一种短小芽孢杆菌及其在镉污染修复中的应用

摘要

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种短小芽孢杆菌及其在镉污染修复中的应用。一种短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1‑1，保藏编号CGMCC No.13628，保藏日为2017年01月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的短小芽孢杆菌菌株SD1‑1的含镉土壤与未添加任何微生物的含镉土壤产出水稻含镉量进行了检测。结果表明，添加菌株SD1‑1的含镉土壤比未添加微生物的含镉土壤产出水稻含镉量减少了13.8％。

权利要求

1.一种短小芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1-1，保藏编号CGMCC No.13628，保藏日为2017年01月19日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心；

所述SD1-1菌株的固体粉剂的培养方法包括：

(1)配制LB液体培养基，每升含有：10.0g蛋白胨，5.0g酵母膏，10.0g氯化钠，pH7.0；121℃灭菌20min；

(2)种子液制备：将于4℃冰箱保存的菌株SD1-1取出，挑取菌落接种于配制好的LB培养基中，37℃，180rpm培养16h备用；

(3)固体发酵培养基制备，固体发酵培养基每千克包括：400g麦麸，100g豆粕，水500g；

充分混匀后用干净纱布包实，121℃条件灭菌40min；冷却至50-55℃；

(4)接种：将步骤（2）制备获得的种子液接种到步骤（3）的固体发酵培养基中，搅拌均匀，在37℃条件培养2天；

(5)干燥，粉碎：将步骤（4）培养好的菌种在45℃烘箱干燥或者太阳晒干至水分含量小于20％；用粉碎机粉碎备用。

2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌在镉污染修复中的应用。

说明书

一种短小芽孢杆菌及其在镉污染修复中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种短小芽孢杆菌及其在镉 污染修复中的应用。

背景技术

[0002] 目前，镉污染治理方法有三大类：物理/化学修复技术、生物修复技术、 农业生态修复技术，各有优点及局限性。微生物修复技术是一种比较有优势 的治理方法，土壤中某些微生物(枯草芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌、霉菌 等)对重金属具有吸附、沉淀、氧化、还原、螯合、生物甲基化、细胞内累 计、挥发等作用，因此可以通过工程菌培养、微生物投放来降低污染土壤中 镉的活性和毒性。例如，从香薷、蜈蚣草、东南景天根际中分离出的一些菌 株，能钝化固定土壤中的Cd，降低它们在土壤中的可交换态含量。主要优点 为“经济”-工程量小、操作简单、投入少、成本低、环境友好、不影响农业生 产、可大面积推广应用等。

[0003] 公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术 人员所公知的现有技术。

发明内容

[0004] 针对当前广泛存在的水稻田受重金属镉污染的情况，本发明提供一种可 降低水稻田中有效镉的短小芽孢杆菌，该菌源于有机肥堆肥物料，在含有镉 元素的的液体培养基中表现出对镉元素强力的吸收能力。

[0005] 本发明所提供的技术方案是：

[0006] 一种短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1-1， 保藏编号CGMCC No.13628，保藏日为2017年01月19日，保藏单位为中国 普通微生物菌种保藏管理中心。

[0007] 该菌株具有如下性质：菌落白色，扁平，在LB固体平板上直径4mm-5 mm，菌体为直或微弯杆状菌，革兰氏阳性菌。

[0008] 所述的吸收镉的微生物的筛选方法，包括如下步骤：

[0009] (1)样品采集：所述样品来源于多得乐肥料厂(以蘑菇渣为主要原料) 以及肥沃土壤样品；

[0010] (2)菌株分离：配制分离固体培养基，每升含有蛋白胨10g、酵母膏5g、 NCl 10g、琼脂15g；pH 7.0；121℃湿热灭菌20min；冷却至55-60℃时倒 平板；将采集的样品稀释涂平板，37℃培养1-3天，根据菌落生长情况挑取 单菌落，转接到新的固体分离培养基上；

[0011] (3)菌株筛选：配制筛选液体培养基，每升含有：10.0g葡萄糖，8.0g 酵母膏，8.0g蛋白胨，3.0g硫酸铵，3.0g磷酸二氢钾，3.0mg镉，用蒸馏水 补足体积；筛选培养基pH 7.0，分装10瓶，每瓶100mL，115℃灭菌20min； 将步骤2分离获得的单菌落接种到液体筛选培养基中，细菌37℃,180rpm培 养1天；12000rpm离心5min去除菌体，测定上清中镉剩余含量，选择使镉 含量降低幅度最大的菌株作下一步研究；真菌180rpm培养3天，12000rpm 离心20min去除菌体，测定上清中镉剩余含量，选择使镉含量降低幅度最大 的菌株进行下一步研究。

[0012] 所述的镉吸收菌株SD1-1固体粉剂的制备方法，包括如下步骤：

[0013] (1)配制LB液体培养基，每升含有：10.0g蛋白胨，5.0g酵母膏，10.0 g氯化钠，pH7.0；121℃灭菌20min；

[0014] (2)种子液制备：将于4℃冰箱保存的菌株SD1-1取出，挑取菌落接种 于配制好的LB培养基中，37℃，180rpm培养16h备用；

[0015] (3)固体发酵培养基制备，固体培养基每千克包括：400g麦麸，100g 豆粕，水500g。充分混匀后用干净纱布包实，121℃条件灭菌40min。冷却 至50-55℃；

[0016] (4)接种：将步骤2制备获得的种子液接种到步骤3的固体培养基中， 搅拌均匀，在37℃条件培养2天；

[0017] (5)干燥，粉碎：将步骤4培养好的菌种在45℃烘箱干燥或者太阳晒 干至水分含量小于20％；用粉碎机粉碎备用。

[0018] 所述的镉处理微生物短小芽孢杆菌SD1-1固体粉剂的使用方法，包括如 下步骤：制备培植水稻土壤，取小盆(长*宽*高＝30cm*15cm*10cm)，装满 培植水稻的土壤；小盆作好编号1，2，3；其中1号盆装原始土壤，2号盆在 原始土壤加入镉标准液至土壤理论镉含量
0.5mg/kg，3号盆在原始土壤加入 镉标准液至土壤理论镉含量0.5mg/kg和10g可吸收镉元素的粉状短小芽孢杆 菌；混合均匀后，种植培育好的水稻小苗，水稻长至第一分蘖期再向3号盆 加入10g短小芽孢杆菌SD1-1固体粉剂。

[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0020] (1)本发明的短小芽孢杆菌SD1-1的含镉土壤与未添加任何微生物的含 镉土壤产出水稻含镉量进行了检测。检测方法按照国家标准NY/T1100-2006 关于石墨炉原子吸收光谱法对稻米中铅、镉的测定。检测结果表明，添加菌 株SD1-1的含镉土壤比未添加微生物的含镉土壤产出水稻含镉量减少了 13.8％。

[0021] (2)实验结果表明本次分离到的短小芽孢杆菌SD1-1，SD1-2，SD1-3， SD1-5，SD2-1，SD2-3，SD2-4在液体培养条件下均有吸收培养液中镉元素的 能力。从菌落形态观察，除SD1-5为丝状真菌，其余菌株为芽孢杆菌类细菌。 其中SD1-5在37℃，180rpm培养3天对含镉量为1.5mg/L的培养液镉吸收 效率为65％；SD1-1，SD1-2，SD1-3，SD2-1，SD2-3，SD2-4在37℃，180rpm 培养1天对浓度为1.5mg/L的镉元素吸收效率分别为100％，77％，78.3％， 
79％，88.7％，80.9％。

附图说明

[0022] 图1为短小芽孢杆菌SD1-1在LB平板上的菌落形态；

[0023] 图2为短小芽孢杆菌SD1-1的菌体的显微形态；

[0024] 图3为短小芽孢杆菌SD1-1的16S rRNA和Bacillus pumilus 2-1菌株16S rRNA序列比对结果；

[0025] 图4为短小芽孢杆菌SD1-1固体发酵干燥粉碎后实拍图。

[0026] 保藏信息说明

[0027] 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus SD1-1，其保藏编号为CGMCC No.13628， 保藏日期为2017年01月19日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中 心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院生物研究所。

具体实施方式

[0028] 以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的 实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料， 如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量实 验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0029] 筛选培养基配方：葡萄糖10g、酵母膏8g、蛋白胨8g、KH2PO4 3g、 (NH4)2SO4 3g、Cd标准液(1000μg/mL)1.5mL；用800mL去离子水溶解， 然后调节pH值至6.0(用1M HCl和1M NaOH调节)；用去离子水定容至 1L；115℃湿热灭菌30min。

[0030] 镉标准曲线的制作：镉标准曲线的制作参照中华人民共和国国家标准 GB7475-87关于《水质铜、锌、铅、镉的原子吸收分光广度法》。具体为： 配制不同浓度的镉标准液时统一用蒸馏水稀释5倍的筛选培养基(未添加镉) 作为溶剂。分别配制0.05mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、1mg/L的镉 标准液各10mL。配制好的标准液用火焰原子分光广度仪进行测定。得到光吸 收值和镉浓度的标准曲线，标准曲线的函数式为y＝0.3431x+0.0084， R2＝0.9993。其中y为光吸收值，x为镉浓度(mg/L)。

[0031] 实施例1：吸收镉菌株的筛选鉴定

[0032] 一、菌株的获得

[0033] 1、菌株采集：2015年9月与中国广西南宁市双定镇多得乐肥料厂有机肥 原料堆(蘑菇渣)取样100g一个，肥料厂沃土样品取样100g一个。

[0034] 2、吸收镉元素菌株的分离筛选

[0035] (1)用去离子水配制分离培养基，每升含有蛋白胨10g、酵母膏5g、 NCl 10g、琼脂15g；pH7.0；121℃湿热灭菌20min；冷却至55-60℃时倒平 板。

[0036] (2)取10g样品放入250mL三角瓶中，加入90mL无菌水并加入适量 的玻璃珠，于磁力搅拌器上搅拌30min。是样品与水充分混合，将细胞分散。 取1mL土壤悬液加入盛有9mL无菌水的指形瓶中充分混匀，然后从中取出 1mL加入盛有9mL无菌水的指形瓶中充分混匀。以此类推，制成10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5等不同稀释度的样品溶液。取10-3、10-4、10-5 3个稀释度各100 μL样品涂布在分离培养基上，37℃恒温培养。

[0037] (3)24h后，观察细菌菌落生长情况，挑取单菌落，转接到新的筛选培 养基上，划线分离纯化。

[0038] (4)配制pH7.0的筛选培养基(液体)，培养基成分为：葡萄糖10g、 酵母膏8g、蛋白胨8g、KH2PO4 3g、(NH4)2SO4 3g、Cd标准液(1000μg/mL) 1.5mL；用800mL去离子水溶解，然后调节pH值至7.0(用1M HCl和1M NaOH调节)；用去离子水定容至1L；115℃湿热灭菌30min。

[0039] (5)将步骤(3)得到的细菌接种到液体培养基中。37℃，180rpm培 养，其中细菌培养1天，真菌培养三天。

[0040] (6)细菌培养液12000rpm离心5min，收集上清液，用蒸馏水稀释5 倍后测定剩余镉的含量。真菌培养液12000rpm离心15min，收集上清液， 用蒸馏水稀释5倍后测定剩余镉的含量。通过剩余镉含量的测定筛选出具有 吸收镉能力的菌株。

[0041] (7)实验结果表明本次分离到的SD1-1，SD1-2，SD1-3，SD1-5， SD2-1,SD2-3，SD2-4在液体培养条件下均有吸收培养液中镉元素的能力。从 菌落形态观察，除SD1-5为丝状真菌，其余菌株为芽孢杆菌类细菌。其中SD1-5 在37℃，180rpm培养3天对含镉量为1.5mg/L的培养液镉吸收效率为65％； SD1-1，SD1-2，SD1-3，SD2-1，SD2-3，SD2-4在37℃，180rpm培养1天对 浓度为1.5mg/L的镉元素吸收效率分别为100％，77％，78.3％，79％，88.7％， 80.9％。本发明仅以吸收效率最高的SD1-1菌株为对象，研究其种属，固体制 备方法以及在被镉污染水稻上的具体应用。

[0042] 二、SD1-1菌株的固体培养

[0043] 1、配制LB液体培养基，每升含有：10.0g蛋白胨，5.0g酵母膏，10.0g 氯化钠，pH7.0；121℃灭菌20min。

[0044] 2、种子液制备：将于4℃冰箱保存的菌株SD1-1取出，挑取菌落接种于 配制好的LB培养基中，37℃，180rpm培养16h备用。

[0045] 3、固体发酵培养基制备，固体培养基每千克包括：400g麦麸，100g豆 粕，水500g。充分混匀后用干净纱布包实，121℃条件灭菌40min。冷却至 50-55℃。

[0046] 4、接种：将步骤2制备获得的种子液接种到步骤3的固体培养基中，搅 拌均匀，在37℃条件培养2天。

[0047] 5、干燥，粉碎：将步骤4培养好的菌种在45℃烘箱干燥或者太阳晒干 至水分含量小于20％；用粉碎机粉碎备用。

[0048] 三、菌株的鉴定

[0049] 如图1所示，菌株SD1-1在LB培养基上的形态，在37℃培养24h后， 呈白色菌落，菌落表面光滑，不透明，菌落边缘不规则。菌落半径约2mm。

[0050] 如图2所示，菌株SD1-1在的显微形态，在40倍镜下可观察到SD1-1单 菌体呈杆状形态，单生。

[0051] 菌株SD1-1的分子鉴定结果见图4，以37℃，180rpm培养24h的SD1-1 菌液为模板，利用引物K1:5-aactgaagagtttgatcctggctc-3，K2:5-tacggt taccttgttacgactt-3扩增得到其16S rRNA，经测序获得一条长1382bp的核苷酸 序列，测序得到的序列为SEQ ID NO.1所示，经过同源性比对分析表明，其 与Bacillus pumilus CLB-4 16S rRNA序列的同源性为100％。

[0052] 四、SD1-1菌株的应用

[0053] 1、制备培植水稻土壤：取小盆(长*宽*高＝30cm*15cm*10cm),装满培 植水稻的土壤。小盆作好编号1，2，3。其中1号盆装原始土壤，2，3号盆 在原始土壤中加入镉标准液至土壤理论镉含量0.5mg/kg。

[0054] 2、菌种添加：将10g制备好的SD1-1菌种(粉末状)添加至3号盆中， 搅拌均匀。

[0055] 3、水稻种植：将预先培育好的水稻小苗插秧至1,2,3号小盆中，定期浇 水。

[0056] 4、菌种2次添加：待水稻苗长至第一分蘖期，再向3号盆添加SD1-1菌 粉10g于水稻根部。

[0057] 五、含镉稻米样品处理

[0058] 待稻谷成熟，收集稻谷，分别将1，2，3号盆收集的稻谷脱壳。对含镉 稻米样品的制备参照国家标准NY/T 1100-2006《稻米中铅、镉测定的石墨炉 原子吸收光谱法》的方法进行，具体操作为：

[0059] 1、配0.5mol/L的硝酸溶液：吸取。3.2mL硝酸(ρ＝1.42g/mL)加入 50mL水中，稀释至100mL。

[0060] 2、配制100mg/L镉标贮备准液：准确称取0.1000g光谱金属镉于50mL 烧杯中，加入20mL稀硝酸(1+5)，微热溶解，冷却后转移至1000mL，用 水定容至标线，摇匀。

[0061] 3、配制500μg/L镉标准液：临用前将镉标准贮备溶液用步骤1的获得硝 酸溶液逐级稀释至目标浓度。

[0062] 4、配制混合酸溶液：硝酸(ρ＝1.42g/mL)：高氯酸(ρ＝1.68g/mL)＝4:1[0063] 5、样品消解：1，2，3号盆收集的稻米，各称取30g。经研磨至全部通 过孔径0.25mm尼龙筛，然后称取1g试样(精确到0.001g)于100mL锥形 瓶中，加入混合酸10mL及数粒玻璃珠，摇匀后放置过夜。加一小漏斗，放 在电热板上缓慢加热，若变棕黑色，应稍冷，补上少量硝酸，继续加热直至 冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色。取下冷却，用水定量转移并定容到 25mL，混合待测。同时做空白试验。

[0064] 六、稻米中镉含量测定

[0065] 1、标准曲线绘制：准确量取镉标准使用液0.00mL，5.0mL，10.0mL， 20.0mL，30.0mL，40.0mL于6个50mL容量瓶中，用硝酸溶液定容至刻度。 镉浓度为0.0μg/L，50.0μg/L，100.0μg/L，200.0μg/L，300.0μg/L，400.0μg/L。 镉标准样品依次用火焰原子分光光度仪进行测定。试验测得镉的标准曲线为 y＝0.3543x+0.0118，R2＝0.9985。

[0066] 2、将制备好的稻米样品依次用火焰原子分光光度仪进行测定，测定结果 显示：1号盆稻米镉浓度为63.5μg/L，2号盆稻米镉浓度为176.5μg/L，3号 盆稻米镉浓度为204.75/L。2号盆镉含量较3号盆镉含量少13.8％。

[0067]  前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。