一种评估乳腺癌风险的突变基因及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种评估乳腺癌风险的突变基因。本发明还公开了一种乳腺癌突变基因检测的特异性引物及其检测试剂盒。本发明利用ARHGEF18、RPTN和TTC21B基因的突变位点开发评估乳腺癌风险的检测试剂盒，该试剂盒具有敏感性强，准确率高等优点，且方法简单、快速，对乳腺癌的早期筛查、预后评估具有重要的意义，也为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了重要依据。

权利要求

1.检测ARHGEF18：NM_001130955:exon12:c.C2101T:p.Q701X突变位点的引物在制备评估乳腺癌风险的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为上游引物SEQ ID  No.1：5’-CCCCTTCCTTCCACAGTCGAG-3’；下游引物SEQ  ID  No.2：5’-GTCTGGAGGGTTTCAGAAGGT-3’。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括：dNTP溶液，Taq酶，用于分离或纯化核酸的试剂，阳性对照或阴性对照。

说明书

一种评估乳腺癌风险的突变基因及其检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种评估乳腺癌风险的突变基因及其检测试剂盒。

背景技术

[0002] 乳腺癌是一种全身性疾病、其发生和发展是一个涉及多因素、多环节的复杂过程，包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此，基因突变在乳腺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。

[0003] 乳腺癌是一个多因素遗传变异性疾病，只有不足10％是由于单基因缺陷引起的。随着高通量基因技术的发展，越来越多与乳腺癌相关基因被发现，这些基因上潜在的遗传变异(单核苷酸多态和拷贝数变异)可能引起乳腺癌药物治疗效果的差异。由于遗传变异的存在使抗肿瘤药物的代谢途径以及药物作用的目标基因可能受到影响，进而影响疗效以及预后。

[0004] 遗传性乳腺癌最常见的标志物为BRCA1和BRCA2基因的突变，但BRCA1/2基因突变检测乳腺癌以及治疗癌症通常是不够的，因为这些基因突变不发生在大量的偶发的癌症，只能用来解释一小部分遗传性乳腺癌的病因。

[0005] 突变位点的存在被认为赋予个体不同表型性状，以及对环境暴露、药物治疗等的不同反应，因此突变位点可能是导致个体疾发生发展差异的重要遗传基础。将疾病易感的突变谱用于疾病的辅助诊断，具有广泛的应用前景。若能筛选出存在于偶发的癌症中的基因突变位点来诊断和预后乳腺癌，将对乳腺癌个体化治疗产生重要指导意义，并为其药物筛选及药效评价开辟新的途径。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种评估乳腺癌风险的突变基因及其检测试剂盒。

[0007] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

[0008] 本发明首先提供了一种检测乳腺癌风险的突变基因，其特征在于，所述的突变基因选自以下ARHGEF18、RPTN和/或TTC21B中的一个或几个基因，所述突变基因的突变位点如下：

[0009] (1)ARHGEF18:NM_001130955:exon12:c.C2101T:p.Q701X；

[0010] (2)RPTN:NM_001122965:exon3:c.C1834T:p.Q612X；

[0011] (3)TTC21B:NM_024753:exon1:c.20_21insGGTGAGCGGGTGAGCG:

[0012] p.K7_T8delinsKVSGX。

[0013] 其中，X代表终止密码子。

[0014] ARHGEF18基因编码的蛋白质是鸟嘌呤核苷酸交换因子，属于RhoGTPase GFE家族。家族成员具有共同的特征，Dbl(DH)同源结构域，其是pleckstrin(PH)同源结构域。Rho GTP酶是调节细胞功能的GTP结合蛋白。Rho GTP酶在调节细胞骨架形成，基因转录，细胞周期及膜泡运输中起着重要作用，与肿瘤及神经性疾病发生也有密切关系，在体内扮演着分子开关的角色。Rho GTP酶的活化受到鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)的直接控制。

[0015] RPTN基因位于1q21染色体上，人RPTN属于S100蛋白家族新成员，N端有两个能与Ca2+可逆结合的EF手型结构域和内部含有富含谷氨酰胺残基的串联重复序列，是一种与角质细胞被膜形成有关的前体蛋白。RPTN在人的中枢神经系统广泛表达，尤其在海马、前额叶和蓝斑核等区域高表达，这些高表达的区域与精神分裂症、抑郁症的关系密切。

[0016] TTC21B是蛋白编码基因，编码TTC21家族的成员，其含有几个四肽重复(TPR)域。该蛋白质定位于纤毛轴突，可能在纤毛逆行的鞭毛内转运中发挥作用；该基因突变与各种鳞状细胞癌，肾囊虫病和窒息性胸部营养不良症有关。

[0017] 优选的，所述突变为无义突变。

[0018] 优选的，所述突变的存在用以下手段来确定：

[0019] (a)qPCR；

[0020] (b)微阵列基因芯片；和/或

[0021] (c)直接核酸测序。

[0022] 优选的，所述直接核酸测序法：先进行PCR扩增，得到含有目的突变位点的PCR产物，然后纯化PCR产物，再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。

[0023] 优选的，所述微阵列基因芯片：先进行PCR扩增，得到含有目的突变位点的PCR产物，然后将PCR产物与突变探针、野生探针杂交，通过比较两个探针杂交的信号强度判断样品基因型。探针固定在尼龙膜、硝酸纤维素膜、玻璃上的称为固相芯片；探针固定在微小珠子上的为液相芯片，如luminex、biocade检测平台。

[0024] 优选的，所述qPCR法包括ARMS-PCR法、HRM法、Taqman-MGB探针法。

[0025] 进一步地，本发明提供一种乳腺癌突变基因检测的特异性引物，所述引物序列为：

[0026] (1)用于检测ARHGEF18突变基因所述突变位点的引物：

[0027] 上游引物SEQ ID No.1：5’-CCCCTTCCTTCCACAGTCGAG-3’；

[0028] 下游引物SEQ ID No.2：5’-GTCTGGAGGGTTTCAGAAGGT-3’；

[0029] (2)用于检测RPTN突变基因所述突变位点的引物：

[0030] 上游引物SEQ ID No.3：5’-GACAGACAGACAAGGCCAGAGC-3’；

[0031] 下游引物SEQ ID No.4：5’-GGTGATGTTGGCTATCCTCTTCA-3’；

[0032] (3)用于检测TTC21B突变基因所述突变位点的引物：

[0033] 上游引物SEQ ID No.5：5’-GCTAGGGGAGCTGAATTCTGC-3’；

[0034] 下游引物SEQ ID No.6：5’-GACCAGCAATTCAGAAACACCG-3’。

[0035] 优选的，扩增上述突变基因的突变位点的引物分别根据NCBI中ARHGEF18(NC_000019.10)、RPTN(NC_000001.11)和TTC21B(NC_000002.12)基因组序列设计的，所述引物由上海生工设计合成，所述引物特异性强，扩增效果好。

[0036] 进一步地，本发明提供一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有上述引物中的一种或多种。

[0037] 优选的，所述试剂盒还包括：dNTP溶液，Taq酶，用于分离或纯化核酸的试剂，阳性对照或阴性对照。

[0038] 本发明有益效果：

[0039] 本发明利用ARHGEF18、RPTN和TTC21B基因的突变位点开发评估乳腺癌风险的检测试剂盒，该试剂盒具有敏感性强，准确率高等优点，且方法简单、快速，对乳腺癌的早期筛查、预后评估具有重要的意义，也为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了重要依据。

具体实施方式

[0040] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0041] 实施例1 制备评估乳腺癌风险的检测试剂盒

[0042] 本发明所述试剂盒的制作和操作流程是基于Sanger测序扫描检测分型技术。所述试剂盒包括DNA提取试剂；所述试剂盒还包含特异性扩增ARHGEF18:NM_001130955:exon12:c.C2101T基因突变的引物如正向引物序列为SEQ ID No.1所示，反向引物序列为SEQ ID No.2所示；该试剂盒还可以包括PCR反应常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以包括对照组正常健康女性外周血DNA。所用PCR反应体系为25μL：Taq Buffer 2.5μL，DNA 1μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，10mM dNTP 0.5μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 19.8μL。PCR反应程序：95℃3min，35个循环(94℃30s，60℃30s，72℃1min)，72℃10min。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，为诊断和个体化治疗提供指导帮助。

[0043] 本发明试剂盒还可以包含特异性扩增ARHGEF18、RPTN和/或TTC21B突变基因的一种或多种引物，所述引物为：

[0044] (1)用于检测ARHGEF18突变基因所述突变位点的引物：

[0045] 上游引物SEQ ID No.1：5’-CCCCTTCCTTCCACAGTCGAG-3’；

[0046] 下游引物SEQ ID No.2：5’-GTCTGGAGGGTTTCAGAAGGT-3’；

[0047] (2)用于检测RPTN突变基因所述突变位点的引物：

[0048] 上游引物SEQ ID No.3：5’-GACAGACAGACAAGGCCAGAGC-3’；

[0049] 下游引物SEQ ID No.4：5’-GGTGATGTTGGCTATCCTCTTCA-3’；

[0050] (3)用于检测TTC21B突变基因所述突变位点的引物：

[0051] 上游引物SEQ ID No.5：5’-GCTAGGGGAGCTGAATTCTGC-3’；

[0052] 下游引物SEQ ID No.6：5’-GACCAGCAATTCAGAAACACCG-3’。

[0053] 所述试剂盒与上述包含特异性扩增ARHGEF18:NM_001130955:exon12:c.C2101T基因突变引物的试剂盒的制备方法相同。

[0054] 实施例2 实施例1制备的检测试剂盒的使用

[0055] 1、DNA的提取

[0056] 取46例临床检测为乳腺癌患者的血液样本，提取DNA。

[0057] 具体步骤为：

[0058] (1)向储存于2mL冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20mL混合后，用TrisHcl溶液定容至2000mL，下同)，颠倒混匀后完全转入。

[0059] (2)去除红细胞：用溶血试剂将5mL离心管补至4mL，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4mL溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

[0060] (3)抽提DNA：向沉淀中加1mL抽提液(每300mL中含有122.5mL0.2M氯化钠，14.4mL 0.5M乙二胺四乙酸，15mL10％十二烷基硫酸钠，148.1mL双蒸水，下同)和8μL蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，37℃水浴过夜。

[0061] (4)去除蛋白质：加1mL饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5mL离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24:1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5mL的离心管)。

[0062] (5)DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μL，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

[0063] (6)DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1mL，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

[0064] (7)测量浓度：通常能得到20-50ng/μLDNA，纯度(紫外2600D：2800D)在1.8-2.0。

[0065] 2、测序

[0066] 用PCR反应体系为25μL：Taq Buffer 2.5μL，DNA 1μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，10mM dNTP 0.5μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 19.8μL。PCR反应程序：95℃3min，35个循环(94℃30s，60℃30s，72℃1min)，72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测，与紫外线切胶仪下切取PCR产物凝胶并纯化。对所有的PCR产物分别以正、反向引物序列测序，并对测序结果进行进一步分析，测序由上海生物工程完成；测序结果通过Chromas序列分析软件，将测序结果与标准序列进行比对，并结合健康女性对照组序列，寻找突变位点。

[0067] 3、结果分析

[0068] 根据测序图查看乳腺癌ARHGEF18基因携带者突变位点是否有变化，如果测序图中该位点为单峰C，则野生型(CC)为正常未患病；如果该位点为双峰，同时含有C和T，则杂合突变型(CT)为患病；如果该位点为单峰T，则纯合突变型(TT)为患病。

[0069] 结果显示，46例样品中，ARHGEF18(NM_001130955)第12外显子出现突变18例，突变率39.1％，其中杂合突变型有12例，纯合突变型有6例。

[0070] 对比例1 利用Taqman-MGB检测方法检测乳腺癌

[0071] 1、DNA的提取

[0072] 取46例临床检测为乳腺癌患者的血液样本，提取DNA同实施例2。

[0073] 2、PCR扩增

[0074] (1)引物设计

[0075] 根据ARHGEF18(GenBank号：NC_000019.10)，通过Primer Express3.0软件设计扩增ARHGEF18:NM_001130955:exon12:c.C2101T突变位点的特异性引物和探针，并由上海生工设计合成，所述引物及探针序列如下所示：

[0076] 上游引物SEQ ID NO.7：ACAGTCGAGGGCATCCAGAGC

[0077] 下游引物SEQ ID NO.8：CTGTGGAGCTGCCTCCGTCTT

[0078] 野生型探针SEQ ID NO.9：VIC-CCTGATCTGCAGGCAGCT-NFQ

[0079] 突变型探针SEQ ID NO.10：FAM-CCTGATCTGCAGGTAGCT-NFQ

[0080] (2)PCR反应体系

[0081] 通用PCR扩增预混试剂(购自ABI)，引物各400nM，荧光标记的2条Taqman-MGB探针各200nM，DNA 150ng。

[0082] (3)PCR反应条件

[0083] 将配置好的PCR体系放入荧光PCR仪器中，进行荧光PCR扩增检测；PCR扩增程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，进行40个循环。

[0084] 荧光PCR仪器：用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(ABI)。

[0085] 3、基因分型

[0086] 通过荧光定量PCR仪上显示的FAM和VIC探针的荧光信号强度，确定所检测的SNP位点的基因型。基因型判读：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为纯合突变基因型；只在VIC频道中有扩增信号产生的样本为野生基因型；在FAM和VIC频道中都有扩增信号产生的样本为杂合突变基因型；具有纯合突变基因型和杂合突变基因型的受试者的ARHGEF18基因突变检测结果均为阳性。

[0087] 结果显示，46例样品中，ARHGEF18(NM_001130955)第12外显子出现突变18例，突变率39.1％，其中杂合突变型有12例，纯合突变型有6例。结果与本发明试剂盒采用的方法所得的结果一致。

[0088] 结论：本发明制备的ARHGEF18检测试剂盒敏感性强，准确率高等优点，且方法简单、快速，对乳腺癌的早期筛查、预后评估具有重要的意义，也为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了重要依据。

[0089] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。