41H和A92L。R41H可以提高人溶菌酶的耐热性，A92L提高了对变性剂的耐受度，而且R41H和A92L组合以后不仅使人溶菌酶的耐热性得到了实质性的提高，而且能够提高人溶菌酶对变性剂的耐受度；本发明对于将人溶菌酶用于高温的工业环境，或作为饲料添加剂的高温造粒中活性的保持有积极作用；将本发明所述的耐热人溶菌酶添加到饲料中，可以有效地抑制饲料中有害菌的繁殖，能防止饲料在运输储存过程中发生变质；本发明所述的基因工程改造的耐热人溶菌酶的耐热性相对来说要高于一般的酶，在温度80-85℃的高温造粒过程中，在至少前8-30min内的活性能够维持在50%以上；所述的耐热人溶菌酶可以有效延长奶制品的保存时间，并且在饮用后可以对人体产生保护作用；应用所述的耐热人溶菌酶制备获得的保鲜剂，用于水产或肉制品的保鲜，可以延长低温肉制品的保质期一倍以上；本发明所述的基因工程改造的耐热人溶菌酶不仅对致病菌具有较强的杀灭和抑制作用，同时具有广谱抗菌的优点，由于抑菌的高效性和对人体的安全性高，适合于各种食品的防腐。

[0022] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

[0023] 图1为本发明所述的基因工程改造方法中正确携带HLM基因的pPicZαA质粒图谱；

[0024] 图2为本发明所述的溶菌酶的相对保守的三级结构示意图；

[0025] 图3为本发明所述的纯化的耐热人溶菌酶的SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果示意图；

[0026] 图4为本发明所述基因工程改造的各突变型人溶菌酶和野生型溶菌酶的耐热性温度T50的比较结果示意图。

具体实施方式

[0027] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

[0028] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

[0029] 本发明所涉及到的术语除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

[0030] 术语“信号肽”意指一个短的肽 (通常16-30 氨基酸长)，位于新合成的分泌蛋白质的N -端，这些蛋白质包括那些最终定位于胞外或者某些细胞器之内 ( 内质网，高尔基体或体 ) 的从细胞内分泌的蛋白。信号肽在将目的蛋白转运到细胞器或者胞外后，将被特异性的酶切除，从而获得成熟的蛋白质。

[0031] 术语“PCR”意指聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方。聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

[0032] 术语“引物”意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。除非特定限制，否则上游引物为在DNA复制时，作为DNA模板3’端的复制起始点的引物，下游引物为在DNA复制时，作为DNA模板5’端的复制起始点的引物。

[0033] 术语“缓冲液”意指一类当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化作用的溶液。

[0034] 术语“NAD+”意指氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化型辅酶I，是一种具有传递电子 (更准确来说，是传递氢离子)功能的小分子有机物，是脱氢酶的辅酶。

[0035] 术语“辅酶”意指对于特定酶的活性发挥所必需的一类可以将化学基团从一个酶转移到另一个酶上的有机小分子，例如一些B族维生素。

[0036] 如图1-图4所示，本发明提供一种基因工程改造的耐热人溶菌酶，其中，所述耐热人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

[0037] 一种编码所述的基因工程改造的耐热人溶菌酶的基因HLM，其中，编码所述耐热人溶菌酶的基因HLM的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

[0038] 在上述方案中，所述的基因工程改造的耐热人溶菌酶包括两个氨基酸位点的突变，分别为R41H和A92L，其中，R41H可以提高人溶菌酶的耐热性，A92L提高了对变性剂的耐受度，而且R41H和A92L组合以后可以同时提高人溶菌酶的耐热性和对变性剂的耐受度。

[0039] 下面通过具体实施例对本发明所述的耐热人溶菌酶的基因工程改造过程进行具体说明。

[0040] 实施例1

[0041] 构建含有R41H和A92L突变前位点的N-端无多余氨基酸的人溶菌酶真核表达载体，即质粒pPicZαA-HLM。

[0042] 溶菌酶是高等动物编码的蛋白，在大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌里面表达有可能会有活性低、无法正确折叠以及形成不溶性包涵体等问题，所以优选采用真核表达系统-毕赤氏酵母Pichia pastoris。毕赤氏酵母可以对表达的蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰，使得表达的动物蛋白比原核系统表达的活性更高。而且毕赤氏酵母可以通过在目的蛋白的N-端加上α-factor等信号肽，将蛋白分泌到胞外，一方面可以避免由于短时间内大量表达目的蛋白而导致的浓度过高，蛋白来不及正确折叠而相互交联聚集形成包涵体的现象，另一方面大大简化后提取纯化的工艺流程。

[0043] 在毕赤氏酵母表达系统中，最经典和高效的分泌表达体系是通过在目的蛋白的N-端加上α-factor信号肽，将目的蛋白分泌到胞外，而Kex2信号肽酶可以特异性的识别并切割掉α-factor信号肽，从而获得成熟的蛋白。而根据Shuichiro Goda等的报道，由于人溶菌酶第一个氨基酸是碱性氨基酸Lys，可以和α-factor信号肽C端的Glu-Ala-Glu-Ala酸性氨基酸形成离子键，从而妨碍这四个氨基酸的正确切除。这就使得采用α-factor信号肽的人溶菌酶在毕赤氏酵母中表达后，最终产物与正常人溶菌酶比较，会带上4个多余的氨基酸Glu-Ala-Glu-Ala，并与溶菌酶本身N-端尾巴形成离子键，妨碍其功能的发挥，并且使蛋白容易形成淀粉状沉淀，从而大大降低溶菌酶的活性。

[0044] 为了解决这个问题，我们优化了α-factor信号肽的序列和克隆方法，将编码α-factor信号肽C端的Glu-Ala-Glu-Ala氨基酸的DNA序列去除，可以在Kex2蛋白酶切割后，得到N-端无任何多余氨基酸的人溶菌酶，从而大大增加了采用毕赤氏酵母表达的人溶菌酶的活性。

[0045] 将编码人溶菌酶（human lysozyme，HLM）的基因进行针对毕赤氏酵母的密码子优化，将DNA序列通过全序列基因合成，并连接到克隆质粒pUC57的EcoRV位点。为了将HLM蛋白基因克隆到毕赤氏酵母质粒pPicZαA中, 采用PCR扩增的方法，使用引物HLM-F和HLM-R将HLM基因从pUC57克隆载体中扩增出来，所述引物HLM-F和HLM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

[0046] （1）PCR反应体系：

[0047]

[0048] （2）PCR反应程序：

[0049]

[0050] 使用任意的商用PCR仪，例如Thermo Scientific ArkTik Thermocycler PCR仪进行扩增反应。反应结束以后，使用Gen-Foci Biotech (Ann Arbor，MI，USA) 公司生产的PCR纯化试剂盒，按照生产商的说明对PCR产物进行纯化。

[0051] 将毕赤氏酵母表达载体pPicZαA进行NdeI和XhoI双酶切，将酶切产物经过热变性失活以后，跑0.7%琼脂糖电泳，并且在紫外灯下用手术刀片切下酶切过的线性化的pPicZαA载体大片段条带，使用Gen-Foci (Ann Arbor，MI，USA)的胶回收试剂盒，按照生产商的说明从琼脂糖凝胶中回收酶切过的pPicZαA载体，用于目的基因的克隆连接，胶回收步骤可以防止载体自连。

[0052] 采用闪电克隆试剂盒（金福赛（北京）生物科技），通过同源重组的方法，将PCR扩增获得的表达HLM的基因DNA片段与XhoI/NotI酶切过的pPicZαA载体连接，得到真核表达编码人溶菌酶HLM基因的克隆。

[0053] 将纯化过的PCR产物和线性化的pPicZαA载体按照1:1至10:1的比例，优选3:1的比例混合（例如，90ng：30ng），加入反应总体积1/2的2x闪电克隆mix (金福赛（北京）生物科技) ，mix中包含闪电克隆酶、连接反应缓冲液以及NAD+辅酶，50°C，15-60分钟，优选30分钟进行连接。反应完成后，取1μ连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂在含有25ug/ml博莱霉素的低盐高pH的LB（1% 蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5% NaCl， pH7.5）抗性平皿上过夜培养。挑单菌落，培养并提取质粒，通过菌落PCR和基因测序来筛选正确携带HLM基因的pPicZαA质粒阳性克隆，所述质粒即为pPicZαA-HLM，所述质粒pPicZαA-HLM的图谱如图1所示。

[0054] 实施例2

[0055] 分别针对R41H和A92L两个不同的突变位点设计引物，并通过PCR反应将R41H和A92L突变导入质粒pPicZαA-HLM中。

[0056] 不同物种之间的溶菌酶结构都相对保守，如图2所示。通过对不同物种溶菌酶序列的分析和耐热性的比较，选定了人溶菌酶的两个氨基酸进行突变R41H和A92L；通过定点突变的方法,将两个不同的突变R41H和A92L导入质粒pPicZαA-HLM中。

[0057] 采用构建的质粒pPicZαA-HLM作为模版，使用引物R41H-F 和R41H-R进行PCR反应，以引入R41H突变，所述引物R41H-F 和R41H-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

[0058] 用于引入R41H突变的实验步骤如下：

[0059] 使用Gen-Foci Biotech (Ann Arbor，MI，USA) 公司生产的点突变试剂盒，按照生产商的说明进行点突变PCR反应。

[0060] （1）PCR反应体系：

[0061]

[0062] （2）PCR反应程序：

[0063]

[0064] PCR反应结束以后，直接在PCR反应管中加入0.5 µl 限制性内切酶DpnI (New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)，混匀后在37°C反应1小时，然后取1 µl反应产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂在含有氨苄青霉素的抗性LB平皿上过夜培养。挑单菌落，培养并提取质粒，用Sanger法测序以确定正确的克隆。

[0065] 使用引物A92L-F和A92L-R进行PCR反应，以引入A92L突变，所述引物A92L-F和A92L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。用于引入A92L突变的实验步骤可参照引入R41H突变的实验步骤。

[0066] 实施例3

[0067] 用电击法将导入两个突变位点的质粒pPicZαA-HLM转入毕赤氏酵母菌株，并筛选阳性克隆。(毕赤氏酵母是真核生物，能够对表达的外源蛋白进行翻译后修饰，有助于提溶菌酶的单位活性和帮助形成正确的空间结构。)

[0068] 将表达野生型或者含有特定点突变的的人溶菌酶的pPicZαA-HLM质粒经测序确认后，用质粒大量提取试剂盒进行提取，然后用SacI限制性内切酶进行酶切线性化，经纯化后，用电击法转换毕赤氏酵母GS115感受态细胞，在YPD+200ug/ml博莱霉素抗生素平板上筛选HLM基因序列整合到GS115酵母基因组中的阳性克隆。然后将各个阳性克隆划单菌落后，分别涂到YPD+400到4000ug/ml 博莱霉素抗生素平板上，筛选多拷贝插入、表达量高的克隆（根据Invitrogen的研究，目的蛋白的表达量和插入的拷贝数成正比）。

[0069] 实施例4

[0070] 诱导耐热人溶菌酶在毕赤氏酵母中分泌表达，并进行耐热人溶菌酶的后处理纯化。

[0071] 通过甲醇诱导AOX1启动子驱动的疫苗蛋白在毕赤氏酵母中的表达。采用发酵的方法进行HLM的酵母表达。采用BMGY培养基，30℃发酵培养，在葡萄糖耗尽之后开始流加甲醇至终浓度1%进行人溶菌酶诱导表达。每隔18小时补加一次甲醇，诱导60小时之后发酵结束，进行人溶菌酶的后处理纯化。

[0072] 毕赤氏酵母表达的疫苗蛋白是分泌到胞外的，所以可以直接离心或过滤去除菌体，取上清，超滤浓缩至1/5体积后，用pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液进行一次超滤溶剂置换和脱盐，后直接上柱纯化。采用Bio-Rex 70离子交换层析介质（Bio-rad, Herculus, Carlifornia, USA), 进行第一步离子交换层析纯化。第二步用弱阳离子交换树脂CM Sepharose 去除绝大部分的其他杂质，最后得到纯度达到99%以上的，N端无多余氨基酸的人溶菌酶。纯化后的蛋白跑SDS-PAGE胶，用考马斯亮蓝染色的结果如图3所示(泳道：1、蛋白质分子量标准；2、野生型溶菌酶；3、R41H突变型；4、A92L突变型；5、R41H/A92L双突变型)。

[0073] 实施例5

[0074] 检测R41H和A92L突变后的人溶菌酶的耐热性以及对变性剂的耐受能力。

[0075] 采用标准方法对野生型或者突变后溶菌酶的活性进行检测。在最佳pH（6.5或7.0）下，在10分钟孵育时间内，采用的温度范围为30至90℃。通过测量酶的半衰期来确定热稳定性。所有纯化的人溶菌酶在反应缓冲液（0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.0）中稀释至10 μg/ ml，并孵育不同的时间，在标准条件下测量残留酶活性。

[0076] 确定它们的耐热性（活性剩余50％的温度，T50）：野生型溶菌酶和突变酶在反应缓冲液（pH6.5）中被稀释至10μg/ ml，然后加热30分钟，在50℃至90℃的范围内，取样点间隔5℃。加热后，将人溶菌酶酶立即置于冰上10分钟，然后使用以上所述测定法测量残留的人溶菌酶活性。

[0077] 人溶菌酶活性测定：

[0078] 1、将800 ul的Micrococcus微球菌细胞悬浮液加样到一个比色皿中作为空白，另比色皿一个用于对照，每个样品都如此。

[0079] 2、将比色杯温度平衡至25℃。

[0080] 3、使用适当温控的分光光度计监测在波长450nm的光吸收A450直到恒定。

[0081] 4、将30 ul反应缓冲液加入空白试管，30 ul人溶菌酶溶液至对照样品池中，加入30ul试样至剩余试管。

[0082] 5、立即混合，并记录A450光吸收的5分钟的减少量。

[0083] 野生型和突变型溶菌酶热处理后剩余1/2酶活的时间（T1/2）

[0084]

[0085] 结果如上表和图4所示，与野生型溶菌酶相比，R41H突变体可将溶菌酶的耐热性温度T50从最高74℃提高到76℃，A92L突变体可将溶菌酶的耐热温度T50从最高74℃提高到78℃，而R41H和A92L双突变体可将溶菌酶的T50从最高74℃提高到81℃，从实验结果可知，R41H和A92L双突变体可以有效的将人溶菌酶的耐热性提高到80℃以上；处理后剩余1/2酶活的时间T1/2也获得显著提升，为将溶菌酶应用于高温造粒等饲料和其他需要高温处理工业农业应用提供了便利条件。

[0086] 一种所述的耐热人溶菌酶在饲料制备中的应用，其中，所述耐热人溶菌酶在饲料中的添加量为1-10万IU/kg。

[0087] 在上述方案中，将本发明所述的耐热人溶菌酶添加到饲料中，可以有效地抑制饲料中有害菌的繁殖，能防止饲料在运输储存过程中发生变质，所述耐热人溶菌酶在饲料中的添加量以能够起到显著的抗菌消炎效果为准，并不限定其添加量一定为1-10万IU/kg。

[0088] 一种如权利要求1所述的耐热人溶菌酶在高温造粒型饲料制备中的应用。

[0089] 一个优选方案中，高温造粒过程的温度为80-85℃，高温造粒过程的时间为8-30min，高温造粒过程后，颗粒饲料中耐热人溶菌酶的活性大于50%。

[0090] 在上述方案中，饲料的造粒过程通常采用80摄氏度以上的高温，在此温度下，绝大多数蛋白质和酶都会因为高温变性而失活。本发明所述的基因工程改造的耐热人溶菌酶的耐热性相对来说要高于一般的酶，在温度高达80-85℃的高温造粒过程中的至少前8-30min内的活性能够维持在50%以上。

[0091] 一种所述的耐热人溶菌酶在食品保鲜中的应用。

[0092] 一个优选方案中，在巴氏灭菌前向奶制品中添加所述耐热人溶菌酶，所述耐热人溶菌酶的添加量为所述奶制品的质量百分含量的1%-3%。

[0093] 在上述方案中，本发明所述的耐热人溶菌酶特别适合于巴氏杀菌奶的防腐，在奶制品中加入适量的人溶菌酶，可以有效延长奶制品的保存时间，并且在饮用后可以对人体产生保护作用。此外，人溶菌酶是一种非特异性免疫因子，可对肠道中腐败性微生物有特殊的杀灭作用。人溶菌酶在体内可以直接或间接地促进肠道内双歧杆菌的增殖；可以促进胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，延长在肠道停留时间，有利于消化吸收；可以促进肠道细菌菌群的正常化；它还能够强化血清灭菌蛋白、r-球蛋白等体内防御因子，以增强对感染的抵抗力。另外，在奶酪加工中添加一定量的溶菌酶可以防止中后期奶酪的后期起泡、风味变差及不影响奶酪老化过程中奶酪基液的品质，同时，还能起到抑菌作用，不至引起酪酸发酵，这是其它防腐剂所无法比拟的。

[0094] 一个优选方案中，在包装前向新鲜果蔬中添加所述耐热人溶菌酶，所述耐热人溶菌酶的添加量为所述新鲜果蔬的质量百分含量的0.1%-0.3%；

[0095] 或，向加热煮制前的果蔬中添加所述耐热人溶菌酶，所述耐热人溶菌酶的添加量为所述果蔬的质量百分含量的1%-3%。

[0096] 在上述方案中，向新鲜果蔬中添加一定量的本发明所述的耐热人溶菌酶，一般添加量为0.1%-0.3%，然后再进行真空包装，能够起到很好的保鲜效果；或者，向果蔬中添加1%-3%的所述耐热人溶菌酶，然后再进行加热煮制，能够起到很好的防腐效果。

[0097] 一种应用所述的耐热人溶菌酶制备获得的保鲜剂，其中，所述保鲜剂采用喷雾法或浸渍法用于水产品或肉制品的保鲜，所述保鲜剂中的所述耐热人溶菌酶的使用的质量百分比浓度为1%-3%。

[0098] 在上述方案中，采用喷雾法或浸渍法在水产品和肉制品中加入含有所述耐热人溶菌酶保鲜剂，可以对水产品和肉制品起到保鲜的作用，所述保鲜剂以本发明所述耐热人溶菌酶为主要的活性成分，所述保鲜剂中的所述耐热人溶菌酶的使用的质量百分比浓度为1%-3%，可以延长低温肉制品的保质期一倍以上。

[0099] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。