检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT‑PCR试剂盒，提供了用于检测H7N9病毒经典毒株和变异毒株血凝素(HA)特异性基因的引物对和MGB探针，用于检测H7N9病毒神经氨酸酶基因(NA)的引物对和MGB探针，以及包括它们的试剂盒和试剂盒使用方法。本试剂盒的原理是：以H7N9禽流感病毒变异毒株的HA突变基因为分子标识，结合保守的神经氨酸酶(NA)基因，制备H7N9病毒经典毒株和变异毒株多重荧光检测试剂盒。本试剂盒可快速甄别H7N9禽流感病毒经典毒株和高致病性变异毒株，为H7N9禽流感病毒变异早期预警提供了强有力的技术支撑，可广泛应用于动物检验检疫、流行病学调查、疫病防控等领域。

权利要求

1.一种检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有吸附柱、收集管、裂解液、洗液和洗脱液，B盒含有阳性对照、阴性对照、RT-PCR反应液A和RT-PCR反应液B；

所述RT-PCR反应液A由RT缓冲液、dNTPs、反转录酶和RNA酶抑制剂混合而成；

所述RT-PCR反应液B中有2对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增H7N9禽流感病毒HA和NA基因片段，探针分别用于识别H7N9病毒HA基因、H7N9变异毒株HA基因和H7N9病毒的NA基因；

其中

用于检测H7N9病毒HA基因的引物对及其MGB探针序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’H7-P：5’-ROX-ACATAGATAGCAGGGC-BHQ2-MGB-3’ROX为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团；

用于检测H7N9变异毒株HA基因的引物对及其MGB探针序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’H7变异- P：5’-FAM-AGAGAAAACGGACTGC-BHQ1-MGB -3’FAM为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团；

其中用于检测H7N9病毒NA基因的引物对及其MGB探针序列如下：N9-F：5’-ATGCCCAGTAGTGTTCACCG-3’N9-R：5’-TGTCCTCCCTAGCCAAGTGT-3’N9-P：5’-VIC-GTCTCTGACTGGAACT-BHQ1-MGB -3’VIC为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中

A盒用于病毒RNA的提取，0-4℃保存；B盒用于RNA的逆转录和PCR扩增反应，-20℃保存。

说明书

检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试

剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测H7N9流感病毒的试剂盒，特别涉及一种用于检测H7N9流感病毒低致病性毒株(经典毒株)和高致病性毒株(变异毒株)的多重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，属于生物制品检测技术领域。

背景技术

[0002] 流感病毒属于正粘病毒科，基因组是单股、负链、多节段的核糖核酸(RNA)分子。根据流感病毒核蛋白(NP)抗原性差异，可将流感病毒分为A、B、C三型，其中A型流感病毒为最常见的流感病毒，宿主范围广泛，可感染大多数哺乳动物、家禽以及野鸟。根据流感病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)氨基酸的差异，又可将A型流感病毒分为18个HA亚型和11个NA亚型。

[0003] 禽流感病毒属于A型流感病毒，根据致病能力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)、低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza,LPAI)和非致病性禽流感(Non-pathogenic avian influenza,NPAI)。HPAI传染性极强，以高发病率和高致死率为特征，对禽类养殖业危害巨大，因此世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的动物疾病，中国政府也将其列为一类动物疫病。目前，引起HPAI的毒株主要集中在H5和H7亚型。2013年，我国上海市、安徽省、江苏省和浙江省等东南沿海地先后发生H7N9禽流感病毒感染人事件，并引起死亡。2017年，H7N9流感进一步蔓延，仅1月份全国“人感染H7N9禽流感”发病数为192，死亡数为79，给公共卫生安全造成严重影响。

[0004] 2017年，广东省疾病预防控制中心从人感染H7N9病例分离到变异毒株，病毒的血凝素基因发生插入性突变。随后中国疾病预防控制中心组织专家解析，并与农业部门专家沟通后认为，该位点的突变，提示H7N9病毒突变为对禽类高致病性的病毒，会导致禽更易发病、死亡。至此，H7N9病毒与H5N1、H9N2等禽流感病毒类似，对禽类和公共卫生构成了双重威胁。依据《动物H7N9禽流感紧急监测方案(农医发2013 13号)》和《高致病性禽流感防治技术规范(GB 19442-2004)》文件要求，H7N9的病原学检测采用RT-PCR方法。目前市售的H7N9核酸检测试剂，多为单独针对H7N9禽流感病毒的HA基因或NA基因，无法同时鉴别区分H7N9病毒经典毒株和变异毒株，检测效率低。多重荧光PCR设计难度大，比如说扩增三个片段需要六条引物和三个探针，这对引物和探针的特异性要求极高。这些引物和探针不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合，而且不同探针还要携带不同的荧光基团以便区分。

[0005] 综上所述，为加强对变异毒株的监测，建立了一套能够同时检测H7N9经典毒株和新型变异毒株的多重荧光PCR方法具有重要的实践意义，能够为H7N9禽流感的流行病学监测和早期预警提供强有力的技术支撑和储备。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种用于检测H7N9禽流感病毒经典毒株和变异毒株的多重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，利用多重荧光RT-PCR技术，可快速、高效地甄别人和动物中的H7N9低致病性经典毒株和高致病性变异毒株。该试剂盒的机理是：以H7N9禽流感病毒血凝素(HA)突变位置的基因序列为分子标识设计MGB探针，建立H7N9流感病毒经典毒株和变异毒株血凝素(HA)双重检测体系，然后结合保守的神经氨酸酶(NA)基因检测体系，最终组成H7N9禽流感病毒经典毒株和变异毒株的三重荧光RT-PCR检测试剂盒。

[0007] 本发明可以通过以下技术方案来实现。

[0008] 一种检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有吸附柱、收集管、裂解液、洗液和洗脱液，B盒含有阳性对照、阴性对照、RT-PCR反应液A和RT-PCR反应液B；所述RT-PCR反应液B中有2对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增H7N9禽流感病毒HA和NA基因片段，探针分别用于识别H7N9病毒HA基因、H7N9变异毒株HA基因和H7N9病毒的NA基因。A盒用于病毒RNA的提取，0-4℃保存；B盒用于RNA的逆转录和PCR扩增反应，-20℃保存。

[0009] 在一具体实施例中：用于检测H7N9病毒HA基因的引物对及其探针序列如下：

[0010] H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’

[0011] H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’

[0012] H7-P：5’-ROX-ACATAGATAGCAGGGC-BHQ2-MGB-3’

[0013] ROX为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团；

[0014] 用于检测H7N9变异毒株HA基因的引物对及其探针序列如下：

[0015] H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’

[0016] H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’

[0017] H7变异-P：5’-FAM-AGAGAAAACGGACTGC-BHQ1-MGB-3’

[0018] FAM为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团；

[0019] 其中用于检测H7N9病毒NA基因的引物对及其探针序列如下：

[0020] N9-F：5’-ATGCCCAGTAGTGTTCACCG-3’

[0021] N9-R：5’-TGTCCTCCCTAGCCAAGTGT-3’

[0022] N9-P：5’-VIC-GTCTCTGACTGGAACT-BHQ1-MGB-3’

[0023] VIC为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团；

[0024] 本发明的积极效果是：

[0025] 1.本发明首次制备了一种同时检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的三重荧光RT-PCR试剂盒。应用本试剂盒可同时鉴定禽流感病毒H7亚型HA基因、禽流感病毒N9亚型NA基因和禽流感病毒高致病性变异毒株H7亚型HA基因。相对于市场上其他核酸检测试剂，本试剂盒为H7N9流行病学监测与防控提供了高效的检测工具。

[0026] 2.本发明试剂盒使用MGB-Taqman探针，克服了多重PCR引物、探针、目的产物相互干扰等问题。原因如下：(1)探针3’末端使用BHQ作为淬灭基团，而BHQ本身不产生荧光，所有荧光背景低，灵敏度高；(2)在传统Taqman探针基础上，MGB-Taqman探针在3’末端偶联MGB(Minor Groove Binder)。MGB能够与DNA的小沟结合，使探针与靶DNA形成极为稳定的异源双链，从而可将Tm值提高约10℃，大大提高了荧光PCR方法的特异性；(3)MGB探针较短(14-20bp)，因而更适合于短小变异序列的特异性识别，容易设计。而且3’端淬灭基团与3’端报告基因在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。

[0027] 3.本发明采用RNA柱式提取法替代传统的实验室RNA提取方法(Trizol-氯仿法)，大大提高了操作便捷性和RNA提取效率。此外，本试剂盒将RNA逆转录试剂和PCR反应试剂整合为反应液A和反应液B，使用简单，操作方便，极大的提高了工作效率，方便在临床实践中推广应用。

具体实施方式

[0028] 一种用于检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT-PCR试剂盒，试剂盒内包括A盒和B盒。A盒内设有吸附柱、收集管、裂解液、洗液、洗脱液，B盒内设有阳性对照、阴性对照、RT-PCR反应液A、RT-PCR反应液B。

[0029] 所述RT-PCR反应液B中有2对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增H7N9禽流感病毒HA和NA基因片段，探针分别用于识别H7N9病毒HA基因、H7N9变异毒株HA基因和H7N9病毒的NA基因。

[0030] 下述实施例中的实验材料，若无特别说明，均是来源于商业途径。所述的实验方法，若无特别说明，均为常规实验方法。

[0031] 一、检测H7N9经典毒株与变异毒株的引物及探针

[0032] 参考GeneBank中收录的H7N9经典毒株和变异毒株序列，序列号：KY643843.1、KF922738.1、KY643847.1，应用NCBI提供的在线引物设计工具Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHomeAd)进行引物设计，其核苷酸序列如下表所示。

[0033] 表1引物和探针序列信息

[0034]

[0035]

[0036] 上述引物和探针由华大基因公司合成提供。

[0037] 二、试剂盒内各试剂的来源和制备过程

[0038] 2.1裂解液的制备

[0039] 异硫氰酸胍236.25g，250mmol/L柠檬酸钠(ph7.0)50ml，加DEPC水至500ml；加入0.2mmol/L NaCl(ph4.5)50ml，氯仿100ml，b-硫基乙醇3.5ml，混匀，分装，26mL/瓶，置0～4℃保存。

[0040] 2.2洗液的制备

[0041] 取无水乙醇75ml，加无Rnase纯化水定容至100ml。搅拌均匀，分装，52mL/瓶，置0～4℃保存。

[0042] 2.3洗脱液的制备

[0043] 量取2ml焦炭酸二乙酯迅速加入装有1000ml去离子水的瓶中，封口，震荡混匀，0～4℃放置8～16小时。高压灭菌121℃，25min，分装，1.2mL/瓶，置0～4℃保存。

[0044] 2.4阳性对照的制备

[0045] 参考GeneBank中收录的H7N9经典毒株和变异毒株序列，序列号：KY643843.1、KF922738.1、KY643847.1，设计引物分别扩增H7N9经典毒株HA基因、变异毒株HA基因和NA基因，并将3个基因片段连接到pUC57质粒载体上。用常规方法提取质粒，并用无Rnase纯化水6
稀释至2×10copies/μL，分装，100μL/瓶，置-20℃以下保存。

[0046] 2.5阴性对照的制备

[0047] 量取1ml焦炭酸二乙酯迅速加入装有1000ml去离子水的瓶中，封口，震荡混匀，2～8℃放置8～16小时。高压灭菌121℃，25min，分装，100μL/瓶，置-20℃以下保存。

[0048] 2.6RT-PCR反应液A的制备

[0049] RT缓冲液配置：取0.1mol/L的Tris-HCl(pH 8.4)20ml，1.0mol/L氯化钾溶液25ml，0.1mol/L氯化镁溶液3ml，加入无Rnase纯化水定容至100mL，混匀。然后依照如下比例配制反应液A：RT缓冲液40mL，dNTPs(2.5mmol/L)40L，反转录酶5mL，RNA酶抑制剂5mL。混匀，用
0.22μm的除菌滤器过滤，无菌分装，260μL/瓶，置-20℃以下保存。

[0050] 2.7RT-PCR反应液B的制备

[0051] PCR缓冲液配置：取1.0mol/L的Tris-HCl(pH9.0)25mL，2.0mol/L硫酸铵溶液20mL，2.0mol/L硫酸镁溶液2mL，甘油10mL，加入无Rnase纯化水定容至100mL，混匀。然后依照如下比例配制反应液B：PCR缓冲液25mL，dNTPs(2.5mmol/L)20mL，Taq酶5mL，H7-F(20pmol/μL)
5mL，H7-R(20pmol/μL)5mL，N9-F(20pmol/μL)5mL，N9-R(20pmol/μL)5mL，H7-P(20pmol/μL)
5mL，H7变异-P(20pmol/μL)5mL，N9-P(20pmol/μL)5mL，无Rnase纯化水14mL。混匀，用0.22μm的除菌滤器过滤，无菌分装，500μL/瓶，置-20℃以下保存。三、测试过程和原理[0052] 3.1测试过程

[0053] 3.1.1样品制备

[0054] 拭子样品：用棉拭子沾取禽类动物呼吸道分泌物或排泄物等，置于生理盐水中搅拌，低温保存送检；组织样品：采集呼吸道、肺脏等呼吸系统的组织样品1.0g，眼科剪剪碎于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加少量生理盐水混匀，4℃条件下8000rpm，离心1min，取上清于灭菌的离心管中待检；样本要求：采样量要足够进行一次复检，运输、储存过程确保低温，尽量避免反复冻融，检测前需充分解冻。

[0055] 3.1.2病毒RNA的提取

[0056] 向无酶的1.5ml EP管中分别加入样品液200μL、裂解液500μL，颠倒混匀，室温静置2min；将液体转入套有收集管的吸附柱中(若样品浑浊则先离心处理取上清液，以避免堵塞柱子)，12000rpm离心1min；弃收集管液体，向吸附柱中加500μL洗液，12000rpm离心1min；重复步骤3；弃收集管液体，12000rpm空柱离心1min，以彻底去除残留洗液；将吸附柱转入新的无酶1.5ml EP管中，向柱中央滴加20～30μL洗脱液，室温静置1min，12000rpm离心1min，EP管中液体即为模板RNA；

[0057] 3.1.3RT-PCR

[0058] 取出RT-PCR反应液，在室温融化后，瞬离，按照每份RT-PCR反应液A液5μL，RT-PCR反应液B液10μL的比例预混两种反应液(操作过程要避光)，按15μL/管分装到荧光专用PCR反应管中；分别向分装好的荧光专用PCR管中加入5μL样本RNA或阴性对照或阳性对照，在荧光定量PCR仪上运行以下程序：42℃30min，95℃3min；然后进行94℃10s，60℃30s；40个循环。荧光通道选择FAM、VIC、ROX，其中FAM用于检测突变毒株HA基因，ROX用于检测野生株HA基因，VIC用于检测NA基因，在每个循环的60℃时收集荧光信号。设置扩增体系为20μL，同时要选择passive reference和quencher为none的模式。

[0059] 3.1.4结果判定

[0060] 基线和阈值设定：基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点；质量控制：反应结束后，阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线或Ct值＞37或无；阳性对照Ct值均≤30.0，且出现三条明显的扩增曲线，否则实验视为无效；样品判定：待检样品若FAM、ROX和VIC三条通道荧光信号均有指数型增加，且结果均显示Ct值＜34.0，则报告为高致病H7N9阳性；待检样品若ROX和VIC两条通道荧光信号均有指数型增加，且结果均显示Ct值＜34.0，则报告为低致病H7N9阳性；待检样品若Ct值＞37.0或无明显扩增曲线时报告为阴性；34≤Ct值≤37时，复检一次，重复结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。

[0061] 3.2试剂盒特异性试验

[0062] 试剂盒具有良好的特异性，检测结果不受其他亚型流感病毒以及常见禽类病毒的干扰。此外，在对H7N9变异毒株和经典毒株核酸样本检测中，试剂盒表现出准确的鉴别区分能力。

[0063] 表2试剂盒的特异性试验

[0064]

[0065]

[0066] 注：H7N9-M代表H7N9变异毒株，H7N9-W代表H7N9经典毒株，NDV代表新城疫病毒，IBDV代表传染性法式囊病病毒，ALV代表禽白血病病毒，IBV代表禽传染性支气管炎病毒，ILTV代表禽传染性喉气管炎病毒；括号内为Ct值；“+”代表检测结果阳性，“-”代表检测结果阴性；H5、H7等高致病性毒株阳性核酸由中国科学院微生物研究所馈赠。

[0067] 3.3试剂盒敏感性试验

[0068] 将H7N9经典毒株和变异毒株阳性核酸混合，按10倍梯度进行稀释。用本发明试剂盒检测稀释样本，灵敏度可以达到100-101个EID50。

[0069] 表3试剂盒的敏感性试验

[0070]

[0071] 注：括号内为Ct值；“+”代表检测结果阳性，“-”代表检测结果阴性；H7N9毒株阳性核酸由中国科学院微生物研究所馈赠。

[0072] 四、试剂盒组装

[0073] 将各试剂组装成试剂盒，按表4取各组份分别进行密封，粘贴内包装标签，组装试剂盒。

[0074] 表4试剂盒组份

[0075]

[0076] 将组装好的试剂盒A盒置于0-4℃保存，B盒置于-20℃保存，间隔2个月测定其敏感性和特异性，以确定试剂盒的保存期。本发明的试剂盒保值期为6个月。