抗独特型抗体检测方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗独特型抗体检测方法。包括如下步骤：用包被缓冲液分别将样本溶液和阴性对照溶液稀释，得到样本稀释溶液和阴性对照稀释溶液；将酶标板上的微孔分为样本孔和阴性孔，并将样本稀释溶液和阴性对照稀释溶液分别加入到样本孔和阴性孔中静置处理后，倒去样本稀释溶液和阴性对照稀释溶液；在样本孔和阴性孔中依次加入封闭液进行封闭反应、标本稀释剂稀释的生物素‑单抗和链霉亲和素‑HRP进行连接反应、TMB底物显色液进行显色反应后，加入终止液，并用酶标仪测定所述样本孔和所述阴性孔中的光密度值确定样本溶液中是否存在所述单抗对应的抗独特性抗体。该方法步骤简单，提高了灵敏度，不会出现假阳性。

权利要求

1.一种抗独特型抗体检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

用包被缓冲液分别将样本溶液和阴性对照溶液稀释，得到样本稀释溶液和阴性对照稀释溶液，所述阴性对照溶液含有同型对照抗体，所述同型对照抗体用于消除由于抗独特型抗体非特异性结合而产生的背景染色；

将酶标板上的微孔分为样本孔和阴性孔，并将所述样本稀释溶液和所述阴性对照稀释溶液分别加入到所述样本孔和所述阴性孔中静置处理后，倒去所述样本稀释溶液和所述阴性对照稀释溶液；

在所述样本孔和所述阴性孔中依次加入封闭液进行封闭反应、标本稀释剂稀释的生物素-单抗和链霉亲和素-HRP进行连接反应、TMB底物显色液进行显色反应后，加入终止液，并用酶标仪测定所述样本孔和所述阴性孔中的光密度值得OD样本、OD阴性对照；

根据所述光密度值分析：当OD样本/OD阴性对照≥2.1时，所述样本溶液中含有所述单抗对应的抗独特性抗体，当OD样本/OD阴性对照＜2.1时，所述样本溶液中不存在所述单抗对应的抗独特性抗体。

2.如权利要求1所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述包被缓冲液的PH＝

9.6，且所述包被缓冲液含有1.59g/L的碳酸钠和5.86g/L的碳酸氢钠。

3.如权利要求2所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述样本溶液的浓度为

1mg/mL，且所述样本溶液与所述包被缓冲液按体积比(1:1000)-(1:10000)稀释得到所述样本稀释溶液。

4.如权利要求3所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述样本孔中加入的所述样本稀释溶液的量为100ul/孔，且所述阴性孔中加入的所述同型对照抗体量为0.1ug/孔。

5.如权利要求1-4任一项所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述静置处理的条件为：4℃，12-24h；或所述静置处理的条件为：室温，2h。

6.如权利要求1-4任一项所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述封闭液的PH＝7.4，且所述封闭液含有PBST溶液和小牛血清白蛋白。

7.如权利要求1-4任一项所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述标本稀释剂的PH＝7.4，且所述标本稀释剂含有HEPES、小牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20。

8.如权利要求1-4任一项所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述生物素-单抗中的单抗为prM单抗。

9.如权利要求1-4任一项所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述终止液为硫酸。

10.如权利要求1-4任一项所述的抗独特型抗体检测方法，其特征在于，所述封闭反应和所述连接反应结束后，均用PBST洗涤所述酶标板上的微孔。

说明书

抗独特型抗体检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗独特型抗体检测方法。

背景技术

[0002] 登革病毒广泛流行于全球的热带及亚热带地区，在我国主要流行于海南和广东地区，四种不同血清型的登革病毒可以共循环在同一地区。初次感染登革病毒的患者出现其体内产生的prM抗体能够增强异型病毒的感染，引起威胁生命的登革出血热(DHF)和登革休克(DSS)症状。

[0003] 抗独特型抗体(anti-idiotype antibody；AId)是针对抗体分子V区上的特异抗原表位群(称为独特型)的抗抗体。AId与原来抗原的决定簇分子互为“内影像”关系，可模拟抗原结构和功能的作用，而可以作为一种新型疫苗。

[0004] 目前，一般采用间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)检测抗独特型抗体，此类方法需要酶切抗体的Fab端与固相载体相连形成固相抗原，加入抗独特型抗体后加入一种酶标二抗进行显色。此类方法酶切抗体效率较低，酶切后需进行进一步纯化，步骤复杂；固相抗原与抗独特型抗体反应灵敏性较低；加入酶标二抗与未完全酶切的固相抗原吸附造成背景值较高，出现假阳性结果。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种抗独特型抗体检测方法，旨在解决现有抗独特型抗体检测灵敏度低、易出现假阳性的技术问题。

[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0007] 本发明提供一种抗独特型抗体检测方法，包括如下步骤：

[0008] 用包被缓冲液分别将样本溶液和阴性对照溶液稀释，得到样本稀释溶液和阴性对照稀释溶液，所述阴性对照溶液含有同型对照抗体；

[0009] 将酶标板上的微孔分为样本孔和阴性孔，并将所述样本稀释溶液和所述阴性对照稀释溶液分别加入到所述样本孔和所述阴性孔中静置处理后，倒去所述样本稀释溶液和所述阴性对照稀释溶液；

[0010] 在所述样本孔和所述阴性孔中依次加入封闭液进行封闭反应、标本稀释剂稀释的生物素-单抗和链霉亲和素-HRP进行连接反应、TMB底物显色液进行显色反应后，加入终止液，并用酶标仪测定所述样本孔和所述阴性孔中的光密度值得OD样本、OD阴性对照；

[0011] 根据所述光密度值分析：当OD样本/OD阴性对照≥2.1时，所述样本溶液中含有所述单抗对应的抗独特性抗体，当OD样本/OD阴性对照＜2.1时，所述样本溶液中不存在所述单抗对应的抗独特性抗体。

[0012] 本发明提供的抗独特型抗体检测方法，直接将抗独特型抗体与固相载体相连形成固相抗原，然后加入生物素标记的抗体，链霉亲和素-HRP显色，建立生物素-链霉亲和素检测系统。与现有技术相比，本发明的抗独特型抗体检测方法步骤简单，不需要酶切去除抗体的Fc端，抗体-抗体结合反应特异性高，反应灵敏；此外，生物素-链霉亲和素检测系统扩大了检测信号，极大提高了检测浓度，省去了间接ELISA中的酶标检测二抗，消除了酶标二抗造成的假阳性。

附图说明

[0013] 图1为本发明实施例抗独特型抗体检测方法的原理图。

具体实施方式

[0014] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0015] 需要说明的是，在本发明实施例中，具体的试剂配置如下：

[0016] (1)包板缓冲液(50mmol/L碳酸盐，pH9.6)

[0017] 碳酸钠     0.795g

[0018] 碳酸氢钠   2.93g

[0019] 蒸馏水    至500ml。

[0020] (2)封闭液(pH7.4)

[0021] 小牛血清白蛋白(BSA)    5g

[0022] 1×PBST溶液(PBS+吐温-20)   100ml。

[0023] (3)PBS-吐温(PBST，pH 7.4)

[0024] PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)   999ml

[0025] 吐温                      1ml。

[0026] (4)标本稀释剂(HBS-BSA-Tween，pH 7.4)

[0027]

[0028] (5)TMB底物显色液

[0029] 底物显色A液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml；

[0030] 底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，取0.15g TMB溶于3ml DMSO中，蒸馏水加至500ml。

[0031] 另外，部分试剂来源：

[0032]

[0033]

[0034] 本发明实施例提供了一种抗独特型抗体检测方法，包括如下步骤：

[0035] S01：用包被缓冲液分别将样本溶液和阴性对照溶液稀释，得到样本稀释溶液和阴性对照稀释溶液，其中，阴性对照溶液含有同型对照抗体；

[0036] S02：将酶标板上的微孔分为样本孔和阴性孔，并将上述样本稀释溶液和阴性对照稀释溶液分别加入到样本孔和阴性孔中静置处理后，倒去样本稀释溶液和阴性对照稀释溶液；

[0037] S03：在上述样本孔和所述阴性孔中依次加入封闭液进行封闭反应、标本稀释剂稀释的生物素-单抗和链霉亲和素-HRP进行连接反应、TMB底物显色液进行显色反应后，加入终止液，并用酶标仪测定样本孔和阴性孔中的光密度值得OD样本、OD阴性对照；

[0038] S04：根据上述光密度值分析：当OD样本/OD阴性对照≥2.1时，样本溶液中含有单抗对应的抗独特性抗体，当OD样本/OD阴性对照＜2.1时，样本溶液中不存在单抗对应的抗独特性抗体。

[0039] 本发明实施例的上述抗独特型抗体检测方法，原理如图1所示，该方法中，先直接将抗独特型抗体与固相载体相连形成固相抗原(对应图1中Step1)，然后加入生物素标记的抗体(对应图1中Step2)，链霉亲和素-HRP(对应图1中Step3)，建立生物素-链霉亲和素检测系统，最后通过TMB底物显色液显色(对应图1中Step4)，检测OD值进行判断。与现有技术相比，本发明的抗独特型抗体检测方法步骤简单，不需要酶切去除抗体的Fc端，抗体-抗体结合反应特异性高，反应灵敏；此外，生物素-链霉亲和素检测系统扩大了检测信号，极大提高了检测浓度，省去了间接ELISA中的酶标检测二抗，消除了酶标二抗造成的假阳性。

[0040] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，阴性对照溶液含有同型对照抗体，即为同型对照(Isotype Control)，该同型对照抗体即为与抗独特型抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗独特型抗体非特异性结合而产生的背景染色。如此，可提高抗独特型抗体检测的准确度。

[0041] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，包被缓冲液的PH＝9.6，且包被缓冲液含有1.59g/L的碳酸钠和5.86g/L的碳酸氢钠。该包被缓冲液对样本溶液和阴性对照溶液进行稀释后，后有效保证抗独特型抗体与酶标滴定板上的微孔吸附(微孔表面涂层为聚苯乙烯，具有亲水性，对抗体具有吸附作用)。

[0042] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，样本溶液的浓度为1mg/mL，且样本溶液与包被缓冲液按体积比(1:1000)-(1:10000)稀释得到样本稀释溶液。在此条件下，得到的样本稀释溶液可使其中的抗独特型抗体与酶标滴定板上的微孔更有效地吸附。

[0043] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，样本孔中加入的样本稀释溶液的量为100ul/孔，且阴性孔中加入的同型对照抗体量为0.1ug/孔。如此条件下后续OD值的检测更加精准。

[0044] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，静置处理的条件为：4℃，12-24h；或静置处理的条件为：室温，2h。如此，包被效果更好。

[0045] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，封闭液的PH＝7.4，且封闭液含有PBST溶液和小牛血清白蛋白。如此，封闭效果更好。

[0046] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，标本稀释剂的PH＝7.4，且标本稀释剂含有HEPES、小牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20。如此，连接反应效果更好。

[0047] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，生物素-单抗中的单抗为prM单抗。如此，可以判断样品溶液是否有登革病毒的感染。

[0048] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，终止液为硫酸。

[0049] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，封闭反应和连接反应结束后，均用PBST洗涤酶标板上的微孔。如此可使后续反应更加充分，OD值检测效果更加准确。

[0050] 进一步地，本发明实施例的抗独特型抗体检测方法中，根据抗独特型抗体的标准品绘制标准曲线，即以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制曲线。根据该该标准曲线，计算OD值与浓度的关系，如此，可进步一检测抗独特型抗体的浓度。

[0051] 本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

[0052] 实施例1

[0053] 1.包被滴定板

[0054] 把1mg/mL抗独特型抗体样本按1：1000比例添加包被缓冲液，稀释到EP管；立即向酶标板中加入100μL/孔，4℃过夜或者室温孵育2小时。阴性对照：同型对照抗体同样用包被缓冲液稀释，按0.1ug/孔加入酶标板中。

[0055] 2.封闭

[0056] 倒去酶标板中的包被缓冲液，各孔中加入150μL封闭液，室温封闭1小时，用PBST洗涤4次。

[0057] 3.检测抗体

[0058] 用标本稀释剂稀释生物素标记的prM单抗(生物素-prM)为使浓度为1μg/ml，每孔加入0.1ml，室温温育酶标板60min，或者37℃温浴30min。然后用PBST洗涤4次。

[0059] 4.链霉亲和素-HRP

[0060] 将链霉亲和素-HRP(Streptavidin-HRP)按1：2000添加标本稀释剂进行稀释，然后每孔加入100μL，室温温育酶标板60min，或者37℃温浴30min。然后用PBST洗涤4次。

[0061] 5.TMB底物

[0062] 每孔加入TMB底物显色液A液和B液，室温避光反应5-15min，然后向每孔加入50μL硫酸终止液，终止显色反应。

[0063] 6.OD值

[0064] 酶标仪检测波长设定450nm，测定酶标板OD值。

[0065] 实施例2

[0066] 1.包被滴定板

[0067] 把1mg/mL抗独特型抗体样本按1：10000比例添加包被缓冲液，稀释到EP管；立即向酶标板中加入100μL/孔，4℃过夜或者室温孵育2小时。阴性对照：同型对照抗体同样用包被缓冲液稀释，按0.1ug/孔加入酶标板中。

[0068] 2.封闭

[0069] 倒去酶标板中的包被缓冲液，各孔中加入150μL封闭液，室温封闭1小时，用PBST洗涤4次。

[0070] 3.检测抗体

[0071] 用标本稀释剂稀释生物素标记的prM单抗(生物素-prM)为使浓度为1μg/ml，每孔加入0.1ml，室温温育酶标板60min，或者37℃温浴30min。然后用PBST洗涤4次。

[0072] 4.链霉亲和素-HRP

[0073] 将链霉亲和素-HRP(Streptavidin-HRP)按1：2000添加标本稀释剂进行稀释，然后每孔加入100μL，室温温育酶标板60min，或者37℃温浴30min。然后用PBST洗涤4次。

[0074] 5.TMB底物

[0075] 每孔加入TMB底物显色液A液和B液，室温避光反应5-15min，然后向每孔加入50μL硫酸终止液，终止显色反应。

[0076] 6.OD值

[0077] 酶标仪检测波长设定450nm，测定酶标板OD值。

[0078] 上述实施例1和实施例2的OD值分析结果如表1所示。表1结果可知：实施例1和实施例2中含有抗prM独特型抗体。

[0079] 表1

[0080]  OD样本 OD阴性对照 OD样本/OD阴性对照
实施例1 2.332 0.516 4.52
实施例2 1.292 0.516 2.50

[0081] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。