一种用于检测铜离子或制备防治阿尔茨海默症药物的化合物及其制备方法和产品转让专利
申请号 : CN201710752415.8
文献号 : CN107488151B
文献日 : 2019-10-29
发明人 : 于会娟
申请人 : 广东工业大学
摘要 :
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测铜离子和制备防治阿尔茨海默症药物的化合物及其制备方法和产品。该化合物的结构式如式I或式II所示。本发明的两种化合物，利用廉价、易得的原料，通过一步合成即可得到产品，反应条件温和、简单；对铜离子具有高选择性，检测限度可达纳摩尔级，可灵敏检测细胞内铜离子水平变化；同时配体可以螯合铜离子，有效抑制铜离子诱导的β‑淀粉样蛋白的交联，显著降低β‑淀粉样蛋白交联导致的神经毒性，在阿尔茨海默病药物研发领域具有重要的潜在价值。
权利要求 :
1.一种式I或式II所示化合物：
2.式I或式II所示化合物在制备铜离子检测试剂盒或防治阿尔茨海默症药物中的应用，式I或式II所示化合物结构如下：
3.一种式I所示化合物的制备方法，其特征在于，将2-咪唑甲醛与1,2-苯二胺在有机溶剂中反应，得到式I所示化合物；
4.一种式II所示化合物的制备方法，其特征在于，将4-咪唑甲醛与1,2-苯二胺在有机溶剂中反应，得到式II所示化合物；
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为无水乙醇。
6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为75℃～78℃，反应的时间为12～14h。
7.一种铜离子检测试剂盒，其特征在于，包括式I和/或式II所示化合物；
8.一种以非治疗目的快速检测铜离子的方法，其特征在于，将含有式I和/或式II所示化合物的溶液与待测样品混合，观察溶液颜色，溶液颜色变成绿色，则待测样品中含有铜离子；
9.一种以非治疗目的荧光检测铜离子的方法，其特征在于，将含有式I和/或式II所示化合物的溶液与待测样品混合，检测溶液的荧光强度变化，溶液的荧光强度降低，则待测样品中含有铜离子；
10.一种药物，其特征在于，包括式I和/或式II所示化合物；
说明书 :
一种用于检测铜离子或制备防治阿尔茨海默症药物的化合物
及其制备方法和产品
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测铜离子或制备防治阿尔茨海默症药物的化合物及其制备方法和产品。
背景技术
[0002] 铜离子是人体高级器官必需的一种微量元素，在许多重要生理过程如神经递质合成与代谢、抗氧化防御、细胞呼吸、骨合成中起着重要作用。铜离子的代谢异常与阿尔茨海默症、帕金森氏病、威尔森氏病、脂肪肝、糖尿病等疾病的发生密切相关。如阿尔茨海默症，病人大脑较高浓度的铜离子是导致β-淀粉样蛋白交联和氧化的关键因素之一。铜离子检测试剂及螯合剂的研究对疾病的早期诊断及治疗具有重要意义。
[0003] 目前铜离子的检测方法有原子吸收光谱、电感耦合原子发射光谱、电感耦合等离子体质谱、电化学方法、荧光光谱等。在众多方法中，荧光光谱作为一种灵敏、快速、高通量的方法被认为是最优的选择。目前已有多种铜离子荧光探针报道，如Hongping Zhou等报道了基于三苯胺骨架的荧光off-on探针(Sensors and Actuators B 206(2015)640)，C.Huang、T.Kaur,Org等报道了罗丹明类(Chem-Eur.J 14(2008)6892；Org Lett 14(2012)
14 406)，C.J.Fahrni等报道了冠醚类(Proc.Natl.Acad.Sci 102(2005)11179)。这些探针均可选择性识别铜离子，并可用于体外及细胞内铜离子的检测，但其缺点是合成步骤复杂，且检测限度大多为微摩尔。同时目前的铜离子探针仅具备铜离子识别功能，而能同时清除铜离子、抑制β-淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)交联的还未有报道。
14 406)，C.J.Fahrni等报道了冠醚类(Proc.Natl.Acad.Sci 102(2005)11179)。这些探针均可选择性识别铜离子，并可用于体外及细胞内铜离子的检测，但其缺点是合成步骤复杂，且检测限度大多为微摩尔。同时目前的铜离子探针仅具备铜离子识别功能，而能同时清除铜离子、抑制β-淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)交联的还未有报道。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明提供了一种用于检测铜离子或制备防治阿尔茨海默症药物的化合物及其制备方法和产品。本发明报道的两种化合物(saline配体)，利用廉价、易得的原料，通过一步合成即可得到产品，反应条件温和、简单。配体对铜离子具有高选择性，检测限度可达纳摩尔级，可灵敏检测细胞内铜离子水平变化。同时配体可以螯合铜离子，有效抑制铜离子诱导的β-淀粉样蛋白的交联，显著降低β-淀粉样蛋白交联导致的神经毒性，在阿尔茨海默病药物研发领域具有重要的潜在价值。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种式I或式II所示化合物，式I或式II所示化合物的结构式如下：
[0007]
[0008] 本发明还提供了式I或式II所示化合物在制备铜离子检测试剂盒中的应用。
[0009] 现有铜离子荧光探针合成步骤复杂，其检测限度大多为微摩尔级。本发明报道的两种saline配体，利用廉价、易得的原料，通过一步合成即可得到产品，反应条件温和、简单。配体对铜离子具有高选择性，检测限度可达纳摩尔级，可灵敏检测细胞内铜离子水平变化。
[0010] 本发明还提供了式I或式II所示化合物在制备防治阿尔茨海默症药物中的应用。
[0011] 现有铜离子荧光探针不能抑制铜离子诱导的β-淀粉样蛋白交联。本发明报道的两种配体可以螯合铜离子，有效抑制铜离子诱导的β-淀粉样蛋白的交联，显著降低β-淀粉样蛋白交联导致的神经毒性。
[0012] 本发明还提供了一种式I所示化合物的制备方法，将2-咪唑甲醛与1,2-苯二胺在有机溶剂中反应，得到式I所示化合物。
[0013] 本发明还提供了一种式II所示化合物的制备方法，将4-咪唑甲醛与1,2-苯二胺在有机溶剂中反应，得到式II所示化合物。
[0014] 作为优选，有机溶剂为无水乙醇。
[0015] 作为优选，反应的温度为75℃～78℃，反应的时间为12～14h。
[0016] 在本发明提供的实施例中，反应的温度为78℃，反应的时间为12h。
[0017] 在本发明提供的具体实施例中，式I或式II所示化合物的制备方法为：将2-咪唑甲醛或4-咪唑甲醛加热溶解于无水乙醇中，逐滴加入含有1,2-苯二胺的乙醇溶液，半个小时加完，混合液回流反应12h；反应结束后得到沉淀，抽滤，固体分别用无水乙醇、无水乙醚洗涤，真空干燥。
[0018] 本发明还提供了一种铜离子检测试剂盒，包括式I和/或式II所示化合物。
[0019] 本发明还提供了一种快速检测铜离子的方法，将含有式I和/或式II所示化合物的溶液与待测样品混合，观察溶液颜色，溶液颜色变成绿色，则待测样品中含有铜离子。
[0020] 在本发明提供的实施例中，将含有式I所示化合物的溶液与待测样品混合，观察溶液颜色，溶液颜色变成黄绿色，则待测样品中含有铜离子。
[0021] 在本发明提供的实施例中，将含有式II所示化合物的溶液与待测样品混合，观察溶液颜色，溶液颜色变成浅绿色，则待测样品中含有铜离子。
[0022] 作为优选，含有式I和/或式II所示化合物的溶液的组成为：
[0023] 式I和/或式II所示化合物：1～3mM；
[0024] DMSO：5～20％(v/v)；
[0025] 去离子水：补足。
[0026] 在本发明提供的实施例中，含有式I和/或式II所示化合物的溶液的组成为：
[0027] 式I和/或式II所示化合物：1mM；
[0028] DMSO：10％(v/v)；
[0029] 去离子水：补足。
[0030] 在本发明快速检测铜离子方法(比色法)中，铜离子的检测限为1mM。
[0031] 本发明还提供了一种荧光检测铜离子的方法，将含有式I和/或式II所示化合物的溶液与待测样品混合，检测溶液的荧光强度变化，溶液的荧光强度降低，则待测样品中含有铜离子。
[0032] 在本发明荧光检测铜离子方法中，铜离子的检测限为10～40nM。
[0033] 在本发明中，式I所示化合物的铜离子检测限为10nM。
[0034] 在本发明中，式II所示化合物的铜离子检测限为40nM。
[0035] 在本发明中，荧光检测的最大激发波长为290～300nm，最大发射波长为340～360nm。
[0036] 在本发明提供的实施例中，检测式I所示化合物的荧光强度时的最大激发波长为297nm，最大发射波长为356nm。
[0037] 在本发明提供的实施例中，检测式II所示化合物的荧光强度时的最大激发波长为297nm，最大发射波长为345nm。
[0038] 在本发明提供的实施例中，将含有式I所示化合物的溶液与待测样品混合，检测溶液的荧光强度变化，溶液的荧光强度显著降低，则待测样品中含有铜离子。
[0039] 在本发明提供的实施例中，将含有式II所示化合物的溶液与待测样品混合，检测溶液的荧光强度变化，溶液的荧光被完全淬灭，则待测样品中含有铜离子。
[0040] 本发明还提供了一种药物，包括式I和/或式II所示化合物。
[0041] 本发明提供了一种用于检测铜离子或制备防治阿尔茨海默症药物的化合物及其制备方法和产品。该化合物的结构式如式I或式II所示。本发明至少具有如下优势之一：
[0042] 1、本发明的两种化合物(四齿saline配体)，利用廉价、易得的原料，通过一步合成即可得到产品，反应条件温和、简单。
[0043] 2、本发明的两种化合物配体对铜离子具有高选择性，检测限度可达纳摩尔级，可灵敏检测细胞内铜离子水平变化。
[0044] 3、本发明的两种化合物配体可以螯合铜离子，有效抑制铜离子诱导的β-淀粉样蛋白的交联，显著降低β-淀粉样蛋白交联导致的神经毒性，在阿尔茨海默病药物研发领域具有重要的潜在价值。
附图说明
[0045] 图1示配体L1、L2比色检测铜离子；
[0046] 图2示配体L1荧光检测铜离子；
[0047] 图3示配体L2荧光检测铜离子；
[0048] 图4示配体L1、L2荧光检测细胞内铜离子浓度变化；
[0049] 图5示SDS-PAGE电泳分析配体抑制铜离子诱导的Aβ交联，[Aβ]＝10μM,[CuSO4]＝5μM,[L]＝0-100μM；其中5-1为电泳图，5-2为根据荧光强度绘制5-1的柱状图；
[0050] 图6示MTT测试U251细胞与Aβ、Aβ-CuCl2、Aβ-CuCl2-L共同孵育24小时后细胞存活率(Aβ:CuCl2:L＝1:0.5:1，[Aβ]＝10μM)。
具体实施方式
[0051] 本发明公开了一种用于检测铜离子或制备防治阿尔茨海默症药物的化合物及其制备方法和产品，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0052] 本发明提供的用于检测铜离子或制备防治阿尔茨海默症药物的化合物及其制备方法和产品中所用原料或辅料、试剂均可由市场购得。
[0053] 在以下实施例中，式I所示化合物定义为L1；式II所示化合物定义为L2。
[0054] 式I中文名称：N,N'-(1,2-亚苯基)二(1-(1H-咪唑-2-)甲胺；
[0055] 式I英文名称：N,N'-(1,2-phenylene)bis(1-(1H-imidazol-2-yl)methanimine)。
[0056] 式II中文名称：N,N'-(1,2-亚苯基)二(1-(1H-咪唑-4-)甲胺；
[0057] 式II英文名称：N,N'-(1,2-phenylene)bis(1-(1H-imidazol-4-yl)methanimine)。
[0058] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0059] 实施例1 L1的合成
[0060] 将10mM(0.96g)2-咪唑甲醛加热溶解于10mL的无水乙醇中，逐滴加入10mL溶有5mM(0.54g)1,2-苯二胺的无水乙醇，溶液颜色逐渐变为黄色，半个小时加完，混合液(78℃)回流反应12h。反应结束后得到大量的白色沉淀，抽滤，固体分别用无水乙醇，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到白色粉末状固体，产率：62.1％，ES-MS(C2H5OH):265.1([M+H]+)。经结构鉴定，配体L1的结构如式I所示：
[0061]
[0062] 实施例2 L2的合成
[0063] 将10mM(0.96g)4-咪唑甲醛加热溶解于10mL的无水乙醇中，逐滴加入10mL溶有5mM(0.54g)1,2-苯二胺的无水乙醇，溶液颜色逐渐变为褐色，半个小时加完，混合液(78℃)回流反应12h。反应结束后得到大量的灰褐色沉淀，抽滤，固体分别用无水乙醇，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到灰褐色微晶，产率：50.2％，ES-MS(C2H5OH):265.1([M+H]+)。经结构鉴定，配体L2的结构如式II所示：
[0064]
[0065] 实施例3 L1、L2比色检测铜离子
[0066] 配制浓度为1mM的配体溶液(10％DMSO,90％H2O)，向溶液中滴加不同金属离子M溶液(M＝Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Al3+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+,10％DMSO,90％H2O)，观察溶液颜色变化，如图1所示，溶液颜色变绿者(L1变为黄绿色，L2变为浅绿色)即为铜离子，铜离子浓度约为1mM。
[0067] 实施例4 L1荧光检测铜离子
[0068] 配制浓度为10nM的L1溶液(10％DMSO,90％H2O)，测试溶液荧光光谱(λex＝297nm,λem＝356nm)，向溶液中滴加不同金属离子M溶液(M＝Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Al3+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+,10％DMSO,90％H2O)，如图2所示，加入后L1荧光显著降低者为铜离子，铜离子浓度约为10nM。
[0069] 实施例5 L2荧光检测铜离子
[0070] 配制浓度为10nM的L2溶液(10％DMSO,90％H2O)，测试溶液荧光光谱(λex＝297nm,λem＝345nm)，向溶液中滴加不同金属离子(M)溶液(M＝Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Al3+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+,10％DMSO,90％H2O)，如图3所示，加入后L2荧光被完全淬灭者为铜离子，铜离子浓度约为40nM。
[0071] 实施例6 L1、L2荧光检测细胞内铜离子水平
[0072] 将细胞铺于96孔培养板中，4000-5000/孔，细胞培养箱中孵育24小时后，向培养基2+
中加入不同浓度Cu 溶液，使铜离子浓度为25μM、50μM、100μM、200μM。37℃孵育24小时后，吸去培养液，加入含有10μM L1/L2的新鲜培养液，孵育2小时，吸去培养液，酶标仪下测定配体荧光，如图4所示，随着细胞内铜离子浓度越高，配体的荧光逐渐降低，说配体可以检测细胞内铜离子浓度变化。
中加入不同浓度Cu 溶液，使铜离子浓度为25μM、50μM、100μM、200μM。37℃孵育24小时后，吸去培养液，加入含有10μM L1/L2的新鲜培养液，孵育2小时，吸去培养液，酶标仪下测定配体荧光，如图4所示，随着细胞内铜离子浓度越高，配体的荧光逐渐降低，说配体可以检测细胞内铜离子浓度变化。
[0073] 实施例7 SDS-PAGE电泳检测L1、L2抑制铜离子诱导的Aβ交联能力
[0074] 配制Aβ、Aβ-CuCl2、Aβ-CuCl2-L三组溶液(Aβ:CuCl2:L＝1:0.5:1，[Aβ]＝10μM)，37℃避光孵育2小时后，SDS-PAGE电泳分析Aβ单体条带的变化。如图5所示，加入铜离子后Aβ单体的量明显降低，说明铜离子可诱导Aβ交联，随着配体浓度的增加Aβ单体的量逐渐增加，说明配体可有效抑制铜离子诱导的Aβ交联。
[0075] 实施例8 MTT测定L1、L2抑制Aβ交联导致的神经毒性
[0076] 将细胞铺于96孔培养板中，4000-5000/孔，细胞培养箱中孵育24小时后，分别加入Aβ、Aβ-CuCl2、Aβ-CuCl2-L溶液(Aβ:CuCl2:L＝1:0.5:1，[Aβ]＝10μM)。37℃孵育24小时后，加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4小时，吸去培养液，加入100μL DMSO，摇床低速震荡5分钟，酶标仪下测定579nm处OD值，计算细胞存活率，如图6所示，与Aβ共同孵育24小时后，细胞存活率为28％，加入铜离子后，细胞存活率仅为5％，加入配体后细胞存活率增加至45％和31％，说明配体可有效抑制Aβ交联导致的神经毒性。
[0077] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。