变形链球菌CAT-SYI抗原及抗体

摘要

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种变形链球菌CAT‑SYI抗原及抗体。所述抗原由变形链球菌表面毒力蛋白抗原葡糖基转移酶GtfB和葡聚糖结合蛋白GbpB的功能区串联形成，所述抗体由该抗原制备得到。CAT‑SYI抗原由两个氨基酸片段(CAT和SYI)以及连接两个氨基酸片段的linker组成。将变形链球菌的毒力基因gtfB和gbpB经linker连接得到串联基因CAT‑SYI，首次制备得到CAT‑SYI抗原，由该抗原作为疫苗进行免疫，制备得到CAT‑SYI抗体。经动物实验发现所述CAT‑SYI抗体，与针对单个毒力基因以及全菌的抗体相比有更好的抗龋效果。证实CAT‑SYI抗原可作为基因工程龋齿疫苗的候选抗原,CAT‑SYI抗体可用于牙膏等日用品中或药物中以达到抗龋目的，具有良好的应用前景。

权利要求

1.CAT-SYI抗原，其特征在于，所述CAT-SYI抗原由两个氨基酸片段连接而成，氨基酸序列依次分别为：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2；

所述两个氨基酸片段的linker氨基酸序列为：SEQ ID NO:3。

2.权利要求1所述的抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①设计引物：选择GenBank上公布的GenBank号为AE014133.2的变形链球菌标准菌株UA159基因组DNA为模版，设计CAT区域和SYI区域的引物，在CAT引物的R链加上linker的碱基序列，SYI引物的F链加上linker的碱基序列；

②SOE-PCR扩增串联基因CAT-SYI：降落PCR分别扩增CAT和SYI，产物纯化后作为下一步SOE-PCR的模板，SOE-PCR扩增得到串联基因，纯化产物即为目的片段；

③构建重组质粒：双酶切目的片段和质粒载体，酶切产物连接获得重组质粒；

④重组质粒转化感受态细胞并筛选；

⑤IPTG诱导重组蛋白表达并检测；

⑥纯化重组蛋白，得到CAT-SIY抗原。

说明书

变形链球菌CAT-SYI抗原及抗体

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及变形链球菌的CAT-SYI抗原及抗体。

背景技术

[0002] 龋病(dental caries)，俗称蛀牙，是由细菌代谢碳水化合物产酸，而引起牙齿脱矿化的的一种传染性疾病。由于牙釉质层和牙本质层的不可再生性，因而龋病不会自行愈合，如果不予治疗，龋病就会一直发生直到整颗牙齿被破坏。龋齿呈现黄色至黑色之间的颜色，患者会有疼痛并进食困难等症状，以及引发牙周炎、牙龈肿痛、牙龈出血、牙齿脱落等并发症。2017年J Dent Res杂志报道全球的未接受口腔治疗的龋病患者数量由1990年的25亿人到2015年便上升至了35亿人，并且这个数目还将持续增长。在2010年，由全球口腔疾病引起的直接经济支出就有2980亿美元，大约占了全球卫生总支出的4.6％，再由世界卫生组织(WHO)和国家公共卫生研究所(PZH)的提供的数据显示，全球已有60％-90％的青少年遭受着龋病的影响。人类龋病的历史非常久远，早在16-65万年前就有了龋齿的痕迹，1900s人们才认识到龋病是由变链菌群和乳酸菌群类细菌引起的，但还不明确主要是哪一种细菌导致的，直到1924年才由Clarke首次分离并命名了龋病的主要致病菌“变形链球菌”。

[0003] 变形链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)简称变链菌，被认为是引起龋病的主要致病菌之一，并且在口腔中其检出率高达74％-94％，变形链球菌为革兰氏阳性兼性微需氧菌，属于乳杆菌科-口腔链球菌属-变形链球菌菌群(mutans steptococci)，变形链球菌群中包含远缘链球菌、猕猴链球菌、野鼠链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、道恩链球菌以及变形链球菌七个种。

[0004] 变形链球菌一共有c、e、f、k四种血清型，k型菌株是日本学者Nakana于2004年新发现的一种血清型，该血清型菌株在心内膜炎、菌血症以及动脉粥样硬化斑块患者血液中的检出率较高，此外，Bae J S等和Naka S等的研究发现k型菌株除了引起龋病外，还参与非酒精性脂肪肝的形成，并且黏连蛋白Cnm和SpaP参与该疾病的形成。在糖蛋白多糖组成上，c、e、f型菌株的多糖主链为鼠李糖，侧链为葡萄糖，k型菌株的多糖主链为鼠李糖，无侧链。在rgpF-ORF12基因上四种血清型基因序列有差异，因此可通过PCR法鉴定菌株的血清型。目前，c型是口腔中检出率最高的血清型，占70％-80％，其次是e型，占20％，而f型和k型在口腔中的检出率最低，比例<2-5％。虽然k型在口腔中的比例很低，最近几年有文献报道非c型的比例有上升趋势。

[0005] 变形链球菌的三大致病因子是形成生物膜、产酸和耐酸，其致龋过程由三个阶段组成，第一阶段是菌株“定植”于牙表面，该定植初期是由非蔗糖依赖型黏附蛋白SpaP介导的；第二阶段是细菌的“聚集”，这个阶段是由SpaP、Gtfs和Gbps介导的，Gtfs水解多糖为单糖，再分别催化α-1,3糖苷键和α-1,6糖苷键聚合成水溶性和水不溶性的葡聚糖；第三阶段是“生物膜的形成”，该阶段中大量葡聚糖与SpaP、Gbps、Gtfs等蛋白发生结合，相互作用下细菌大量聚集，在牙齿表面形成一层产酸的生物膜，即牙菌斑。以变形链球菌群为主的细菌代谢口腔中的糖类大量产酸，引起牙釉质层“脱矿化”与“再矿化过程”的失衡(Ca10(PO4)6(OH)2+14H+→10Ca2++6H2PO4－+H2O)，当牙表面微环境pH值<5.4就会使得牙釉质层脱矿化，最终龋齿形成。由于变形链球菌具有较其他口腔细菌更强的产酸和耐酸能力，因而更能适应pH值较低的酸性环境，是其更易成为口腔中主要的致龋菌。

[0006] 对于龋齿的治疗主要通过“阻止脱矿化过程-针对致病菌”和“促进再矿化过程”这两方面进行。“阻止脱矿化过程-针对致病菌”的方式有以下几种：化学药物类如青霉素、万古霉素、氯已定、SDS、三氯生等；天然药物类如茶树油、绿茶、蜂蜜等；抗菌肽：对广谱细菌种类(包括耐药菌株)具有强烈的杀伤作用；糖替代品类如木糖醇、山梨醇可添加至口香糖用于防龋；以及本发明所涉及的免疫防龋。免疫防龋包括“主动免疫防龋”和“被动免疫防龋”两方面，“主动免疫防龋”是指将灭活变形链球菌、表面抗原蛋白、多肽片段、DNA等制成可以使机体产生特异性免疫反应的生物制品，从而使机体获得免疫保护。目前变形链球菌的表面蛋白如黏附蛋白SpaP、葡聚糖结合蛋白Gbps、葡糖基转移酶Gtfs这三大类已被证实能够激起机体的粘膜免疫应答并产生特异性IgA。“被动免疫防龋”是指通过向牛或鸡注射抗原，再从牛奶、蛋黄中获得特异性抗体，再将抗体直接用于龋病治疗的一种新途径。通过被动免疫治疗可使机体立即获得特异性抗体，并且直接靶向于目标抗原。已经有较多关于免疫防龋的文献报道其作用。

[0007] SpaP的A区包含唾液蛋白结合区(SBR)，Hajishengallis G等通过大肠杆菌原核表达SBR功能区域，制备抗原并免疫大鼠，在大鼠体内激起了T细胞的免疫应答，并产生了特异性抗体，在动物体内获得了免疫抑龋的保护作用。2014年Batista M T等分别通过大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表达SpaP39-512抗原蛋白，制备抗原免疫大鼠，有效抑制了大鼠口腔中变形链球菌的定植。

[0008] 2008年R.D.Nogueira等通过黏膜免疫SD大鼠GtfB的CAT和GLU片段，激起了黏膜免疫应答并产生了特异性IgA抗体，获得了免疫抑龋的效果。2012年Kim M A等原核表达GtfB的N段抗原(gtfB193-1530)，免疫BALB/c小鼠，从脾脏细胞分离出的产特异性抗体的细胞并与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出分泌抗GtfB抗体的单克隆杂交瘤细胞。制备出的单克隆抗体在体外实验中能够有效抑制GtfB的酶活性。

[0009] 2001年Smith通过阴离子交换层析从变形链球菌的培养上清液中纯化GbpB蛋白，制得的特异性卵黄抗体饲喂SD大鼠取得了较好的抑龋效果。

[0010] 国内学者杨德琴等通过体外PCR扩增变形链球菌的spaP和gtfB基因，并构建pcDNA3-spaP和pcDNA3-gtfB核酸疫苗免疫大鼠，结果表明混合疫苗取得了与全菌疫苗相同的抑龋效果。2013年Li Huang等将spaP基因(A区和P区功能区)与gtfB基因的GLU功能区串联，构建真核质粒，并制备DNA疫苗PGJA-P/VAX，免疫Wistar大鼠，该DNA疫苗在Wistar大鼠体内激起黏膜免疫应答，体外实验表明，大鼠唾液中分泌的IgA能抑制变形链球菌在唾液包被羟基磷灰石上的黏附。

[0011] 专利CN102488898A公开了一种用于由变形链球菌感染所造成的龋齿的疫苗组合物，该疫苗组合物包括从变形链球菌表面蛋白PAC派生的抗原和从鞭毛素派生的佐剂。并且提供制备疫苗组合物的方法。

[0012] 专利CN102973939A公开了一种抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂，其特征在于，由10～70重量份的变形链球菌菌体和菌体碎片与30～90重量份的远缘链球菌菌体和菌体碎片混合成抗原免疫产蛋母鸡而制备。该发明用于预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭的牙膏对预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭病菌具有明显的效果。

[0013] 目前，用于预防龋齿的疫苗多是特异性针对单个变形链球菌毒力基因或者针对全菌，而特异性针对两个或以上毒力基因的功能区域制备的疫苗较少，并且其可能会有更加显著的抗龋效果。

[0014] 因此开发一种GtfB功能区域CAT与GbpB功能区域SYI串联形成的新抗原CAT-SYI及其抗体，并且体外实验表明，所述CAT-SYI抗体与针对单个毒力基因以及全菌的抗体相比有更好的抗龋效果。证实CAT-SYI抗原可作为基因工程龋齿疫苗的候选抗原,CAT-SYI抗体可用于牙膏等日用品中或药物中以达到抗龋目的，具有良好的应用前景。

发明内容

[0015] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种CAT-SYI抗原，所述抗原由变形链球菌表面毒力蛋白抗原葡糖基转移酶GtfB和葡聚糖结合蛋白GbpB的功能区串联形成。

[0016] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0017] 变形链球菌利用其表面蛋白而黏附于牙齿表面，主要的表面蛋白包括粘附蛋白SpaP、葡聚糖转移酶GtfB、葡聚糖结合蛋白GbpB，这些蛋白能促进细菌黏附与牙齿表面，进而形成生物膜，并代谢碳水化合物产酸腐蚀牙齿。如果能阻止细菌的黏附，那么就会抑制生物膜的形成，进而预防龋齿的形成。

[0018] 现有研究已经证实上述三种表面蛋白的特异性抗体均有抗龋效果。

[0019] 本发明提供一种CAT-SYI抗原，其特征在于，所述CAT-SYI抗原由两个氨基酸片段连接而成，氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2。所述氨基酸片段是GtfB以及GbpB的两个功能区域，分别为CAT和SYI。克隆得到对应的两DNA片段并用linker连接起来，通过基因工程技术，将串联序列在细胞中表达得到重组蛋白，即为CAT-SYI抗原。

[0020] 两串联基因之间通过linker连接，作为优选的方案，linker的氨基酸序列为三组重复氨基酸链，其序列为：SEQ ID NO:3，是连接两蛋白的一段富含甘氨酸的柔性链，氨基酸对应密码子设计为大肠杆菌BL21(DE3)的偏好密码子。

[0021] 本发明的目的之二在于提供一种由CAT-SYI抗原制备得到的CAT-SYI抗体。

[0022] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0023] 采用CAT-SYI抗原进行免疫，可制备得到特异性抗体，即CAT-SYI抗体。

[0024] 作为优选的方案，所述CAT-SYI抗体为卵黄抗体。

[0025] 本发明的目的之三在于提供一种CAT-SYI抗原的制备方法。

[0026] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0027] CAT-SYI抗原的制备方法包括以下步骤：

[0028] ①设计引物：选择GenBank上公布的变形链球菌标准菌株UA159基因组DNA为模版，设计CAT区域和SYI区域的引物，在CAT引物的R链加上linker的碱基序列,SYI引物的F链加上linker的碱基序列；

[0029] ②SOE-PCR扩增串联基因CAT-SYI：降落PCR分别扩增CAT和SYI，产物纯化后作为下一步SOE-PCR的模板。SOE-PCR扩增得到串联基因，纯化产物即为目的片段。到的目的片段CAT-SYI为gtfB的CAT区域和gbpB的SYI区域串联形成，两串联基因之间通过linker连接。

[0030] ③构建重组质粒：双酶切目的片段和质粒载体，酶切产物连接获得重组质粒；

[0031] ④重组质粒转化感受态细胞并进行筛选；

[0032] ⑤IPTG诱导重组蛋白表达并检测；

[0033] ⑥纯化重组蛋白，得到CAT-SIY抗原。

[0034] 作为优选的方案，所述linker的氨基酸序列为三组重复氨基酸链，其序列为：SEQ ID NO:3，是连接两蛋白的一段富含甘氨酸的柔性链，氨基酸对应密码子设计为大肠杆菌BL21(DE3)的偏好密码子。

[0035] 作为优选的方案，所述的感受态细胞为大肠杆菌BL21感受态细胞，同时linker的氨基酸序列对应密码子设计为大肠杆菌BL21的偏好密码子。

[0036] 作为优选的方案，所述的IPTG诱导剂终浓度为0.25mM，诱导温度为30℃，时间为6-8h。

[0037] 作为优选的方案，分别进行亲和层析和包涵体复性两种途径来纯化重组蛋白蛋白。

[0038] 本发明的目的之四在于提供一种CAT-SYI抗体的制备方法。

[0039] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0040] CAT-SYI抗体的制备方法，包括以下步骤：

[0041] ①将得到的CAT-SYI抗原制备疫苗并用来免疫；

[0042] ②从被免疫个体中提取特异性抗体。

[0043] 作为优选的方案，所述被免疫个体为产蛋鸡，所述特异性抗体为卵黄中提取的特异性卵黄抗体IgY。

[0044] 本发明的目的之五在于提供CAT-SYI抗原在用于制备治疗龋齿的药物的用途。

[0045] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0046] CAT-SYI抗原可用于制备治疗龋齿的药物或作为基因工程龋齿疫苗的候选抗原，所述抗原可以用于主动免疫防龋的药物的制备。

[0047] 本发明的目的之六在于提供CAT-SIY抗体在用于制备治疗龋齿的药物的用途。

[0048] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0049] CAT-SIY抗体可用于制备治疗龋齿的药物。CAT-SIY抗体可以用于被动防龋，所述抗体可以用于被动免疫防龋的药物的制备。

[0050] 本发明的目的之七在于提供制备CAT-SYI抗原过程中的重组质粒在用于制备治疗龋齿的药物的用途。

[0051] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0052] 制备CAT-SYI抗原过程中的重组质粒可用于制备治疗龋齿的药物或疫苗，即所述重组质粒可以用于主动免疫防龋的药物的制备。

[0053] 本发明的目的之八在于提供一种用于治疗龋齿的药物，该药物可用于免疫防龋。

[0054] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0055] 一种用于治疗龋齿的药物，其特征在于，所述药物为CAT-SYI抗体以及赋予它的药学的载体。

[0056] 进一步，为了探究CAT-SYI抗体的抑龋效果如何，进行了CAT-SYI抗体的龋齿模型动物实验研究。饲料为Diet-2000高糖致龋饲料，将变形链球菌血清型c菌液注入SD大鼠口腔以感染大鼠，并根据分组饲喂抗体。最后进行龋齿的Keyes计分。采用了六种抗体，分别是抗GtfB、GbpB、SpaP、CAT-SYI、全菌疫苗的特异性抗体，以及未经免疫的对照抗体。

[0057] 本发明的有益效果在于：

[0058] 1)本发明提供的CAT-SYI抗原是一种串联抗原，将两个变形链球菌的表面蛋白功能区通过linker串联起来。该新型抗原的研发对于抑制变形链球菌提供新的可行性方案。

[0059] 2)本发明提供CAT-SYI抗原及抗体的制备方法，通过该方法制备的CAT-SYI重组质粒、抗原及抗体，为免疫防龋的药物的开发提供了更多可能。

[0060] 3)本发明提供的CAT-SYI抗体具有比单基因蛋白的抗体更好的抑龋效果，为免疫防龋的日用品及药物制备，提供了更好的材料。

附图说明

[0061] 图1为SOE-PCR扩增CAT-SYI原理图。

[0062] 图2为SOE-PCR扩增DNA片段核酸电泳图。图注：a中1泳道为CAT-linker，2泳道为linker-SYI；b中CAT-SYI为串联基因DNA，M为标准DNA marker。

[0063] 图3为重组质粒图谱。

[0064] 图4为重组质粒转入T10感受态细胞后的菌落PCR电泳图。图注：M为标准DNA marker。

[0065] 图5为重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。图注：a中空载体pET32a；b中重组融合蛋白GtfB；c中重组融合蛋白GbpB；d中重组融合蛋白SpaP；e中重组融合蛋白CAT-SYI；M为标准蛋白marker。

[0066] 图6为重组蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳图。图注：a中GtfB、GbpB、SpaP三种融合蛋白；b中CAT-SYI融合蛋白，M为标准蛋白marker。

[0067] 图7为纯化后的重组蛋白SDS-PAGE电泳图。图注：a中GtfB融合蛋白，约35KDa；b中GbpB融合蛋白，约70KDa；c中SpaP融合蛋白，约80KDa，M为标准蛋白marker。

[0068] 图8为卵黄抗体SDS-PAGE电泳图。图注：1、2、3、4泳道分别为GtfB、GbpB、SpaP、CAT-SYI的卵黄抗体水粗提取物，M为标准蛋白marker。

[0069] 图9为抗体效价的ELISA检测结果。图注：a中GtfB卵黄抗体；b中GbpB卵黄抗体；c中SpaP卵黄抗体；d中CAT-SYI卵黄抗体；圆形点的曲线代表对照组，为非变形链球菌抗原，方形点的曲线代表重组蛋白。

[0070] 图10为SD大鼠龋齿图。图注：a中空白抗体对照组；b中全菌疫苗抗体对照组组；c中GtfB抗体实验组；d中CAT-SYI抗体实验组；e中GbpB抗体实验组；f中SpaP抗体实验组。

[0071] 图11为龋齿计分图。图注：1为对照组；2为全菌组；3为GtfB组；4为CAT-SYI组；5为GbpB组；6为SpaP组；黑色圆点代表一只SD大鼠龋齿的Keyes计分值，条形柱状图为计分均值。

具体实施方式

[0072] 以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

[0073] 一基因扩增

[0074] 串联基因CAT-SYI扩增方法如下：

[0075] 1.引物设计

[0076] 选择GenBank上公布的变形链球菌标准菌株UA159(AE014133.2)基因组DNA为模版，设计CAT区域和SYI区域的引物。CAT-SYI为gtfB的CAT区域和gbpB的SYI区域(MHCⅡ分子结合区)741bp(CAT 300bp连接linker 45bp再连接SYI 396bp一共741bp)，两串联基因之间通过一段45bp的linker连接，linker的氨基酸序列为三组重复氨基酸链，序列为：SEQ ID NO:3，是连接两蛋白的一段富含甘氨酸的柔性链，氨基酸对应密码子设计为大肠杆菌BL21(DE3)的偏好密码子。在CAT引物的R链加上linker的碱基序列，其引物序列为：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:4。SYI引物的F链加上linker的碱基序列，引物序列为：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

[0077] 2 SOE-PCR扩增串联基因CAT-SYI(见图1)

[0078] (1)降落PCR分别扩增CAT和SYI

[0079] 由于两对引物Tm值相差较远，因此选择降落PCR来完成两段DNA的扩增，PCR反应体系如下：dNTPmix 4μL，10×buffer 4μL，50ng/μL的DNA 1μL，20uM的上游和下游引物各0.5μL，Pfu聚合酶0.4μL，加水至40μL。PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性1min，65℃退火40s，72℃延伸1min 40s，扩增19个循环；95℃预变性1min，50℃变性40s，72℃延伸1min 
40s，扩增16个循环，72℃终延伸5min。产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，试剂盒纯化目的片段，作为下一步SOE-PCR的模板。

[0080] (2)SOE-PCR扩增CAT-SYI

[0081] SOE-PCR扩增CAT-SYI，PCR反应体系：dNTPmix 4μL，10×buffer 4μL，CAT和SYI模板各0.5μL，Pfu聚合酶0.4μL，加水至40μL。PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性1min，65℃退火40s，72℃延伸1min 40s，扩增5个循环结束后，加入20uM上游和下游引物各0.5μL，PCR程序同上继续扩增25个循环。纯化产物即为目的片段。见图2。

[0082] 变形链球菌三种主要表面蛋白单基因扩增方法如下：

[0083] 1引物设计

[0084] 选择GenBank上公布的变形链球菌标准菌株UA159(AE014133.2)基因组DNA为模版进行引物设计。选取目的基因的功能区，其中gtfB包含CAT区域(水解蔗糖催化区)300bp，其引物为：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；gbpB为全长DNA序列为1296bp，其引物为：SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；spaP包含与唾液蛋白结合的区域(A-region)1422bp，其引物为：SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。

[0085] 2 PCR扩增单基因

[0086] 通过常规PCR扩增gtfB、gbpB、spaP三种基因的DNA片段，反应体系如下：dNTPmix 4μL，10×buffer 4μL，50ng/μL的DNA 1μL，20uM的正向和反向引物各0.5μL，Pfu聚合酶0.4μL，加水至40μL。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性1min，52℃退火45s，72℃延伸(gtfB 1.5，min，gbpB 3.0min，spaP 3.5min)，扩增30个循环，72℃终延伸5min。产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，试剂盒纯化目的片段。

[0087] 二重组质粒的构建

[0088] 1双酶切

[0089] 按照下述体系分别向EP管中加入对应反应物，37℃静置酶切2.5h。gtfB、spaP、CAT-SYI酶切体系如下：CutSmart buffer 2μL，DNA片段200ng，EcoRΙ-HF和XhoΙ限制性内切酶各0.3μL，加ddH2O至30μL。双酶切gbpB体系如下：CutSmart buffer 2μL，DNA片段200ng，EcoRΙ-HF和SalΙ-HF限制性内切酶各0.3μL，加ddH2O至30μL。本实验选择pET32a质粒作为载体，pET32a载体包含氨苄青霉素的抗性基因位于载体的第4450-5360位碱基，质粒双酶切pET32a载体质粒体系如下：CutSmart buffer 3μL，pET32a 100ng，EcoRΙ-HF和SalΙ-HF(XhoΙ)限制性内切酶各0.3μL，加ddH2O至50μL。酶切反应后，将所有酶切产物于80℃水浴灭活5min，以使内切酶失活，而不影响后面的连接反应。核酸电泳检测四种酶切目的基因片段及酶切质粒浓度，四种酶切产物。

[0090] 2构建重组质粒

[0091] 将上述酶切片段，按照下述体系进行连接：目的片段(gtfB、gbpB、spaP、CAT-SYI)250ng，pET32a 120ng，buffer 2μL，T4连接酶0.5μL，补水至30μL，将连接体系用枪头轻轻混合均匀，放置于16℃连接过夜。重组质粒图谱见图3。

[0092] 三重组质粒转化感受态细胞

[0093] 1转化T10感受态细胞

[0094] (1)取-80℃保存的菌种，在超净台中一次活化菌种，即将大肠杆菌TOP10接种于LB液体培养基中于摇床中培养过夜，温度37℃，转数220rpm。取一次活化菌液，按1:100的体积比二次活化菌种，当OD600值＝0.3-0.5之间时，停止培养。将菌液和0.1M CaCl2同时冰浴30min，取1.0mL菌液，5,000rpm离心3min，弃上清，加1mL CaCl2重悬(一定要轻轻吹悬)，冰浴20min，5,000rpm离心3min，弃上清。加100μL CaCl2重悬(更轻重悬)，即得到感受态细胞，冰浴3h待用。其余加入终浓度为30％的甘油，分装至1.5mL离心管，于-80℃保存，备用。

[0095] (2)连接产物转入TOP10感受态细胞

[0096] 在超净台内操作，取100mL的TOP10感受态细胞并分别加入上述连接产物30μL，用移液枪轻轻吹悬混匀，冰浴放置20min，42℃热激90s，立即冰浴3～5min。全部涂布于含氨苄青霉素钠的LB平板。37℃正放15min，再倒放12-16h，观察结果。

[0097] 2筛选及测序

[0098] (1)筛选：

[0099] 挑取8～10颗单菌落，扩大培养于含氨苄青霉素的1.5mL离心管中(氨苄青霉素：LB液＝1:1,000)，扩大培养4～6h。8000rpm离心3min，弃上清，加入1mL灭菌水重悬菌体，8000rpm离心3min，弃上清，加入1.0mL灭菌水重悬，作为PCR模板，备用。PCR体系：2×Taq PCR Mix 5μL，菌液1.0μL，20uM的正向和反向引物各0.5μL，加水至20μL。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性1min，53℃退火45s，72℃延伸1.0min，扩增30个循环，72℃终延伸
5min。产物使用1％的琼脂糖凝胶电泳来检测。见图4。

[0100] (2)重组质粒提取：

[0101] ①取菌液3mL，分两次离心。8,000×g离心2min收集菌体。吸干培养基；

[0102] ②在菌体沉淀中加入250μL的buffer P1，吸打或震荡至到彻底悬浮菌体；

[0103] ③加入250μL buffer P2，立即温和地颠倒离心管5-10次混匀。室温放置2-4min；

[0104] ④加入350μL buffer P3，立即温和地颠倒离心管5-10次混匀，此时离心管中出现大量白色絮状沉淀；

[0105] ⑤在离心机最大转速12,000×g下，离心5-10min，将上清全部移入吸附柱中，9000×g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

[0106] ⑥向吸附柱中加入500μL wash buffer，9,000×g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入至同一个收集管中；

[0107] ⑦重复步骤⑥一次；

[0108] ⑧将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000×g离心1min，再开盖晾2min使乙醇充分挥发；

[0109] ⑨在吸附柱中央加入50-100μL elution buffer，室温静置1-2min，9,000×g离心1min，将所得到的质粒DNA溶液于-20℃保存。elution buffer可以37-60℃预热可以进一步提高得率；

[0110] 将上述抽提的质粒，取2.5μL进行1％核酸电泳检测，凝胶成像分析系统拍照记录。

[0111] (3)测序：重组质粒寄送华大基因进行测序。

[0112] 2重组质粒转化BL21感受态细胞

[0113] 将提取的四种重组质粒取1μL加入50μL BL21感受态细胞，转化TOP10感受态细胞，具体步骤同上述转化T10感受态细胞。

[0114] 四IPTG诱导重组蛋白的表达

[0115] 1诱导

[0116] 挑取BL21单克隆菌接种于含5mL的LB液体培养基中，加入氨苄青霉素的终浓度为50mg/L，培养于恒温摇床，温度37℃，转数200rpm。当菌液OD600值＝0.6时，加入终浓度为
0.25mM的IPTG诱导剂，温度降低至30℃，转数150rpm，继续培养6-8h。

[0117] 2 SDS-PAGE检测

[0118] (1)样品的处理和电泳设置

[0119] 取1mL诱导表达的菌体于1.5mL离心管中，5,000rpm离心1min，去离子水洗涤2次。向菌体沉淀中加入20μL去离子水和20μL上样buffer，沸水浴5min，再冰浴5min，12,000rpm离心2min，取上清液用于SDS-PAGE电泳检测，电泳程序设置为恒流18mA，并将蛋白marker点样至最左边，当溴酚兰电泳至分离胶底部时结束电泳。

[0120] (2)SDS-PAGE凝胶的染色和脱色

[0121] 将凝胶从两玻璃板间小心地剥离开，用去离子水洗涤凝胶一次，把凝胶转入培养皿并加入考马斯亮蓝染液，放入37℃摇床50rpm染色45min。将染液回收，并用去离子水洗涤2～3次，加入脱色液，沸水浴10min，期间可更换脱色液，直到观察到清晰的蛋白条带为止。
见图5。

[0122] 3重组融合蛋白的表达形式鉴定

[0123] 通过SDS-PAGE凝胶电泳分别检测四种重组菌超声破菌离心后的上清和沉淀中的蛋白质成分，见图6。GtfB主要以可溶性形式表达，可采取亲和层析纯化方式，GbpB主要以包涵体形式表达重组蛋白，需进行包涵体复性处理后再纯化，而SpaP和CAT-SYI具有可溶性和包涵体两种表达形式，需要分别进行亲和层析和包涵体复性两种途径来纯化该蛋白。

[0124] 五重组蛋白的纯化

[0125] 1细胞裂解

[0126] 将诱导表达菌液收集500mL，5,000rpm离心5min，弃上清，用去离子水洗涤3次，离心同上。向菌体沉淀中加入1×纯化buffer 30mL，加入500μL溶菌酶(浓度为50mg/mL)，充分混匀，4℃放置2.5h，期间摇晃数次。在-20℃冰箱反复冻融4次，每次30min，10,000rpm低温离心10min，超声破菌(设置功率为2档，每次超声5s，间隔10s)，直到菌液澄清不粘稠，并将上清及沉淀分别进行SDS-PAGE电泳检测，以确定重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达情况。

[0127] 2包涵体的复性

[0128] (1)包涵体的变性，首先用含0.1％Triton和2M尿素的PBS 50mL重悬洗涤包涵体沉淀；10,000rpm低温离心10min，用含2M尿素的PBS 50mL重悬沉淀，重复洗涤2次(去杂蛋白)；10,000rpm低温离心10min，用含8M尿素的Tris缓冲液溶解包涵体(观察液体是否变得粘稠)，室温溶解20min；10,000rpm低温离心10min，收集上清，取10μL用于SDS-PAGE电泳检测；

[0129] (2)透析袋的准备，将透析袋用50％乙醇沸水浴10min，用去离子水将其洗净，最后用超纯水将透析袋里面冲洗5次，外面冲洗3次，放入超纯水中备用；

[0130] (3)变性蛋白的梯度复性，即将上述包涵体的变性上清液移入透析袋进行梯度透析复性，最初的透析液为含6M尿素的Tris缓冲液，之后取出部分透析液并加入新的Tris缓冲液，按如下梯度6M(6h～8h)，4M(6h～8h)，2M(6h～8h)，1.5M(4h)依次进行梯度复性。复性结束后将透析袋转入5％甘油的PBS中透析4h，以除去尿素等杂质，最后在5％甘油的超纯水中透析过夜，温度为4℃。将透析后的蛋白质于10,000rpm离心10min，收集上清并冷冻干燥浓缩蛋白。

[0131] 3镍柱亲和层析纯化可溶性蛋白

[0132] 琼脂糖吸附树脂的前处理，具体步骤如下：

[0133] (1)打开柱帽使酒精完全流出；

[0134] (2)加入8mL灭菌水重悬，4℃放置5min；

[0135] (3)沉淀树脂(垂直)5～10min，流出洗液，重复3次(打开上下帽)；

[0136] (4)加6mL binding buffer；

[0137] (5)加6mL binding buffer，沉淀树脂，流出液体(打开上下帽)；

[0138] (6)重复(4)，(5)共三次。

[0139] 亲和层析的具体操作步骤如下：

[0140] (1)在柱中加10mL细胞裂解液，重悬树脂，4℃放置2h，打开上下帽，收集流出物，待柱中液体流尽后，加入10mL细胞裂解液处理同前，直至加完细胞裂解液，将收集的流出液再过同一根柱子三遍；

[0141] (2)加入8mL wash buffer重悬树脂，4℃静置平放5min，打开帽子流尽洗液；

[0142] (3)重复步骤(2)3～4次；

[0143] (4)在纯化柱内加入5mL Elution buffer，打开帽子，收集流出物；

[0144] (5)将步骤(4)收集的流出物装入透析袋后，在5％甘油的PBS中透析4h，最后在5％甘油的超纯水中透析过夜。并将透析后的蛋白液通过冷冻干燥浓缩；

[0145] (6)在进行步骤(5)时，进行纯化柱保存处理，向柱内加入0.5M NaOH 8mL重悬树脂，4℃静置平放30min后流出液体，用灭菌水重悬树脂3次，加入25％酒精溶液，4℃保存。

[0146] 将四种纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，见图7。四种纯化后的重组融合蛋白在SDS-PAGE凝胶上呈现为单一蛋白条带，分子量大小与预期一致，且纯度大于90％。

[0147] 六抗体的制备及检测

[0148] 1全菌疫苗的制备和免疫产蛋鸡

[0149] (1)变形链球菌全菌疫苗的制备

[0150] 将变形链球菌(血清型为c型)按1:1,000的比例接种于BHI培养基中，于恒温微需氧箱中，温度设置为37℃培养2天，将培养液转移至灭菌离心管中5,000rpm离心10min。灭菌生理盐水洗涤菌体沉淀3次，离心同上。加入25mL 0.4％甲醛生理盐水，4℃灭活24h。生理盐水洗涤3次，离心同上，用PBS稀释菌体沉淀，至OD660值＝1.0，即为全菌疫苗，-20℃保存。

[0151] (2)全菌疫苗免疫产蛋鸡

[0152] 全菌疫苗(OD660值＝1.0)加入等体积的弗氏佐剂混合均匀，摇床中进行乳化，转数200rpm，温度4℃，乳化4h。全菌疫苗组一组有3只产蛋鸡，每只鸡一共免疫3次，免疫方式为在鸡胸部选取三点进行肌肉注射，30度倾斜针尖刺入皮下，再倾斜至45度后注射疫苗。首次免疫为弗氏完全佐剂，免疫剂量1mL，第2周免疫一次，一月后加强免疫一次，均使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量1mL。第3次免疫一周后开始收集鸡蛋。

[0153] 2重组蛋白疫苗的制备和免疫产蛋鸡

[0154] 将4种纯化的重组蛋白(CAT、GbpB、SpaP、CAT-SYI)用PBS调整到适宜浓度与弗氏佐剂等体积混合，进行乳化(乳化条件同全菌疫苗)。4种重组蛋白疫苗每组有3只产蛋鸡，每只鸡一共免疫3次，首次免疫为弗氏完全佐剂，免疫剂量为500μg，第二周免疫一次，一月后加强免疫一次，均使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量300μg。第3次免疫一周后开始收集鸡蛋。

[0155] 3卵黄抗体的提取

[0156] 将鸡蛋破壳，去除蛋清，收集所有蛋黄液，并测量蛋黄液体积，加入蛋黄体的7倍体积去离子水，用稀盐酸调pH值＝5.0，4℃静置过夜，10,000rpm低温离心10min，收集上清。向上清液中加入8.8％NaCl(w/v)，稀盐酸调pH值＝4.0，4℃静置2h，离心同上，收集沉淀。加入等蛋黄液体积的PBS溶解，转入透析袋中，置于4℃冰箱，在超纯水中透析4h，每小时换一次超纯水。抗体液冷冻干燥，-20℃保存备用。

[0157] 将四种特异性卵黄抗体经变性buffer处理，SDS-PAGE电泳检测，见图8。GtfB、GbpB、SpaP、CAT-SYI四种重组蛋白对应的四种卵黄抗体的粗提取物与预期的结果一致。卵黄抗体经变性buffer处理后，解链为分子量20～25KDa的轻链和分子量为60～70KDa的重链。

[0158] 3卵黄抗体的ELISA检测

[0159] 四种卵黄抗体的ELISA检测步骤如下所示：

[0160] (1)包被抗原：用包被液将抗原进行稀释浓度为10μg/mL，加入聚苯乙烯板内(96孔板)，每孔100μL，4℃放置过夜；

[0161] (2)洗涤：倒尽板孔中液体，孔内加满洗涤液，静放3min，反复洗涤三次，最后将板倒扣在吸水纸上，轻扣板底，使孔中液体流尽；

[0162] (3)加封闭液：加入200μL封闭液，37℃孵育1.5h；

[0163] (4)洗涤同上；

[0164] (5)加一抗：用抗体稀释液将一抗按一定稀释比例稀释，每孔加入100μL。同时做阴性对照，37℃孵育1.0h；

[0165] (6)洗涤四次；

[0166] (7)加二抗：抗体稀释液以1:30,000稀释酶标抗体，每孔100μL，37℃孵育0.5h；

[0167] (8)洗涤四次；

[0168] (9)加底物：加TMB底物溶液100μL，黑暗处静置2～30min(其间观察颜色变化，明显时终止)；

[0169] (10)加终止液：每孔100μL；

[0170] (11)观察结果：用酶标仪读取OD450的吸光度值。

[0171] 结果见图9。由图分析，随着抗体稀释比例增加，OD450值逐渐降低，当四种特异性卵黄抗体稀释至最大倍数1：100,000时，实验组OD450值>2.1倍对照组OD450值(对照组代表对照抗原与四种特异性卵黄抗体的ELISA检测值)，被认为阳性结果，结果表明四种特异性卵黄抗体的效价可达1:100,000以上。

[0172] 4斑点杂交(卵黄抗体与四种血清型变形链球菌)

[0173] 通过体外实验斑点杂交(dot-blotting)来检测四种卵黄抗体与四种血清型变形链球菌的结合效果。具体步骤如下，将PVDF膜剪切为适宜大小，并浸泡于甲醇溶液，直至膜由乳白色转为透明后(大约30s)，再将膜转泡于PBS溶液中。抗原的稀释，用包被液(0.05mM碳酸缓冲液，pH值＝9.6)将抗原(甲醛灭活的全菌疫苗细胞，OD660值＝0.60)依次按照1:10、1:100、1:500、1:1,000稀释，并依次将抗原稀释液各2μL点样于甲醇活化的PVDF膜上，待点样液被膜吸收后再重复点样一次，室温放置2h。将膜用洗涤液洗涤四次，每次5min，于封闭液(含量为5％脱脂奶粉的PBS溶液)中，37℃放置2h。洗涤同上，浸泡于浓度为0.005mg/mL一抗稀释液(含量为1％脱脂奶粉的PBS溶液)中，4℃过夜放置。洗涤同上，浸泡于1:3,000稀释的二抗中，室温放置1.5h。洗涤同上，加入现配制的DAB液，避光显色，约60s，加入去离子水终止反应。

[0174] 结果显示，整体上CAT-SYI抗体和GbpB抗体与四种血清型抗原具有较好的结合能力，而GtfB抗体和SpaP抗体与四种血清型抗原的结合能力相对弱些。相对c、e、f、k四种血清型当中，四种特异性卵黄抗体与k型变形链球菌的结合能力最弱，其中的原因还不明确。

[0175] 七卵黄抗体的龋齿模型动物实验研究

[0176] 1实验动物的选择与饲养

[0177] 本次实验一共有48只年龄为6周龄的雌性SD大鼠，SD大鼠饲养于鼠箱中，每2天更换一次垫料，SD大鼠饲喂房间为洁净室，室内温度设置为25℃，自然光照。SD大鼠的饮用水为灭菌水，饲料为Diet-2000高糖致龋饲料。

[0178] 实验的48只SD大鼠被随机分为6个组(GtfB、GbpB、CAT-SYI、SpaP、全菌、对照)，每组8只。随机分组的方法为，先将SD大鼠从1-48编号，然后在48张纸条上写上数字1-48标号，捏成团，放入纸箱。从纸箱中随机抽取8个作为一组，一共抽取5次，剩余8个作为一组。

[0179] GtfB组：饲喂抗GtfB的特异性卵黄抗体；

[0180] GbpB组：饲喂抗GbpB的特异性卵黄抗体；

[0181] CAT-SYI组：饲喂抗CAT-SYI的特异性卵黄抗体；

[0182] SpaP组：饲喂抗SpaP的特异性卵黄抗体；

[0183] 全菌组：饲喂抗全菌疫苗的特异性卵黄抗体；

[0184] 对照组：饲喂未免疫鸡的卵黄抗体；

[0185] 2 SD大鼠的感染

[0186] 将变形链球菌血清型c接种于BHI培养基，微需氧培养48h，并调节菌液OD600值＝1.0，作为感染6组SD大鼠的菌液(每次感染需新鲜培养的菌液)。第1～5天，用移液枪吸取
100μL变形链球菌菌液，缓慢注入SD大鼠口腔，以便增加停留于口腔的时间，感染结束，2h内禁水、禁食。

[0187] 3饲喂特异性卵黄抗体的方案

[0188] 实验组：第1～50天，分别饲喂添加含量为0.4％的特异性卵黄抗体的Diet 2000致龋饲料。第51～104天，饲喂不含卵黄抗体的Diet 2000致龋饲料。第1～5天，饮用水中添加特异性卵黄抗体，终浓度为100μg/mL，第6-145天，水中不添加卵黄抗体，饮用水为灭菌去离子水，第146天处死SD大鼠。

[0189] 对照组：第1～50天，饲喂含量为0.4％的对照卵黄抗体的Diet2000致龋饲料。第51～104天，饲喂不含卵黄抗体的Diet 2000致龋饲料。第1～5天，饮用水中添加对照卵黄抗体(未经免疫的鸡蛋)，终浓度为100μg/mL，第6-145天，水中不添加卵黄抗体，饮用水为灭菌去离子水，第146天处死SD大鼠。

[0190] 4龋齿的处理及Keyes计分

[0191] (1)龋齿的前处理：实验中所有SD大鼠经麻醉处死。向每只SD大鼠的腹腔注射1mL，浓度为10％的水合氯醛氯化钠水溶液，待SD大鼠进入麻醉期后，用手术剪刀断头，并做好标记。SD大鼠头经高压灭菌锅处理5min，去除软组织，并清洗干净，留取上下颌骨，并用针尖将龋坏部位的食物残渣清理出来，并于氨水稀溶液中浸泡12h，最后于55℃烘箱烘干。上下颌牙齿经0.4％紫脲酸铵染色过夜，用去离子水清洗3次，并烘干。

[0192] (2)龋齿的Keyes计分：使用金刚砂磨片沿牙齿中轴线，将SD大鼠磨牙纵切为对称的两部分，在显微镜下观察龋损程度，测量龋损尺度，并按照Keyes计分法进行评分。具体标注参考Keyes，大鼠一共有12颗磨牙，每颗磨牙有四个面(颊面，舌面，颌面窝沟，邻面)，这四个面的龋损深度分为四个等级，分别为E、Ds、Dm、Dx，四个等级的评判标准如下：E釉质龋：龋齿仅累及釉质表面；Ds轻度牙本质龋：龋损破坏程度约为釉质至髓腔距离的1/4；Dm中度牙本质龋：龋损破坏程度约为釉质至髓腔距离的1/4-3/4；Dx广泛牙本质龋：龋损破坏程度约为釉质至髓腔距离的3/4以上。分别对大鼠的每颗磨牙的四个面(颊面，舌面，颌面窝沟，邻面)进行以上四个等级计分，并加和统计总分，作为一只大鼠的龋损牙面积计分值。

[0193] 感染了变形链球菌的六组大鼠形成了不同程度的龋齿，见图10。对照组中可见8只大鼠下颌牙齿均形成较大龋洞。全菌组的大鼠也形成龋洞，但形成龋洞不及对照组明显，说明全菌疫苗在一定程度上可以降低大鼠的患龋率。在GtfB、CAT-SYI、GbpB、SpaP各实验组中，这四组大鼠的患龋程度比对照组更低。按照Keyes评分法标准对大鼠龋齿进行计分，见图11，各组计分均值如下，和全菌 这
5组显著低于对照组 (P<0.05)，表明服用全菌和重组融合蛋白的特异性卵黄
抗体均具有有效的抑龋效果，也说明本文研制的四种重组蛋白的特异性卵黄抗体能够达到全菌疫苗的卵黄抗体的抑龋效果。

[0194] 经统计分析，串联基因 显著低于单基因(P<0.05)，表明串联基因蛋白的特
异性卵黄抗体的防龋效果优于单基因蛋白的特异性卵黄抗体的抑龋效果。

[0195] 体外实验表明了CAT-SYI抗体与针对单个毒力基因以及全菌的抗体相比有更好的抗龋效果。证实CAT-SYI抗原可作为基因工程龋齿疫苗的候选抗原或用于抗龋药物的制备,CAT-SYI抗体可用于牙膏等日用品中或药物中以达到抗龋目的，本发明具有良好的应用前景。

[0196] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。