用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法

摘要

本发明涉及一种用于检测肺炎支原体的引物组。所述引物组包括所述引物组包括针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针，及针对内标质粒的引物对和探针。本发明还涉及一种用于检测肺炎支原体的试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液两种PCR反应液，其中，一种PCR反应液为包括针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针，及针对内标质粒的引物对和探针的第一PCR反应液，另一种PCR反应液为包括热启动酶和UNG酶的第二PCR反应液。本发明还涉及一种利用试剂盒检测肺炎支原体的方法。本发明提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测时间短、检测敏感性高等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。

权利要求

1.一种用于检测肺炎支原体的引物和探针组，其特征在于，所述引物和探针组是由针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针，及针对内标质粒的引物对和探针组成，其中：所述针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针的序列为：特异性上游引物：

5’‑ ATTATTGGGCTCGCGAAACG ‑3’；

特异性下游引物：

5’‑ GGCTCGACAGCTTATACGAC ‑3’；

特异性探针：

5’‑FAM‑AGGCACTACCAATCGCGGCTTG ‑TAMRA‑3’；

所述针对内标质粒的引物对和探针的序列为：内标质粒上游引物：

5’‑ GGCATGTGGAGGAAGGTGGT‑3’；

内标质粒下游引物：

5’‑CCATGGACTGGCTCTCCGTT ‑3’；

内标质粒探针：

5’‑HEX‑ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG‑TAMRA‑3’。

2.一种用于检测肺炎支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述第一PCR反应液包括针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针，及针对内标质粒的引物对和探针，其中，所述针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针的序列为：特异性上游引物：

5’‑ ATTATTGGGCTCGCGAAACG ‑3’；

特异性下游引物：

5’‑ GGCTCGACAGCTTATACGAC ‑3’；

特异性探针：

5’‑FAM‑AGGCACTACCAATCGCGGCTTG ‑TAMRA‑3’；

所述针对内标质粒的引物对和探针的序列为：内标质粒上游引物：

5’‑ GGCATGTGGAGGAAGGTGGT‑3’；

内标质粒下游引物：

5’‑CCATGGACTGGCTCTCCGTT ‑3’；

内标质粒探针：

5’‑HEX‑ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG‑TAMRA‑3’。

3.根据权利要求2所述的用于检测肺炎支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

4.根据权利要求3所述的用于检测肺炎支原体的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为以pUC57为载体的目的片段重组质粒。

说明书

用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

[0002] 肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)，旧称原发性非典型肺炎，由肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染引起。支原体是一种介于病毒与细菌
之间，可自由通过细菌滤器的病原微生物，其构造简单，无细胞壁。目前发现3种支原体确定
对人体致病，肺炎支原体为其中的一种。

[0003] MP是呼吸道感染的重要病原体，也逐渐成为儿童社区获得性肺炎的首要病原体。MPP的病理特征为间质性肺炎或毛细支气管炎改变，临床表现以顽固性剧烈咳嗽为特征。全
年都有散发感染，秋末和冬初为发病高峰季节，流行周期约为4年。MP的感染还可造成肺外
其他系统损害。据Vervloet LA报道，MP脑炎为MPP神经系统并发症中最常见的，其病死率高
达10％，约25％留有后遗症。MP感染还可损害皮肤黏膜，泌尿系统和血液系统。此外，MP还可
引起心血管系统、消化系统、关节肌肉等组织系统的非特异性发病症状。

[0004] MP的实验室诊断方法包括以下三类：第一是MP的分离培养，此为MP诊断的金标准，但培养技术要求苛刻，耗时长，大约为3‑4周，灵敏度低，限制了其在早期诊断上的应用。第
二类为血清特异性抗体检测，国际上公认的诊断标准为：急性期及恢复期的双份血清标本
中，肺炎支原体特异性抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时，均可确诊为肺炎支原体感
染。目前国内常用的为明胶颗粒凝集试验(PA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。但由于采集双
份血清的可操作性低，血清学方法不适应于早期诊断。第三类为分子生物学方法。国内已被
批准适用于临床的有RNA恒温扩增法，环介导的等温扩增法以及PCR荧光法。由于PCR荧光技
术成熟，灵敏度高且特异性强，其临床应用最为广泛。

[0005] 综上所述，本发明提供一种PCR荧光法检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法。

发明内容

[0006] 本发明的目的是设计针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针，及针对内标质粒的引物对和探针，并同时针对肺炎支原体基因组上种特异目的片段和内标质粒进行双
重荧光PCR扩增，以是否得到待检检样本的特异性扩增片段来判断是否感染肺炎支原体。

[0007] 本发明提供一种用于检测肺炎支原体的引物组，所述引物组包括针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针，及针对内标质粒的引物对和探针，其中：

[0008] 所述针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针的序列为：

[0009] 特异性上游引物：

[0010] 5’‑ATTATTGGGCTCGCGAAACG‑3’；

[0011] 特异性下游引物：

[0012] 5’‑GGCTCGACAGCTTATACGAC‑3’；

[0013] 特异性探针：

[0014] 5’‑FAM‑AGGCACTACCAATCGCGGCTTG‑TAMRA‑3’；

[0015] 所述针对内标质粒的引物对和探针的序列为：

[0016] 内标质粒上游引物：

[0017] 5’‑GGCATGTGGAGGAAGGTGGT‑3’；

[0018] 内标质粒下游引物：

[0019] 5’‑CCATGGACTGGCTCTCCGTT‑3’；

[0020] 内标质粒探针：

[0021] 5’‑HEX‑ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG‑TAMRA‑3’。

[0022] 本发明同时提供一种用于检测肺炎支原体的试剂盒，所述试剂盒包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述第一PCR反应液包括针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和
探针，及针对内标在质粒的引物对和探针，其中，

[0023] 特异性上游引物：

[0024] 5’‑ATTATTGGGCTCGCGAAACG‑3’；

[0025] 特异性下游引物：

[0026] 5’‑GGCTCGACAGCTTATACGAC‑3’；

[0027] 特异性探针：

[0028] 5’‑FAM‑AGGCACTACCAATCGCGGCTTG‑TAMRA‑3’；

[0029] 内标质粒上游引物：

[0030] 5’‑GGCATGTGGAGGAAGGTGGT‑3’；

[0031] 内标质粒下游引物：

[0032] 5’‑CCATGGACTGGCTCTCCGTT‑3’；

[0033] 内标质粒探针：

[0034] 5’‑HEX‑ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG‑TAMRA‑3’；

[0035] 所述第二PCR反应液包括热启动酶和UNG酶。

[0036] 在本发明提供的试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

[0037] 在本发明提供的试剂盒一较佳实施例中，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为以pUC57为载体的目的片段重组质粒。

[0038] 本发明还提供一种利用上文所述的试剂盒检测肺炎支原体的方法，该方法包括如下步骤：

[0039] 步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；

[0040] 步骤二：构建PCR反应体系，从试剂盒中取出第一PCR反应液和第二PCR反应液，并将适量PCR模板、与第一PCR反应液和第二PCR反应液混匀；

[0041] 步骤三：在所述PCR反应体系中，对待测PCR模板进行PCR扩增；

[0042] 步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阴性质控品、阳性质控品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到CT值进行结果判定，以得到待检测样本的定性结果。

[0043] 在本发明提供的所述的试剂盒检测肺炎支原体的方法一较佳实施例中，步骤三中PCR扩增反应条件如下：

[0044] 第一阶段：50℃120sec；

[0045] 第二阶段：95℃600sec，1cycle；

[0046] 第三阶段：95℃30sec，60℃30sec，捕捉荧光信号，40cycles；

[0047] 第四阶段：37℃30sec，1cycle。

[0048] 相较于现有技术，本发明提供的用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：

[0049] 一、通过分别针对肺炎支原体基因组上特异于人类以及其他物种的片段和内标质粒设计特异性高的引物对和荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出
科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有操作简单、检测速度快、检测灵敏度高及特异性
好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。

[0050] 二、通过在引物设计及试剂盒中增加内标质粒基因，可以有效避免假阴性的发生，从而提高本发明方法的灵敏度，使得检测结果更加准确可靠。

附图说明

[0051] 图1为阴性质控品检测时的PCR扩增曲线图；

[0052] 图2为阳性质控品检测时的PCR扩增曲线图；

[0053] 图3为临床样本1检测时的PCR扩增曲线图；

[0054] 图4为临床样本2检测时的PCR扩增曲线图。

具体实施方式

[0055] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并
不用于限定本发明。

[0056] 实施例1：试剂盒的制备

[0057] 一、引物和探针的设计与合成

[0058] 通过生物信息学分析，找到了MP基因组上特异于人类以及其他物种的片段(SEQ ID NO：8)且该片段在基因组上有2个重复，以此目的序列为模板，设计特异性的引物对(包
括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)和FAM标记的探针(SEQ ID NO：3)。同时设计了针对内标质
粒的引物对(包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)和HEX标记的探针(SEQ ID NO：6)，内标质粒
中内标片段的DNA序列为SEQ ID NO：7。

[0059] 各引物对和探针序列如下：

[0060] 表一、各引物对和探针序列表

[0061]

[0062] SEQ ID NO：7序列如下：

[0063] TCACAAGCAGGAGTGTGCCAGGAGAAGGCCAAACCATCCAGTGCCGGTGGTTTGACCACGAGGAGTGCATCCTGCACGGAGTCACTGAGCTCGTGACCTCCACGCTGCTCGTCCCCTGCGCTATCGAGAGGGCACTCTCTGTGT
CTCAGCTGGTGCCGCTGGCGCAGAGTGTTTTGGGCCCCTTAAAGCTCAGCATGGCTGGTTCTGGAGAGATGGAAAA
GAGAAAGGATTTCCCCCATTTGGGTGCCTCGGGCATGTGGAGGAAGGTGGTCCGGCGAACGAAGCAGGGCTGCGTG
AAGGGGATCTGATAACCCACGTCAACGGAGAGCCAGTCCATGG。

[0064] SEQ ID NO：8序列如下：

[0065] TGTTTCACTTGGTTTGCCAGTCAAACAACCCGGTGCGGGAGGATGTATTGGATTGTTGGGTTTGACCATTCTTCTGCTCCGGAAACACCGCCTTAATGAAATCCCCGAAGTTTTGGGCACTGTTGGGGGTGGGGTCGAAGGTGG
TTTTACCTTGGCTTTGTCCATTATTGGGCTCGCGAAACGCGGGGAAGGCATAGCCCAACTGTAAGGCACTACCAAT
CGCGGCTTGGTCGTATAAGCTGTCGAGCCCGTCCTTGGGTGCTTGGTACGCGAAGAA。

[0066] 二、质控品选择

[0067] 所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，其中，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为以pUC57为载体的目的片段重组质粒，所述目的片段的DNA序列为SEQ ID 
NO：8。

[0068] 三、PCR反应液组成

[0069] 所述PCR反应液包括两种反应液，其中，一种PCR反应液为包括针对肺炎支原体基因组的特异性引物对和探针，及针对内标质粒的引物对和探针的第一PCR反应液，另一种
PCR反应液为包括热启动酶和UNG酶的第二PCR反应液。

[0070] 所述第一PCR反应液包括特异性上游引物(SEQ ID NO：1)、特异性下游引物(SEQ ID NO：2)、特异性探针(SEQ ID NO：3)、内标质粒上游引物(SEQ ID NO：4)、内标质粒下游引
物(SEQ ID NO：5)和内标质粒探针(SEQ ID NO：6)。

[0071] 实施例2：利用上述试剂盒检测肺炎支原体的方法：

[0072] 一、生物样本

[0073] 采集临床初步怀疑为呼吸道感染的患者的咽拭子标本。用棉拭子取口咽部分泌物，置入装有生理盐水试管中，密封送检。所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。

[0074] 二、取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板：

[0075] 2.1取内标加入到样本处理液中，加入比例为1：50；

[0076] 2.2向装拭子的管里加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡摇匀，挤干拭子头；

[0077] 2.3吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000g离心5分钟；

[0078] 2.4去上清，沉淀中加入50μl样本处理液，充分混匀，100℃恒温处理10分钟；

[0079] 2.5 4℃或冰浴放置2分钟，12,000g离心5分钟，备用。

[0080] 三、构建PCR反应体系：

[0081] 确定检测管数，从试剂盒中取出第一PCR反应液和第二PCR反应液，并将适量PCR模板、阴性质控品和阳性质控品分别与第一PCR反应液和第二PCR反应混匀；具体如下：

[0082] 1)样本检测管

[0083] 表二、样本检测管加样体系

[0084]组分名称 组成成分 加量
第一PCR反应液 引物、探针 15.7μL
第二PCR反应液 热启动酶、UNG酶 0.8μL
样本 检测样本抽提的DNA 3.5μL
总体积   20μL

[0085] 2)阴性对照检测管

[0086] 表三、阴性对照检测管加样体系

[0087] 组分名称 组成成分 加量第一PCR反应液 引物、探针 15.7μL
第二PCR反应液 热启动酶、UNG酶 0.8μL
阴性对照 生理盐水 3.5μL
总体积   20μL

[0088] 3)阳性对照检测管

[0089] 表四、阳性对照检测管加样体系

[0090]

[0091]

[0092] 四、在所述PCR反应体系中，分别对待测PCR模板、阴性质控品和阳性质控品进行PCR扩增；

[0093] 将加样好的样本检测管、阴性对照检测管和阳性对照检测管分别装入放入ABI7500荧光定量PCR仪内(美国AppliedBiosystems公司)；设置PCR反应参数，进行PCR扩
增，具体PCR扩增反应条件如下：

[0094] 第一阶段：50℃120sec；

[0095] 第二阶段：95℃600sec，1cycle；

[0096] 第三阶段：95℃30sec，60℃30sec，捕捉荧光信号，40cycles；

[0097] 第四阶段：37℃30sec，1cycle。

[0098] 五、PCR结果判定

[0099] 在所述试剂盒的阴性质控品和阳性质控品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到CT值进行结果判定，以得到待检测样本的定性结果。具体地，PCR结果判定标准详见表
五。

[0100] 表五、PCR结果判定标准

[0101]

[0102] 同时针对样本和内标质粒进行双重荧光PCR扩增时，不会出现假阳性的结果，即只需要样本具有S型扩增曲线，则可判断样本为阳性；而为了避免假阴性的结果，则需要同时
根据样本的扩增曲线和内标质粒扩增曲线来判断，在样本无扩增曲线且内标质粒Ct<35时，
则可判断样本为阴性。

[0103] 本发明的阴性质控品、阳性质控品、临床样本1和临床样本2的扩增曲线图请参见图1至图4，读取的Ct值详见表六至表九。其中，图1为阴性质控品检测时的PCR扩增曲线图，
图2为阳性质控品检测时的PCR扩增曲线图，图3为临床样本1检测时的PCR扩增曲线图，图4
为临床样本2检测时的PCR扩增曲线图。图1至图4中，实线代表的为FAM检测通道出现的扩增
曲线，虚线代表的为HEX检测通道曲现的扩增曲线。

[0104] 表六、阴性质控品Ct值

[0105]   CtFAM —
HEX 29.24

[0106] 表七、阳性质控品Ct值

[0107]  Ct
FAM 21.61
HEX 30.25

[0108] 表八、临床样本1Ct值及结果判定

[0109]

[0110] 表九、临床样本2Ct值及结果判定

[0111]

[0112] 临床意义：可用于诊断肺炎支原体感染，为临床治疗提供参考。

[0113] 本发明提供的用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：

[0114] 一、通过分别针对肺炎支原体基因组上种特异目的片段和内标质粒设计特异性高的引物对和荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR
反应体系，使得本发明具有操作简单、检测速度快、及特异性好等优点，特别适合在临床检
验工作中普及应用。

[0115] 二、通过在引物设计及试剂盒中增加内标质粒基因，可以有效避免假阴性的发生，从而提高本发明方法的灵敏度，使得检测结果更加准确可靠。

[0116] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包
括在本发明的专利保护范围内。