二氢嘧啶-三氮唑类衍生物及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN201710705616.2
文献号 : CN107501257B
文献日 : 2020-05-29
发明人 : 刘新泳 , 贾海永 , 展鹏 , 俞霁
申请人 : 山东大学
摘要 :
本发明公开了一种二氢嘧啶‑三氮唑类衍生物及其制备方法和应用。所述化合物具有式I所示的结构。本发明还涉及含有式I结构化合物的制备方法，药物组合物以及提供上述化合物在制备抗HBV药物中的应用。
权利要求 :
1.二氢嘧啶-三氮唑类衍生物，其特征在于，是具有下列结构的化合物之一：
2.如权利要求1所述的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的制备方法，合成路线如下：试剂及条件:(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，醋酸钠，乙醇，80℃；(ii)N-溴代丁二酰亚胺，四氯化碳，50℃；(iii)叠氮化钠，丙酮，25℃；(iv)五水硫酸铜，抗坏血酸钠，四氢呋喃，不同取代的炔，25℃；
其中，R为2-氨基取代的苯环、3-氨基取代的苯环、2-取代吡啶环、4-氨基取代的苯环、
1-羟基戊烷基、对甲基苯甲酰胺甲基；
所述的含不同取代基炔环为2-氨基苯乙炔、3-氨基苯乙炔、2-乙炔基吡啶、4-氨基苯乙炔、1-庚炔-3-醇、N-炔丙基-(4甲基)苯甲酰胺。
3.如权利要求2所述的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的制备方法，步骤如下：
(1)将2-噻唑甲脒盐酸盐12.22mmol溶于250mL无水乙醇中，依次加入2-溴-4-氟苯甲醛
18.42mmol，乙酰乙酸乙酯12.22mmol，乙酸钠12.22mmol，80℃回流反应6h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去无水乙醇，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶获取化合物2；
(2)将中间体2 4.71mmol溶于200mL四氯化碳中，缓慢加入N-溴代丁二酰亚胺
4.94mmol，50℃回流反应10h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶获取化合物3；
(3)将中间体3溶于45mL丙酮中，加入NaN3 3.54mmol，25℃搅拌反应过夜；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，重结晶获取化合物4；
(4)将中间体4 0.43mmol溶于6mL四氢呋喃中，依次加入五水硫酸铜0.043mmol，抗坏血酸钠0.13mmol，不同取代炔类化合物0.86mmol，25℃搅拌反应过夜；反应结束后，冷却至室温，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到目标化合物；所述不同取代炔类化合物如权利要求2所述。
4.权利要求1所述的化合物在制备抗HBV的药物中的应用。
5.一种抗HBV药物组合物，包含权利要求1所述化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
说明书 :
二氢嘧啶-三氮唑类衍生物及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及二氢嘧啶-三氮唑类衍生物及其制备方法与制药用途。
背景技术
[0002] 乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)，简称乙肝(Hepatitis B)，是由乙型肝炎病毒(HBV)所致的重大传染性疾病，长期发展可导致急慢性病毒性肝炎、重型肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。据世界卫生组织(WHO)报道，全球近20亿人曾感染过HBV，其中约2.4亿人为慢性HBV感染者，平均每年约有78万人死于HBV感染所致的急、慢性肝炎及相关并发症。目前用于预防和治疗慢性乙型肝炎(CHB)的药物主要有疫苗、干扰素、免疫调节药以及DNA聚合酶抑制剂。但是由于它们存在耐药性、副作用、停药后反弹和不能彻底的清除乙肝病毒等缺点，因此发现和研究新的安全、高效、低毒和抗耐药性的非核苷类乙肝病毒抑制剂显得至关重要。
[0003] 核心蛋白是HBV核壳体组成的主要结构蛋白，在病毒进化过程中相对保守，并且核心蛋白的组装在乙肝病毒生命周期中发挥着重要作用。然而，目前还没有相关靶点的药物上市。针对目前进入临床候选药物肝毒性强、水溶性差以及代谢稳定性差的缺点，通过核心蛋白与配体的晶体复合物结构，进行了基于靶点的合理药物设计，设计合成了一类新颖的二氢嘧啶-三氮唑化合物，此类化合物在现有技术中未见相关报道。
发明内容
[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供了二氢嘧啶-三氮唑类衍生物及其制备方法，本发明还提供了上述化合物作为非核苷类HBV抑制剂的活性筛选结果及其应用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一、二氢嘧啶-三氮唑类衍生物
[0007] 本发明涉及的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物，具有如下通式I所示的结构：
[0008]
[0009] 其中，
[0010] R为氢、不同取代的烷基、含或不含取代基的苯环、含或不含取代基的杂环；
[0011] 根据本发明优选的，通式I中，R为氢、含苯环、2-氨基取代的苯环、3-氨基取代的苯环、4-氨基取代的苯环、吡啶环、噻吩环、1-羟基戊烷基、对甲基苯甲酰胺甲基、均三甲基苯磺酰胺甲基。
[0012] 进一步优选的，二氢嘧啶-三氮唑类衍生物是具有下列结构的化合物之一：
[0013] 表1二氢嘧啶-三氮唑类衍生物结构式
[0014]
[0015]
[0016] 二、二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的制备方法
[0017] 二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的制备方法，首先以化合物2-噻唑甲脒盐酸盐、2-溴-4-氟苯甲醛和乙酰乙酸乙酯为起始原料，通过“一锅法”环合得到关键中间体2，在四氯化碳溶液中，中间体2与N一溴代丁二酰亚胺发生溴代反应得到重要中间体3，再与叠氮化钠进行取代反应得到重要中间体4，最后，中间体4与含不同取代基炔环加成得到目标化合物I；
[0018] 合成路线如下：
[0019]
[0020] 试剂及条件:(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，醋酸钠，乙醇，80℃；(ii)N-溴代丁二酰亚胺，四氯化碳，50℃；(iii)叠氮化钠，丙酮，25℃；(iv)五水硫酸铜，抗坏血酸钠，水，四氢呋喃，不同取代的炔，25℃；
[0021] 其中，R同上述通式I中所述；
[0022] 所述的含不同取代基炔环为2-氨基苯乙炔、3-氨基苯乙炔、2-乙炔基吡啶、2-乙炔基噻吩、苯乙炔、4-氨基苯乙炔、丙炔酸、1-庚炔-3-醇、N-炔丙基-(4甲基)苯甲酰胺、2,4,6-三甲基-N(2-丙炔基)苯磺酰胺。
[0023] 本发明所述的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的制备方法，具体制备步骤如下：
[0024] (1)将2-噻唑甲脒盐酸盐12.22mmol溶于250mL无水乙醇中，下依次加入2-溴-4-氟苯甲醛18.42mmol，乙酰乙酸乙酯12.22mmol，乙酸钠12.22mmol，80℃回流反应6h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去无水乙醇，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶获取化合物2；
[0025] (2)将中间体2 4.71mmol溶于200mL四氯化碳中，缓慢加入N-溴代丁二酰亚胺4.94mmol，50℃回流反应10h。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶获取化合物3；
[0026] (3)将中间体3溶于45mL丙酮中，加入NaN3 3.54mmol，室温搅拌反应过夜。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，重结晶获取化合物4；
[0027] (4)将中间体4 0.43mmol溶于6mL四氢呋喃中，依次加入五水硫酸铜0.043mmol，抗坏血酸钠0.13mmol，不同取代炔类化合物0.86mmol，室温搅拌反应过夜。反应结束后，冷却至室温，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到目标化合物I。
[0028] 本发明所述的室温为15-25℃。
[0029] 三、二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的应用
[0030] 本发明公开了二氢嘧啶-三氮唑类衍生物抗HBV活性筛选结果及其作为抗HBV抑制剂的应用。通过实验证明本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物可作为经典的HBV非核苷类抑制剂应用。
[0031] 如表2所示，对所合成的目标化合物I(5a-5j)进行了体外抗HBV活性评价，通过CCK-8法测定了20μM和5μM药物浓度下细胞的死亡率；同时，通过PCR法测定了20μM和5μM药物浓度下抑制HBV DNA复制活性，选择先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定为阳性对照，其中5a和5g表现了较好的抑制HBV DNA复制活性。
[0032] 如表3所示，根据初步筛选的结果，对初筛的目标化合物5a和5g进一步的体外抗HBV活性评价，通过CCK-8法测定了药物在不同浓度下的细胞毒性；通过PCR法测定了药物在不同浓度下抑制HBV DNA复制活性；同时，通过酶联免疫法测定了药物在不同浓度下对HBsAg和HBeAg抗原的分泌抑制活性。选择先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定为阳性对照，每个化合物设置五个浓度梯度(50μM，5μM，0.5μM，0.05μM和0.005μM)，分别计算出半数抑制浓度CC50、IC50和选择性系数SI。
[0033] 本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物是一类结构新颖的非核苷类HBV抑制剂，可作为抗HBV的先导化合物。
[0034] 本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物可作为非核苷类HBV抑制剂应用。具体地说，作为HBV抑制剂用来制备抗乙肝药物。
[0035] 一种抗HBV药物组合物，包括本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
[0036] 本发明公开了二氢嘧啶-三氮唑类衍生物、其制备方法、抗HBV活性筛选结果及其作为抗HBV抑制剂的首次应用。实验证明本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物可作为HBV抑制剂用于制备抗乙肝药物。
具体实施方式
[0037] 通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，在下列实例中，所有目标化合物的编号与表1相同。
[0038] 合成路线：
[0039]
[0040] 试剂及条件:(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，醋酸钠，乙醇，80℃；(ii)N-溴代丁二酰亚胺，四氯化碳，50℃；(iii)叠氮化钠，丙酮，25℃；(iv)五水硫酸铜，抗坏血酸钠，水，四氢呋喃，不同取代的炔，25℃；
[0041] 实施例1.化合物2的制备
[0042] 取500mL圆底烧瓶，将2-噻唑甲脒盐酸盐(2.00g,12.22mmol)溶于250mL无水乙醇中，室温条件下依次加入2-溴-4-氟苯甲醛(3.74g,18.42mmol)，乙酰乙酸乙酯(1559μL,12.22mmol)，乙酸钠(1.66g,12.22mmol)，80℃回流反应6h。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去无水乙醇，加入水(60mL)，乙酸乙酯萃取三次(25mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(30mL x 3)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶获取黄色固体3.98g，收率76％；熔点153-156℃。
[0043]
[0044] 化合物2波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝2.8Hz,1H),7.46(s,1H),7.38–7.28(m,2H),6.97(t,J＝8.2Hz,1H),6.15(s,1H),4.05(q,J＝7.1Hz,2H),2.53(s,
3H),1.13(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:424.3[M+H]+.
3H),1.13(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:424.3[M+H]+.
[0045] 实施例2.化合物3的制备
[0046] 取500mL圆底烧瓶，将中间体2(2.00g，4.71mmol)溶于200mL四氯化碳中，缓慢加入NBS(0.88g，4.94mmol)，50℃回流反应10h。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取三次(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(25mL x 3)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶获取黄色固体1.21g，收率51％；熔点123-128℃。
[0047]
[0048] 化合物1的波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝3.1Hz,1H),7.52(s,2H),7.44–7.35(m,1H),7.32(dd,J＝8.1,2.6Hz,1H),7.02(t,J＝8.0Hz,1H),6.09(s,1H),4.94(d,J＝8.9Hz,1H),4.61(s,1H),4.09(d,J＝7.0Hz,2H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:
502.2[M+H]+.
502.2[M+H]+.
[0049] 实施例3.化合物4的制备
[0050] 取100mL圆底烧瓶，将中间体X-3(0.89g，1.77mmol)溶于45mL丙酮中，加入NaN3(0.23g，3.54mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水(50mL)，乙酸乙酯萃取三次(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(25mL x3)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶获取黄色固体0.85g，收率91％；熔点123-126℃。
[0051]
[0052] 化合物4波谱分析数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.64(s,1H),7.85(d,J＝3.1Hz,1H),7.55(d,J＝3.1Hz,1H),7.48–7.37(m,1H),7.35–7.29(m,1H),7.10–6.92(m,1H),6.29–
6.02(m,1H),4.97(s,1H),4.60(d,J＝2.6Hz,1H),4.17–4.00(m,2H),1.13(t,J＝7.1Hz,
3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.78,165.03,163.31,162.71,162.36,162.09,160.80,
160.22,154.83,150.00,143.92,143.54,143.10,142.75,139.59,137.74(d,J＝3.5Hz),
130.80,130.72,130.61,124.92,123.38,122.07(d,J＝9.7Hz),120.23(dd,J＝24.4,
17.0Hz),115.83,115.62,115.18,114.97,106.27,98.60,77.37,77.06,76.74,60.70,+
60.32,58.37,51.91(d,J＝2.0Hz),49.79,14.07(d,J＝5.7Hz)；EI-MS:465.4[M+H] .[0053] 实施例4.化合物5a的制备
6.02(m,1H),4.97(s,1H),4.60(d,J＝2.6Hz,1H),4.17–4.00(m,2H),1.13(t,J＝7.1Hz,
3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.78,165.03,163.31,162.71,162.36,162.09,160.80,
160.22,154.83,150.00,143.92,143.54,143.10,142.75,139.59,137.74(d,J＝3.5Hz),
130.80,130.72,130.61,124.92,123.38,122.07(d,J＝9.7Hz),120.23(dd,J＝24.4,
17.0Hz),115.83,115.62,115.18,114.97,106.27,98.60,77.37,77.06,76.74,60.70,+
60.32,58.37,51.91(d,J＝2.0Hz),49.79,14.07(d,J＝5.7Hz)；EI-MS:465.4[M+H] .[0053] 实施例4.化合物5a的制备
[0054] 取25mL圆底烧瓶，将中间体4(200mg,0.43mmol)溶于6mL四氢呋喃中，室温下依次加入五水硫酸铜(10.8mg,0.043mmol)，抗坏血酸钠(25.6mg,0.13mmol)，邻氨基苯乙炔(101mg,0.86mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，冷却至室温，加入水(40mL)，乙酸乙酯萃取三次(20mL x 3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(25mL x 3)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体，收率：73％，熔点：184-187℃。
[0055]
[0056] 化合物5a波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(s,1H),7.79(d,J＝3.1Hz,1H),7.52(s,1H),7.47(d,J＝3.1Hz,1H),7.43(dd,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.34(ddd,J＝9.3,8.4,
4.2Hz,2H),7.16–7.07(m,1H),7.03(td,J＝8.3,2.5Hz,1H),6.77(dd,J＝6.6,5.9Hz,1H),
6.72(dd,J＝11.6,4.3Hz,1H),6.17(t,J＝15.1Hz,1H),5.94(dd,J＝39.1,15.3Hz,2H),
5.54(s,2H),4.14(q,J＝7.2Hz,2H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ
165.02,162.10(d,J＝252.8Hz),161.77,152.47,150.09,147.97,145.20,143.95,137.62,
130.77(d,J＝8.8Hz),128.78,127.74,125.06,122.04(d,J＝9.7Hz),121.84,120.37(d,J＝24.7Hz),117.24,116.67,115.85(d,J＝21.1Hz),114.17,106.48,60.92,52.12,52.00,+
14.08；EI-MS:582.3[M+H] .
4.2Hz,2H),7.16–7.07(m,1H),7.03(td,J＝8.3,2.5Hz,1H),6.77(dd,J＝6.6,5.9Hz,1H),
6.72(dd,J＝11.6,4.3Hz,1H),6.17(t,J＝15.1Hz,1H),5.94(dd,J＝39.1,15.3Hz,2H),
5.54(s,2H),4.14(q,J＝7.2Hz,2H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ
165.02,162.10(d,J＝252.8Hz),161.77,152.47,150.09,147.97,145.20,143.95,137.62,
130.77(d,J＝8.8Hz),128.78,127.74,125.06,122.04(d,J＝9.7Hz),121.84,120.37(d,J＝24.7Hz),117.24,116.67,115.85(d,J＝21.1Hz),114.17,106.48,60.92,52.12,52.00,+
14.08；EI-MS:582.3[M+H] .
[0057] 实施例5.化合物5b的制备
[0058] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成2-氨基苯乙炔。黄色固体，收率：75％，熔点：148-151℃。
[0059]
[0060] 化合物5b波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.02(s,1H),7.78(d,J＝3.1Hz,1H),7.54(s,1H),7.45(d,J＝3.1Hz,1H),7.41–7.28(m,3H),7.23–7.15(m,2H),7.03(td,J＝
8.3,2.5Hz,1H),6.73–6.58(m,1H),6.17(d,J＝32.5Hz,1H),5.92(q,J＝15.4Hz,2H),4.13
13
(q,J＝7.1Hz,2H),3.77(s,2H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H)；C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.04,
162.08(d,J＝252.8Hz),161.82,152.60,150.06,147.41,146.88,143.93,137.66(d,J＝
3.4Hz),132.04,130.80(d,J＝8.8Hz),129.71,125.07,123.28,122.03(d,J＝9.7Hz),
121.70,120.34(d,J＝24.7Hz),116.10,115.82(d,J＝21.1Hz),114.69,112.34,106.33,+
60.90,52.12,52.00,14.08；EI-MS:582.3[M+H] .
8.3,2.5Hz,1H),6.73–6.58(m,1H),6.17(d,J＝32.5Hz,1H),5.92(q,J＝15.4Hz,2H),4.13
13
(q,J＝7.1Hz,2H),3.77(s,2H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H)；C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.04,
162.08(d,J＝252.8Hz),161.82,152.60,150.06,147.41,146.88,143.93,137.66(d,J＝
3.4Hz),132.04,130.80(d,J＝8.8Hz),129.71,125.07,123.28,122.03(d,J＝9.7Hz),
121.70,120.34(d,J＝24.7Hz),116.10,115.82(d,J＝21.1Hz),114.69,112.34,106.33,+
60.90,52.12,52.00,14.08；EI-MS:582.3[M+H] .
[0061] 实施例6.化合物5c的制备
[0062] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成2-乙炔吡啶。橙黄色固体，收率：74％，熔点194-197℃。
[0063]
[0064] 化合物5c波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(d,J＝4.8Hz,1H),8.39(s,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.84–7.71(m,2H),7.53(s,1H),7.43(d,J＝3.1Hz,1H),7.38(dd,J＝8.6,5.9Hz,1H),7.32(dd,J＝6.6,4.0Hz,1H),7.22(ddd,J＝7.5,4.9,1.1Hz,1H),7.04(td,J＝8.3,2.5Hz,1H),6.13(d,J＝2.4Hz,1H),5.95(dd,J＝31.5,15.3Hz,2H),4.14(q,J＝7.1Hz,2H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ164.97,162.08(d,J＝
252.7Hz),161.83,152.44,150.77,150.12,149.41,148.02,143.87,137.69(d,J＝3.5Hz),
136.81,130.81(d,J＝8.8Hz),125.04,123.71,122.61,122.02(d,J＝9.7Hz),120.45,
120.27,120.20,115.85(d,J＝21.1Hz),106.58,60.91,52.31,51.99,14.07；EI-MS:568.4[M+H]+.
252.7Hz),161.83,152.44,150.77,150.12,149.41,148.02,143.87,137.69(d,J＝3.5Hz),
136.81,130.81(d,J＝8.8Hz),125.04,123.71,122.61,122.02(d,J＝9.7Hz),120.45,
120.27,120.20,115.85(d,J＝21.1Hz),106.58,60.91,52.31,51.99,14.07；EI-MS:568.4[M+H]+.
[0065] 实施例7.化合物5d的制备
[0066] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成2-乙炔噻吩。橙黄色固体，收率：76％，熔点：108-110℃。
[0067]
[0068] 化合物5d波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99(s,1H),7.79(d,J＝3.1Hz,1H),7.52(s,1H),7.47(d,J＝3.1Hz,1H),7.44–7.39(m,1H),7.39–7.27(m,3H),7.08(dd,J＝
5.0,3.6Hz,1H),7.04(td,J＝8.3,2.6Hz,1H),6.13(s,1H),5.91(q,J＝15.5Hz,2H),4.21–
13
4.07(m,2H),1.17(t,J＝8.3Hz,3H)；C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.01,162.11(d,J＝
252.8Hz),161.77,152.38,150.07,143.96,142.38,137.61(d,J＝3.6Hz),133.53,130.78(d,J＝8.8Hz),127.64(d,J＝10.3Hz),125.04,124.72,123.91,122.04(d,J＝9.7Hz),
121.28,120.37(d,J＝24.6Hz),115.84(d,J＝21.0Hz),106.41,60.93,52.14,52.00,+
14.07；EI-MS:573.4[M+H] .
5.0,3.6Hz,1H),7.04(td,J＝8.3,2.6Hz,1H),6.13(s,1H),5.91(q,J＝15.5Hz,2H),4.21–
13
4.07(m,2H),1.17(t,J＝8.3Hz,3H)；C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.01,162.11(d,J＝
252.8Hz),161.77,152.38,150.07,143.96,142.38,137.61(d,J＝3.6Hz),133.53,130.78(d,J＝8.8Hz),127.64(d,J＝10.3Hz),125.04,124.72,123.91,122.04(d,J＝9.7Hz),
121.28,120.37(d,J＝24.6Hz),115.84(d,J＝21.0Hz),106.41,60.93,52.14,52.00,+
14.07；EI-MS:573.4[M+H] .
[0069] 实施例8.化合物5e的制备
[0070] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成苯乙炔。橙黄色固体，收率：71％，熔点：109-112℃。
[0071]
[0072] 化合物5e波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.07(s,1H),7.90(d,J＝1.3Hz,1H),7.88(s,1H),7.78(d,J＝3.1Hz,1H),7.54(s,1H),7.48–7.29(m,6H),7.03(td,J＝8.3,
2.6Hz,1H),6.13(s,1H),5.93(dd,J＝36.0,15.4Hz,2H),4.14(q,J＝7.1Hz,2H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.04,162.09(d,J＝252.8Hz),161.81,152.55,
150.06,147.33,137.65(d,J＝3.5Hz),131.14,130.80(d,J＝8.8Hz),128.91,128.81,
127.89,125.84,125.75,125.01,122.05(d,J＝9.7Hz),121.66,120.36(d,J＝24.6Hz),
115.82(d,J＝21.1Hz),106.41,60.91,52.13,52.01,14.08；EI-MS:567.4[M+H]+.[0073] 实施例9.化合物5f的制备
2.6Hz,1H),6.13(s,1H),5.93(dd,J＝36.0,15.4Hz,2H),4.14(q,J＝7.1Hz,2H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.04,162.09(d,J＝252.8Hz),161.81,152.55,
150.06,147.33,137.65(d,J＝3.5Hz),131.14,130.80(d,J＝8.8Hz),128.91,128.81,
127.89,125.84,125.75,125.01,122.05(d,J＝9.7Hz),121.66,120.36(d,J＝24.6Hz),
115.82(d,J＝21.1Hz),106.41,60.91,52.13,52.01,14.08；EI-MS:567.4[M+H]+.[0073] 实施例9.化合物5f的制备
[0074] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成4-氨基苯乙炔。橙黄色固体，产率：52％，熔点：123-127℃。
[0075]
[0076] 化合物5f波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(s,1H),7.78(d,J＝3.0Hz,1H),7.68(d,J＝8.2Hz,2H),7.52(s,1H),7.45(d,J＝2.8Hz,1H),7.40–7.34(m,1H),7.32(dd,J＝8.1,2.5Hz,1H),7.02(t,J＝9.1Hz,1H),6.74(d,J＝8.5Hz,2H),6.17(d,J＝29.7Hz,1H),
5.90(q,J＝15.2Hz,2H),4.13(q,J＝7.1Hz,2H),3.78(s,2H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.05,162.08(d,J＝252.6Hz),161.88,152.71,150.04,147.66(s),
146.26,143.91,137.64,130.81(d,J＝8.9Hz),126.96,125.01,121.98,121.74,120.35,
120.33(d,J＝24.6Hz),115.81(d,J＝21.1Hz),115.27,106.37,60.89,52.08,51.99,
14.08；EI-MS:582.3[M+H]+.
5.90(q,J＝15.2Hz,2H),4.13(q,J＝7.1Hz,2H),3.78(s,2H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.05,162.08(d,J＝252.6Hz),161.88,152.71,150.04,147.66(s),
146.26,143.91,137.64,130.81(d,J＝8.9Hz),126.96,125.01,121.98,121.74,120.35,
120.33(d,J＝24.6Hz),115.81(d,J＝21.1Hz),115.27,106.37,60.89,52.08,51.99,
14.08；EI-MS:582.3[M+H]+.
[0077] 实施例10.化合物5g的制备
[0078] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成丙炔酸。橙黄色固体，产率：72％，熔点：115-119℃。
[0079]
[0080] 化合物5g波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝0.7Hz,1H),7.80(d,J＝3.1Hz,1H),7.75(s,1H),7.52(s,1H),7.49(d,J＝3.1Hz,1H),7.39–7.28(m,2H),7.03(td,J＝8.3,2.6Hz,1H),6.13(d,J＝2.4Hz,1H),5.95(s,1H),5.90(s,1H),4.13(q,J＝7.1Hz,
2H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.00,162.08(d,J＝252.8Hz),
161.81,152.58,150.03,143.97,137.64(d,J＝3.5Hz),133.35,130.76(d,J＝8.8Hz),
125.23,124.90,122.03(d,J＝9.6Hz),120.34(d,J＝24.6Hz),115.80(d,J＝21.1Hz),
106.44,60.88,51.96,51.85,14.05；EI-MS:491.4[M+H]+.
2H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.00,162.08(d,J＝252.8Hz),
161.81,152.58,150.03,143.97,137.64(d,J＝3.5Hz),133.35,130.76(d,J＝8.8Hz),
125.23,124.90,122.03(d,J＝9.6Hz),120.34(d,J＝24.6Hz),115.80(d,J＝21.1Hz),
106.44,60.88,51.96,51.85,14.05；EI-MS:491.4[M+H]+.
[0081] 实施例11.化合物5h的制备
[0082] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成1-庚炔-3-醇。橙黄色固体，产率：61％，熔点：79-83℃。
[0083]
[0084] 化合物5h波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝3.1Hz,1H),7.76(s,1H),7.46(d,J＝2.9Hz,1H),7.39–7.25(m,2H),7.02(td,J＝8.3,2.3Hz,1H),6.13(s,1H),5.93(dd,J＝15.4,7.7Hz,1H),5.82(dd,J＝15.4,7.5Hz,1H),4.93(t,J＝6.5Hz,1H),4.11(q,J＝7.1Hz,2H),2.60(s,1H),1.99–1.84(m,2H),1.63–1.28(m,4H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H),
0.88(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:577.5[M+H]+.
0.88(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:577.5[M+H]+.
[0085] 实施例12.化合物5i的制备
[0086] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成N-炔丙基-(4甲基)苯甲酰胺。橙黄色固体，产率：47％，熔点：85-89℃。
[0087]
[0088] 化合物5i波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(s,1H),7.72(d,J＝8.1Hz,2H),7.70(d,J＝3.1Hz,1H),7.30(ddd,J＝15.0,7.8,5.2Hz,3H),7.20(d,J＝7.9Hz,2H),7.15(s,1H),7.00(td,J＝8.3,2.5Hz,1H),6.11(s,1H),5.89(dd,J＝40.6,15.7Hz,2H),4.76(d,J＝5.2Hz,2H),4.11(q,J＝7.1Hz,2H),2.37(s,3H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H)；EI-MS:638.3[M+H]+.
[0089] 实施例13.化合物5j1的制备
[0090] 操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成2,4,6-三甲基-N(2-丙炔基)苯磺酰胺。橙黄色固体，产率：61％，熔点：96-99℃。
[0091]
[0092] 化合物5j波谱数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝3.1Hz,1H),7.69(s,1H),7.51(d,J＝3.1Hz,2H),7.36–7.29(m,2H),7.04(td,J＝8.3,2.5Hz,1H),6.95(s,2H),6.12(d,J＝2.5Hz,1H),5.05(t,J＝6.0Hz,1H),4.25(d,J＝6.1Hz,2H),4.12(d,J＝7.1Hz,3H),
2.65(s,6H),2.31(s,3H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ164.94,162.09(d,J＝252.9Hz),161.70,152.26,150.06,144.00,142.94,142.34,139.11,137.63(d,J＝
3.5Hz),133.50,132.01,130.77(d,J＝8.8Hz),125.08,124.14,122.02(d,J＝9.7Hz),
120.35(d,J＝24.7Hz),115.85(d,J＝21.1Hz),106.36,60.89,58.31,51.97,38.34,22.98,
20.95,14.05；EI-MS:702.4[M+H]+.
2.65(s,6H),2.31(s,3H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ164.94,162.09(d,J＝252.9Hz),161.70,152.26,150.06,144.00,142.94,142.34,139.11,137.63(d,J＝
3.5Hz),133.50,132.01,130.77(d,J＝8.8Hz),125.08,124.14,122.02(d,J＝9.7Hz),
120.35(d,J＝24.7Hz),115.85(d,J＝21.1Hz),106.36,60.89,58.31,51.97,38.34,22.98,
20.95,14.05；EI-MS:702.4[M+H]+.
[0093] 实施例14.目标化合物的体外抗HBV细胞活性筛选试验
[0094] 测试原理
[0095] HBV转染的肝癌细胞HepG2.2.15细胞株，在进行细胞培养时能够分泌HBV病毒颗粒(包含HBsAg、HBeAg和DNA)。在抗HBV目标化合物的干预下，细胞分泌HBsAg的和HBeAg的含量和产生的DNA会有所变化，因此检测细胞分泌到培养上清中的HBsAg的和HBeAg的含量以及产生的HBV DNA，参照未加药对照组的含量，可以反映样品药物的抗病毒活性作用。以拉米夫定为阳性对照药，用酶联免疫法(ELISA)检测样品药物达到抑制病毒HBsAg的和HBeAg分泌的50％时的浓度数值为IC50；用聚合酶链反应(PCR)检测药物抑制HBV DNA复制量的50％时的浓度数值IC50；运用CCK-8检测样品药物导致50％细胞毒性死亡的数值浓度为CC50值；并计算出待测化合物的“选择系数”(selectivity index)，计算公式：SI＝CC50/IC50。
[0096] 测试方法
[0097] (1)细胞毒性实验
[0098] 配成实验所需样品储备浓度(100μmol/L)，每个样品用HepG2.2.15细胞培养液配制2个稀释浓度(20μmol/L和5μmol/L)进行初步活性筛选，设立空白对照并以拉米夫定作为的阳性对照药。加入96孔板细胞培养板，每浓度3复孔，每4天换同浓度药液并设无药细胞对照组，共培养9天。用CCK-8法检测细胞存活率，确定药物对HepG2.2.15细胞的毒性。对活性好的化合物用HepG2.2.15细胞培养液配制5个稀释浓度(50μmol/L和5μmol/L、0.5μmol/L、0.05μmol/L、0.005μmol/L)，设立空白对照并以拉米夫定作为的阳性对照药。加入96孔板细胞培养板，每浓度3复孔，每4天换同浓度药液并设无药细胞对照组，共培养9天。用CCK-8法检测细胞存活率，确定药物对HepG2.2.15细胞的毒性。
[0099] (2)抑制HBeAg和HBsAg抗原分泌实验
[0100] HepG2 2.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养8天(每4天换液一次)，收集上清液，用HBsAg和HBeAg诊断试剂盒(ELISA)检测HBsAg和HBeAg。
[0101] (3)抑制HBV DNA合成实验(PCR方法)
[0102] HepG2 2.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后，加入所配20μmol/L和5μmol/L含药培养液，继续培养8天(每4天换液一次)，收集上清液，用探针法进行PCR检测。
[0103] 表2.目标化合物抑制HBV DNA复制及细胞毒性的初步评价
[0104]
[0105]
[0106]
[0107] 如表2所示，对所合成的13个化合物进行了体外抗HBV活性评价，通过CCK-8法测定了20μM和5μM药物浓度下细胞的死亡率；同时，通过PCR法测定了20μM和5μM药物浓度下抑制HBV DNA复制活性。
[0108] 初步活性筛选结果表明，在20μM浓度下，化合物3、4、5b、5c、5f、5h和5i都表现了较大的细胞毒性，且大部分化合物抑制HBV DNA复制活性的抑制率大于50％，与拉米夫定的活性相当，因此又进行了浓度为5μM的初步活性筛选。实验结果表明，在5μM浓度下，所有的化合物都表现了较低的细胞死亡率，且接近或低于先导化合物GLS4和阳性药物拉米夫定的细胞毒性；另外，目标化合物5a和5g表现了相对较好的抑制HBV DNA复制活性，其抑制率分别为59.9±2.0和68.2±6.8，分别相当于和优于阳性药物拉米夫定(59.4±1.8)，但弱于先导化合物GLS4的抑制HBV DNA复制活性(83.7±1.6)，可以进一步活性研究。
[0109] 表3.活性化合物、先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定抗乙肝病毒活性[0110]
[0111]
[0112] 如表3所示，根据初步筛选的结果，对初筛的目标化合物5a和5g进一步的体外抗HBV活性评价，通过CCK-8法测定了药物在不同浓度下的细胞毒性；通过PCR法测定了药物在不同浓度下抑制HBV DNA复制活性；同时，通过酶联免疫法测定了药物在不同浓度下对HBsAg和HBeAg抗原的分泌抑制活性。选择先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定为阳性对照，每个化合物设置五个浓度梯度(50μM，5μM，0.5μM，0.05μM和0.005μM)，分别计算出半数抑制浓度CC50、IC50和选择性系数SI。
[0113] 活性结果表明，目标化合物5a表现了较小的细胞毒性，其CC50大于50μM，明显优于先导化合物GLS4(22.4±2.1μM)；另外，还表现了较好的抑制HBV DNA复制活性，其IC50为0.35±0.04μM，优于上市药物拉米夫定(0.54±0.18μM)，弱低于GLS4(0.13±0.05μM)；5a抑制HBV DNA复制的选择性系数(SI)大于143，优于或相似于先导化合物GLS4(22.4±2.1μM)和上市药物拉米夫定(>93)但是，未表现抑制HBsAg和HBeAg分泌活性。化合物5g表现了一定的细胞毒性，其CC50为20.9±1.2μM，略高于先导化合物GLS4和拉米夫定；另外，也表现了一定的抑制HBV DNA复制的活性，其IC50为0.86±0.32μM，与GLS4和拉米夫定在同一数量级；可能因为其细胞毒性，表现了微弱的抑制HBsAg和HBeAg分泌活性，其IC50分别为16.5±0.42μM和14.2±0.85μM，因此需要进一步的修饰研究。