一种细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法和应用，所述纳米药物载体由聚合物胶束NLS‑PEG‑PAsp(BzA)和通过静电相互作用构建于所述聚合物胶束表面的pH敏感的负电聚合物构成，所述pH敏感的负电聚合物在pH为6.5～6.8时由负电变成正电；所述聚合物胶束的粒径为20nm～40nm，所述纳米药物载体的粒径为100nm～110nm。本发明提供的细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体可以在体内稳定循环，并有效的通过EPR效应富集在肿瘤部位。当纳米药物到达肿瘤微环境时，在pH为6.5～6.8的条件下，聚合物胶束表面复合的负电聚合物保护层由带负电转变成带正电，进而从带正电的聚合物胶束纳米粒子的表面脱离下来；带正电的聚合物胶束有利于细胞的内吞，最终在核定位信号肽的作用下靶向到肿瘤细胞核，实现抗肿瘤药物在细胞核内的释放。

权利要求

1.一种细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体，其特征在于，所述纳米药物载体由聚合物胶束多肽-聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-苄胺)NLS-PEG-PAsp(BzA)和通过静电相互作用构建于所述聚合物胶束表面的pH敏感的负电聚合物构成，所述pH敏感的负电聚合物在pH为6.5～6.8时由负电变成正电；所述聚合物胶束的粒径为20nm～40nm，所述纳米药物载体的粒径为100nm～110nm；所述pH敏感的负电聚合物为单甲基醚聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-(丁二胺-2,3-二甲基丁二酸))mPEG-PAsp(DBA-DMMA)。

2.根据权利要求1所述细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体，其特征在于，所述聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)的制备方法如下：S1.以天门冬氨酸为原料，加入三光气，制得苄氧羰基天冬氨酸酸酐BLA-NCA；

S2.以苄氧羰基天冬氨酸酸酐BLA-NCA为原料经聚合反应获得叠氮基聚乙二醇-聚天门冬氨酸N3-PEG-PBLA；

S3.以叠氮基聚乙二醇-聚天门冬氨酸N3-PEG-PBLA经氨解反应制得叠氮基聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-苄胺)N3-PEG-PAsp(BzA)；

S4.以NLS PeptidePra-RRRKKKGPKKKRKV-NH2和叠氮基聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-苄胺)N3-PEG-PAsp(BzA)为原料，经CuAAC Click反应得到多肽-聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-苄胺)NLS-PEG-PAsp(BzA)。

3.根据权利要求1所述细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体，其特征在于，所述mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的制备方法如下：S1.以天门冬氨酸为原料，加入三光气，制得苄氧羰基天冬氨酸酸酐BLA-NCA；

S2.以苄氧羰基天冬氨酸酸酐BLA-NCA为原料经聚合反应获得单甲基醚聚乙二醇-聚天门冬氨酸mPEG-PBLA；

S3.以单甲基醚聚乙二醇-聚天门冬氨酸mPEG-PBLA为原料经氨解反应获得单甲基醚聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-丁二胺)mPEG-PAsp(DBA)；

S4.以甲基醚聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-丁二胺)mPEG-PAsp(DBA)为原料经反应获得单甲基醚聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-(丁二胺-2,3-二甲基丁二酸))mPEG-PAsp(DBA-DMMA)。

4.权利要求1～3任一所述细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于，将mPEG-PAsp(DBA-DMMA)溶于pH为7.4～8.0的PBS水溶液中，与NLS-PEG-PAsp(BzA)胶束溶液混合即得所述纳米药物载体。

5.权利要求1～3任一所述细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体在制备负载细胞核抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为多柔比星Doxorubicin。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述多柔比星的载药量为聚合物胶束质量的

5.8％。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，以聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)和多柔比星Doxorubicin为原料，经超声自组装即得负载有多柔比星的聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)@DOX。

说明书

一种细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于高分子化学与生物医学工程领域，更具体地，涉及一种细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法。

背景技术

[0002] 靶向纳米药物递送系统不仅能够减少毒副作用，还能增强治疗效果，在近年来受到极大的关注。目前，诸如金属、氧化物、半导体、聚合物和磁性纳米粒子被广泛的应用于靶向肿瘤细胞。然而，大部分的研究只是关注纳米粒子在细胞内的分布，主要是细胞质，却很少关注细胞核。实际上，细胞核才是最终的靶向目标，它是细胞的心脏，是遗传信息复制和转录的场所，也是大部分治疗药物作用的地方。细胞核靶向的药物输送系统能够更有效、更直接的杀死癌细胞。

[0003] 细胞核膜是由核膜及大量的嵌入其中的核孔复合物组成，其核孔复合物(NPCs)的直径在20～70nm，由细胞的种类和细胞周期决定。NPCs为核浆与细胞质间的物质交换提供独特通道，同时也为纳米粒子的进入提供通路。由于核定位信号肽(NLS)的存在，较大的不均一的纳米粒子进入细胞核变得容易。研究表明，连接了核定位信号肽(Nuclear localization signal peptide)的纳米粒子的粒径在50nm及以下能够更有效的靶向到细胞核并释放出抗癌药物Doxorubicin（DOX）杀死癌细胞。

[0004] 基因治疗旨在将治疗基因递送到细胞核来纠正无功能及紊乱基因。另外，一些抗癌药物诸如DOX，能够破坏细胞核内的DNA、抑制拓朴异构酶-II的表达来诱导肿瘤细胞的凋亡。然而，由于存在大量的障碍，游离的抗癌药物和DNA很难在到达细胞核时仍然保持活性。因此，发展细胞核靶向纳米药物递送系统显得尤为重要。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体，本发明提供的纳米药物载体由聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)和通过静电相互作用构建于所述聚合物胶束表面的pH敏感的负电聚合物构成，在肿瘤微环境下，所述负电聚合物与聚合物胶束脱离，带正电的聚合物胶束纳米粒子在核定位信号肽的作用下靶向到肿瘤细胞核，实现抗肿瘤药物在细胞核内的释放。

[0006] 本发明的另一目的在于提供上述细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体的制备方法。

[0007] 本发明的另一目的在于提供细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体在负载细胞核抗肿瘤药物中的应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 一种细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体，所述纳米药物载体由聚合物胶束多肽-聚乙二醇-聚（天门冬氨酸-苄胺）NLS-PEG-PAsp(BzA)和通过静电相互作用构建于所述聚合物胶束表面的pH敏感的负电聚合物构成，所述pH敏感的负电聚合物在pH为6.5～6.8时由负电变成正电；所述聚合物胶束的粒径为20nm～40nm，所述纳米药物载体的粒径为100nm～110nm。

[0010] 本发明提供了一种细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体，所述纳米药物载体由聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)和通过静电相互作用构建于所述聚合物胶束表面的pH敏感的负电聚合物构成。所述聚合物胶束的粒径很小（Number mean为30nm左右），并且由于核定位信号肽的存在，满足了聚合物胶束进入细胞核的条件，并且能够在细胞核内释放抗肿瘤药物。

[0011] 本发明中，发明人在聚合物胶束表面构建了pH敏感的负电保护层，在pH为7.4～8.0时，pH敏感的负电聚合物能够与聚合物胶束很好的复合，这不仅有利于延长体液循环时间，还可以增强EPR效应，促进纳米粒子在肿瘤部位的富集；而在肿瘤微环境（pH 6.5～6.8）下，胶束表面复合的负电保护层由带负电转变成带正电，进而从带正电的胶束纳米粒子的表面脱离下来，带正电的纳米粒子有利于细胞的内吞，最终在核定位信号肽的作用下靶向到肿瘤细胞核，实现抗肿瘤药物在细胞核内的释放。

[0012] 优选地，所述聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)的制备方法如下：

[0013] S1. 以天门冬氨酸为原料，加入三光气，制得苄氧羰基天冬氨酸酸酐BLA-NCA；

[0014] S2. 以苄氧羰基天冬氨酸酸酐BLA-NCA为原料经聚合反应获得叠氮基聚乙二醇-聚天门冬氨酸N3-PEG-PBLA；

[0015] S3. 以叠氮基聚乙二醇-聚天门冬氨酸N3-PEG-PBLA经氨解反应制得叠氮基聚乙二醇-聚（天门冬氨酸-苄胺）N3-PEG-PAsp(BzA)；

[0016] S4. 以NLS PeptidePra-RRRKKKGPKKKRKV-NH2和叠氮基聚乙二醇-聚（天门冬氨酸-苄胺）N3-PEG-PAsp(BzA)为原料，经CuAAC Click反应得到多肽-聚乙二醇-聚（天门冬氨酸-苄胺）NLS-PEG-PAsp(BzA)。

[0017] 优选地，所述pH敏感的负电聚合物为mPEG-PAsp(DBA-DMMA)。

[0018] 优选地，所述mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的制备方法如下：

[0019] 所述mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的制备方法如下：

[0020] S1. 以天门冬氨酸为原料，加入三光气，制得苄氧羰基天冬氨酸酸酐BLA-NCA；

[0021] S2. 以苄氧羰基天冬氨酸酸酐BLA-NCA为原料经聚合反应获得单甲基醚聚乙二醇-聚天门冬氨酸mPEG-PBLA；

[0022] S3. 以单甲基醚聚乙二醇-聚天门冬氨酸mPEG-PBLA为原料经氨解反应获得单甲基醚聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-丁二胺)mPEG-PAsp(DBA)；

[0023] S4.以甲基醚聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-丁二胺)mPEG-PAsp(DBA)为原料经反应获得单甲基醚聚乙二醇-聚(天门冬氨酸-(丁二胺-2,3-二甲基丁二酸))mPEG-PAsp(DBA-DMMA)。

[0024] 优选地，将mPEG-PAsp(DBA-DMMA) 溶于pH为7.4～8.0的PBS水溶液中，与NLS- PEG-PAsp(BzA)胶束溶液混合即得所述纳米药物载体。

[0025] 上述细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体在负载细胞核抗肿瘤药物中的应用。

[0026] 优选地，所述抗肿瘤药物为多柔比星Doxorubicin。

[0027] 优选地，所述多柔比星的载药量为聚合物胶束质量的5.8%。

[0028] 优选地，以聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)和多柔比星Doxorubicin为原料，经超声自组装即得负载有多柔比星的聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)@DOX。

[0029] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0030] 本发明提供的细胞核靶向的抗肿瘤纳米药物载体可以在体内稳定循环，并有效的通过EPR效应富集在肿瘤部位。当纳米药物到达肿瘤微环境时，在pH 6.5～6.8的条件下，聚合物胶束表面复合的负电聚合物保护层由带负电转变成带正电，进而从带正电的聚合物胶束纳米粒子的表面脱离下来；带正电的聚合物胶束有利于细胞的内吞，最终在核定位信号肽的作用下靶向到肿瘤细胞核，实现抗肿瘤药物在细胞核内的释放。

附图说明

[0031] 图1为mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的核磁谱图；

[0032] 图2为NLS-PEG-PAsp(BzA)的核磁谱图；

[0033] 图3为mPEG-PBLA、mPEG-PAsp(DBA)、mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的红外谱图；

[0034] 图4为N3-PEG-PBLA、N3-PEG-PAsp(BzA)、NLS-PEG-PAsp(BzA)的红外谱图；

[0035] 图5为NLS-PEG-PAsp(BzA)胶束的粒径分布图；

[0036] 图6为NLS-PEG-PAsp(BzA)胶束的TEM图；

[0037] 图7为复合物mPEG-PAsp(DBA-DMMA)@NLS-PEG-PAsp(BzA)的粒径变化图；

[0038] 图8为复合物mPEG-PAsp(DBA-DMMA)@NLS-PEG-PAsp(BzA)的电位变化图；

[0039] 图9为NLS-PEG-PAsp(BzA)@DOX的药物累积释放曲线。

具体实施方式

[0040] 下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

[0041] 实施例1 聚合物胶束NLS-PEG-PAsp(BzA)和mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的合成[0042] （1）苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)的合成

[0043]

[0044] 先合成β-天门冬氨酸苄酯，其步骤如下：在500 ml单口茄型瓶中加入100 ml无水乙醚，搅拌下缓慢加入10 ml浓硫酸，待瓶中液体恢复到室温后加入100 ml苯甲醇，旋蒸浓缩除去乙醚，取13.3 g天门冬氨酸加入到单口瓶中，室温搅拌反应24 h。待反应完成后，向单口瓶中加入300 ml 95%乙醇并摇晃混合均匀，并向其中缓慢滴加浓NH3•H2O，逐渐产生白色沉淀，待调节pH值为7左右时停止滴加浓NH3•H2O，将浑浊液放置4 ℃冰箱过夜，抽滤收集的沉淀，重结晶2次，最终得到8.8 g晶体状天门冬氨酸苄酯。

[0045] 再由天门冬氨酸苄酯合成BLA-NCA。将6.0 g冻干的天门冬氨酸苄酯加入到干燥的500 ml单口瓶中，向其中加入100 ml新蒸的乙酸乙酯，在110 ℃下进行回流。待乙酸乙酯开始回流后，取4.2 g三光气溶解于30 ml新蒸乙酸乙酯中并转移至恒压滴液漏斗中，并缓慢滴加至两口瓶中，在110 ℃下反应至溶液变澄清。待反应完成后，将两口瓶冷却至室温并转移到-40℃冰箱冰冻2 h，快速地用冷的饱和NaHCO3溶液洗涤两次，萃取分液，再用冷的饱和NaCl溶液洗涤两次，萃取分液。最后将得到的液体用无水MgSO4干燥0.5 h，过滤，旋蒸浓缩，沉淀在大量的新蒸石油醚中，抽滤得到的沉淀，用热的新蒸乙酸乙酯/新蒸石油醚的混合溶液进行重结晶，待溶液冷却后，有晶体析出，得到3.8 g白色针状晶体。

[0046] （2）N3-PEG-PBLA的合成

[0047]

[0048] 将0.8886 g N3-PEG-NH2（氨基转化率为100%，叠氮基转化率98%）加入到50 ml反应瓶中，温度加热至70℃，抽真空干燥2 h。待干燥完成后，恢复至室温，加入40 ml新蒸的CH2Cl2溶解N3-PEG-NH2。将2.632 g BLA-NCA溶于4 ml溶于无水DMF，在N2保护下加入至反应瓶中，在35 ℃下反应72 h。待反应完全后沉淀在大量的无水乙醚中，离心，真空干燥，得到白色固体，再将白色固体重新溶解在CHCl3中，用大量的无水乙醚沉淀，离心，真空干燥，得到2.881 g N3-PEG-PBLA。

[0049] （3）N3-PEG-PAsp(BzA)的合成

[0050]

[0051] 在N2保护下，将0.5 gN3-PEG-PBLA加入至50 ml反应瓶中，加入15 ml DMSO将其溶解，加入1.719 g苄胺（10 eq），35℃下反应48 h。待反应完成后，将反应液加入3.5 KDa透析袋对甲醇透析2 d，透析完成后，旋干，用DMF溶解，沉淀在大量的无水乙醚中，离心，真空干燥，得到0.32 g N3-PEG-PAsp(BzA)。

[0052] （4）NLS Peptide(Pra-RRRKKKGPKKKRKV-NH2)的合成

[0053]

[0054] 多肽NLS采用固态多肽合成方法手动合成，在Rink Amide AM树脂上通过氨基酸缩合的方式合成。具体来说，以新蒸的DMF作为反应溶剂，每一步氨基酸的缩合都加入3倍当量于树脂上活性基团的Fmoc氨基酸、HoBt、HBTU和8倍当量的DIEA 反应2 h，用10 mg/ml茚三酮的甲醇溶液来检验缩合反应是否完全。每一步脱除Fmoc保护基采用20%哌啶/DMF（v/v）。氨基酸序列连接完成后，分别用新蒸DMF、无水甲醇、二氯甲烷洗三次，真空干燥，最后加入裂解剂将多肽从树脂上裂解下来，裂解剂的比例如下：95%三氟乙酸、2.5%三甲基硅烷、2.5%去离子水。反应2 h后，抽滤，旋蒸浓缩，沉淀在无水乙醚中，离心，真空干燥，得到NLS Peptide(Pra-RRRKKKGPKKKRKV-NH2)。

[0055] 具体来说，取Rink Amide AM树脂（树脂活性基团0.6 mmol/g）1.0 g，加入20 ml新蒸DMF溶胀0.5 h，溶胀完全后，加入20%哌啶/DMF（v/v）脱除树脂上的Fmoc，时间为20 min，脱除完后用10 mg/ml茚三酮的甲醇溶液进行验色并用新蒸DMF洗涤三次。接着加入3倍当量于树脂上活性基团的Fmoc-Val-OH、HoBt、HBTU和8倍当量的DIEA 反应2 h，采用10 mg/ml茚三酮的甲醇溶液进行验色，检验是否反应完全。若反应完全，采用20%哌啶/DMF（v/v）脱除Fmoc-Val-OH上的Fmoc，时间为20 min，脱除完后用10 mg/ml茚三酮的甲醇溶液进行验色并用新蒸DMF洗涤三次。再接入第二个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，以此类推，待所有的氨基酸连接完后将其从树脂上裂解下来。

[0056] （5）NLS-PEG-PAsp(BzA)的合成

[0057]

[0058] 取100 mg N3-PEG-PAsp(BzA)于10 ml反应管中，加入4 ml DMF将其溶解，加入1 mg CuSO4，采用液氮将反应管中的液体冻住抽真空除氧15 min，N2保护下，将反应管中的液体恢复至室温，进行第二次冻融除氧。第二次冻融除氧完成时，通N2过程中加入15 mg抗坏血酸，待其恢复室温后，进行第三次冻融除氧，待第三次冻融除氧完成后，在30℃下反应12 h。反应完成后，加入60 ml五甲基二乙烯基三胺配体搅拌5 min鳌合Cu+，再用甲醇透析2 d，纯水透析4 d，冻干，得到90 mg浅黄色固体NLS-PEG-PAsp(BzA)。

[0059] （6）mPEG-PBLA的合成

[0060]

[0061] 将0.5020 g mPEG-NH（2 氨基转化率为80%）加入到50 ml反应瓶中，温度加热至70℃，抽真空干燥2 h。待干燥完成后，恢复至室温，加入40 ml新蒸的CH2Cl2溶解mPEG-NH2。将2.0 g BLA-NCA溶于4 ml溶于无水DMF，在N2保护下加入至反应瓶中，在35 ℃下反应72 h。
待反应完全后沉淀在大量的无水乙醚中，离心，真空干燥，得到白色固体，再将白色固体重新溶解在CHCl3中，用大量的无水乙醚沉淀，离心，真空干燥，得到1.5 g mPEG-PBLA。

[0062] （7）mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的合成

[0063]

[0064] 在N2保护下，将1 gmPEG-PBLA加入至50 ml反应瓶中，加入15 ml DMSO将其溶解，加入1.42 g丁二胺，35℃下反应48h。待反应完成后，将反应液加入3.5 KDa透析袋对甲醇透析2 d，透析完成后，旋干，用DMF溶解，沉淀在大量的无水乙醚中，离心，真空干燥，得到0.59 g mPEG-PAsp(DBA)。

[0065] 取0.2 g mPEG-PAsp(DBA)于25 ml反应管中，加入10 ml DMSO将其溶解，加入0.4 g 2,3-二甲基马来酸酐（3 eq），加入450 μl TEA，反应12 h。待反应完成后，用甲醇透析2 d，旋干，再用DMF溶解，沉淀在大量的无水乙醚中，离心，真空干燥，得到82.2 mg淡黄色固体mPEG-PAsp(DBA-DMMA)。

[0066] 实施例2 载药胶束(NLS- PEG-PAsp(BzA)@DOX)的制备

[0067] 取20 mg NLS- PEG-PAsp(BzA)溶于3 ml DMSO，另取2.5 mg DOX•HCl溶于1 ml DMSO，并加入60 μl TEA搅拌2 h。将两者混合在一起边超声边缓慢滴入30 ml 超纯水中，完成后对水透析12 h。

[0068] 实施例 3NLS-PEG-PAsp(BzA)@DOX的药物释放

[0069] 采用常规的透析法进行体外释放实验的测试，来模拟胶束内负载药物的释放。取负载DOX的聚合物胶束溶液平均分成三份，三份样品条件分别设置为pH 7.4、pH 6.5、pH 5.0，释放实验是在37℃恒温水浴培养摇床中进行。并且每个样品设置三个平行组，每组加入2 ml 胶束溶液于14 kDa透析袋中，透析袋外加入10 ml相同条件下的PBS缓冲液，于摇床中进行模拟释放。然后在设定的不同时间点（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h）收集各组透析袋外的溶液，同时分别补加相同体积的PBS缓冲液。收集液采用紫外可见分光光度计检测在480.25 nm处的吸光度，利用已经制定好的标准曲线计算出DOX在各个时间点的累计释放率。

[0070] 实施例4 (mPEG-PAsp(DBA-DMMA)@NLS-PEG-PAsp(BzA))的制备

[0071] 取10 mg NLS-PEG-PAsp(BzA)溶于1 ml DMSO，边超声边缓慢滴入10 ml 超纯水中，完成后对水透析12 h。透析完后将胶束溶液浓缩至10 ml，得到的胶束溶液浓度为1 mg/ml。

[0072] 配置一系列不同浓度的mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的PBS 8.0的水溶液，浓度依次为0 mg/ml、0.5 mg/ml、1mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml、16 mg/ml，每种浓度分别取0.5 ml与0.5 ml的胶束溶液混合，静置15 min，测复合物的粒径和电位，从中选出最好的复合比例，从而继续进行后续的生物学实验。

[0073] 和NLS-PEG-PAsp(BzA)的结构分析和载体的形貌表征

[0074] （1）核磁谱图分析

[0075] 各聚合物取约10 mg溶于适量氘代溶剂，用1H-NMR 400MHz Bruker核磁共振波谱仪进行测试，检测后聚合物结构上1H化学位移的变化，测试结果见图1和图2。

[0076] 图1为mPEG-PAsp(DBA-DMMA)各质子氢的化学位移，PEG上的亚甲基氢在3.50 ppm，PAsp(DBA-DMMA)主链上次甲基的氢在4.60 ppm，侧链的重复单元上的亚甲基氢在2.51-2.92 ppm，酰胺键的氢在8.16 ppm，丁二胺基上的亚甲基的特征峰2.65 ppm和的特征峰
1.48 ppm，2.5 ppm处是DMMA上的甲基特征峰，与DMSO-d6溶剂峰重叠。

[0077] 图2为NLS-PEG-PAsp(BzA)各质子氢的化学位移，多肽序列主链上富含酰胺键，其和PEG-PAsp(BzA)主链上的酰胺键重合在一起，其酰胺键的氢在8.16 ppm，多肽主链上次甲基的氢与PEG-PAsp(BzA)主链上的次甲基氢重合在一起，在4.60 ppm，多肽侧链上富含赖氨酸的侧基，其化学位移分别为:1.81 ppm，1.52 ppm和3.12 ppm。多肽侧链上富含精氨酸的侧基，其化学位移分别为: 1.81 ppm, 1.52 ppm和2.51 ppm。多肽主链缬氨酸的侧基上两个甲基的化学位移在0.91 ppm。

[0078] （2）红外谱图分析

[0079] 采用Nicolet/Nexus 670红外光谱分析仪对每一步的产物进行红外测试，样品包括：mPEG-PBLA、mPEG-PAsp(DBA)、mPEG-PAsp(DBA-DMMA)、N3-PEG-PBLA、N3-PEG-PAsp(BzA)、NLS-PEG-PAsp(BzA)。

[0080] 具体做法如下：将固体样品与干燥的KBr粉末混合，研细混合均匀后压片，以纯KBr压片为背景扫描，波长测试范围为500-4000cm-1。测试结果见图3和图4。

[0081] 图3是mPEG-PBLA、mPEG-PAsp(DBA)和mPEG-PAsp(DBA-DMMA)的红外谱图比较，3400 cm-1是羧基中O-H的伸缩振动吸收峰，3282 cm-1是酰胺键中N-H的不对称伸缩振动吸收峰，3064 cm-1是酰胺键中N-H的对称伸缩振动吸收峰，1740 cm-1是酯键中C=O的伸缩振动吸收峰，1650 cm-1是酰胺键中C=O的伸缩振动吸收峰，742 cm-1和692 cm-1是单取代苯的特征峰，是C-H面外弯曲振动吸收峰。通过以上的这些特振峰，表明成功合成mPEG-PAsp(DBA-DMMA)。

[0082] 图4是N3-PEG-PBLA、N3-PEG-PAsp(BzA)、NLS-PEG-PAsp(BzA)的红外谱图比较，3282 cm-1是酰胺键中N-H的不对称伸缩振动吸收峰，3064 cm-1是酰胺键中N-H的对称伸缩振动吸收峰，2180 cm-1是叠氮的伸缩振动吸收峰，1740 cm-1是酯键中C=O的伸缩振动吸收峰，1650 cm-1是酰胺键中C=O的伸缩振动吸收峰，742 cm-1和692 cm-1是单取代苯的特征峰，是C-H面外弯曲振动吸收峰。通过以上的这些特振峰，表明成功合成NLS-PEG-PAsp(BzA)。

[0083] （3）粒径分布和透射电镜

[0084] 制备不同聚合物胶束样品，包括：NLS-PEG-PAsp(BzA)胶束、不同浓度比的复合物mPEG-PAsp(DBA-DMMA)@NLS-PEG-PAsp(BzA)，用粒度测定仪（DLS）检测NLS-PEG-PAsp(BzA)胶束的粒径，检测结果见图5。

[0085] 从图5中可以看出，聚合物NLS-PEG-PAsp(BzA)胶束的粒径Number mean分布在30 nm左右。

[0086] 用透射电镜（TEM）观察胶束的形貌，简要操作如下：取4μL样品（0.25 mg/mL）滴在纯碳膜铜网上，在室温下晾干，用3%的醋酸铀染色3 min；然后用透射电镜在120 kV下观察，检测结果见图6。

[0087] 图6为聚合物NLS-PEG-PAsp(BzA)胶束的电镜图，通过透射电镜，直接观察聚合物胶束的形貌，从电镜图观察到胶束的尺寸大小与图5中的结果接近，并且具有规则的形貌。

[0088] （4）粒径及电位变化

[0089] 用Zeta电位及粒度测定仪（DLS）检测复合物mPEG-PAsp(DBA-DMMA)@NLS-PEG-PAsp(BzA)的粒径及电势，入射激光波长λ＝532 nm，入射角θ＝175°，温度为25℃；粒径值和电势值取三次测量值的平均值，检测结果见图7和图8。

[0090] 从图7中可以看出，NLS-PEG-PAsp(BzA)胶束溶液的浓度为1 mg/ml、mPEG-PAsp(DBA-DMMA)水溶液的浓度为1mg/ml时，两者能够很好的复合，复合后的粒径达到105 nm左右，从图8中可看出其复合后的电位在-1.5 mV左右。

[0091] （5）药物累积释放曲线

[0092] 采用常规的透析法进行体外释放实验的测试，来模拟胶束内负载药物的释放。取负载DOX的聚合物胶束溶液于14 kDa透析袋中，透析袋外加入相同条件下的PBS缓冲液，于摇床中进行模拟释放。然后在设定的不同时间点收集各组透析袋外的溶液，同时分别补加相同体积的PBS缓冲液。收集液采用紫外可见分光光度计检测在482.5 nm处的吸光度，利用已经制定好的标准曲线计算出DOX在各个时间点的累计释放率。其释放曲线如图9。

[0093] 从图9中可以看出，24 h时，负载DOX的聚合物胶束在pH 7.4时，其药物累积释放率达到40%；pH 6.5时，其药物累积释放率达到50%；pH 5.0时其药物累积释放率达到60%。