一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒

摘要

本提供一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，肠道病毒的四个亚型为EV71、CVAl6、CVA6、CVA10。本发明运用一步法实时荧光定量RT‐PCR技术，采用EV及EV71、CVAl6、CVA6、CVA10病毒高度特异的引物和荧光标记探针，通过一个PCR反应即从粪便标本中同时检测出肠道病毒的存在，并同时进行病毒分型鉴定，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。本发明对检测的病毒进行实时准确定量，根据病毒感染的滴度，为临床早期诊断提供工具，为临床治疗方案的制定提供参考依据。可应用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急诊断、肠道病毒快速筛查分型、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

权利要求

1.一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，由荧光PCR检测混合液、酶混合液、肠道病毒阳性对照品、阴性对照品、肠道病毒定量标准品1-5号组成，其特征在于，其中荧光PCR检测混合液内含有PCR反应缓冲液和引物探针混合液，引物探针混合液含EV、EV71、CVAl6、CVA6、CVA10五组引物和相应的五种不同荧光标记的探针，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，阴性对照品为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，肠道病毒阳性对照品为内含肠道病毒5’端非转录编码区RNA序列的病毒样颗粒，肠道病毒定量标准品1-5号为浓度：103 copies/ml-1×107copies/ml的内含肠道病毒5’端非转录编码区DNA序列的阳性质粒样品；

引物探针混合液中五组上游引物和下游引物以及相应的五种不同荧光标记的探针序列如下：

上游引物EV -F: 5’- CCCTGAATGCGGCTAATCC-3’，

下游引物EV-R: 5’- ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’，

特异性探针EV-P: 5’-ROX- AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ2-3’，上游引物EV71-F: 5’- GAGYATGATYGARACACGCTG-3’，下游引物EV71-R: 5’- CGCTCTRCTRAAGAARCTATC-3’，

特异性探针EV71-P: 5’- FAM - AACTCGCACAGTACRGCTGARACCAC -BHQ1-3’，上游引物CVA16-F: 5’- CCCAATGGYGAGYTAGTCCCC-3’，下游引物CVA16-R: 5’- GTTGGTRGCWGTYTGCCAAGC-3’，特异性探针CVA16-P: 5’-VIC- AGTAYATGTATGTCCCRCCAGGGGCT-BHQ1-3’，上游引物CVA6-F: 5’- AARCCRGATAGYAGGAAATC -3’，下游引物CVA6-R: 5’- GGGGTGGATCACTCAATTTTG -3’，特异性探针CVA6-P: 5’-CY5- CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG –BHQ3-3’，上游引物CVA10-F: 5’- GAGACTGGACGYGTRCCA-3’，下游引物CVA10-R: 5’-GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG-3’，特异性探针CVA10-P: 5’-TAMRA-CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC-BHQ2-3’；

其中EV、EV71、CVA16、CVA6、CVA10的特异性探针序列5’端分别采用ROX、FAM、VIC、CY5、TAMARA 5种不同荧光基团标记，3’端分别采用与荧光基团对应的BHQ1、BHQ2或BHQ3淬灭基团标记。

2.根据权利要求1所述的一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，其特征在于，PCR反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。

3.根据权利要求1所述的一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，其特征在于，试剂盒于-20℃条件下储存，减少反复冻融，荧光PCR检测混合液需避光条件保存。

说明书

一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，是一步法五重实时荧光定量RT-PCR在同一个反应管内检测患者粪便或咽拭子标本中肠道病毒以及其四个亚型(EV71、CVAl6、CVA6、CVA10)的核酸检测方法，可应用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急诊断、肠道病毒快速筛查分型、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

背景技术

[0002] 肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，传统上分为脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)、埃柯病毒(Echovirus,Echo)、柯萨奇病毒A、B组(CoxsackievirusA、B,CVA、B)及新型肠道病毒。在最新的肠道病毒分类中，国际病毒分类委员会(ICTV)根据生物学及遗传特性将其分为4个组，分别为肠道病毒A、B、C、D组。至今已报道的肠道病毒血清型超过百种。

[0003] 手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由人类肠道病毒感染引起的，以手、足、口、臀部出现皮疹症状为主要临床症状的常见传染病，主要以轻症为主，但重症及死亡病例也时有报道。根据中国疾病预防控制中心全国法定报告传染病发病、死亡统计的最新数据显示(http://www.chinacdc.cn/tjsj/fdcrbbg/)，自2008年至2016年7月，中国大陆共有15,432,764例手足口病例，其中3,486例死亡。手足口疾病在我国的感染形势依然严峻。

[0004] 以往的大多报道中，导致手足口病的病原体主要为为肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVA16)。而近年来在世界范围内，除EV71和CVA16之外其他肠道病毒引起的手足口病病例及疫情事件越来越多。2008年新加坡CVA6与CVA10感染引起35.3％的手足口病病例；2008年在芬兰爆发主要由CVA6感染引起以指甲脱落为特征的手足口病疫情。2010年，在法国与芬兰，手足口病病例疫情的主要病原体为CVA6及CVA10；2010年在日本与台湾地区，引起手足口病疫情的主要病原体为CVA6；2012年，在印度手足口病疫情的病原体主要为CVA16及CVA6，而EV71及CVA10则很少。肠道病毒的其他类型流行的频率越来越高，在我国的山东、河南、重庆及深圳等地区都有报道。2012年深圳地区由EV71、CVA16、CVA6和CVA10四种病原引起的手足口病总计占到了肠道病毒的89.8％。2013-2014年杭州地区儿童手足口病的主要病原体发生重大变化，CVA6取代EV-71成为杭州地区检出阳性率最高的的肠道病毒，杭州地区由EV71、CVA16、CVA6和CVA10四种病原引起的手足口病总计占到了肠道病毒的85.4％。上述文献报道显示，近年来，国内外手足口病病原谱构成发生较大变化，CVA6及CVA10逐渐成为手足口病主要及重要的病原体。

[0005] 目前我国的手足口病病原诊断市场，仍然以检测肠道病毒通用型或肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型为主，导致手足口病病原体检测不明确或漏检等，造成患者治疗的延误及诊断试剂的浪费等。因而迫切需要开发一种能够检测肠道病毒并对主要的感染型别进行分型的检测试剂。

[0006] 目前肠道病毒检测方法主要包括三类：病毒分离培养、免疫学方法、分子生物学方法。病毒分离培养是病毒性疾病诊断的金标准，但其操作繁琐，检测时间长，且阳性率较低。免疫学方法为传统分型的主要方法，但抗血清的来源很有限，无法满足临床病原诊断的要求。而基于PCR等相关技术的分子生物学方法以其灵敏、快捷等优势得到极大发展。多重实时荧光定量PCR技术以其全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，涉及一种肠道病毒以及其四个亚型(EV71、CVAl6、CVA6、CVA10)的荧光定量试剂盒，是一种一步法五重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

[0008] 本试剂盒包含荧光PCR检测混合液、酶混合液、肠道病毒(EV)阳性对照品、阴性对照品、EV定量标准品1-5号。其中荧光PCR检测混合液内含有PCR反应缓冲液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)和引物探针混合液(含EV及EV71、CVAl6、CVA6、CVA10五组引物和相应的五种不同荧光标记的探针)；酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；阴性对照品为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水；EV阳性对照品为内含肠道病毒5’端非转录编码区RNA序列的病毒样颗粒；EV定量标准品1-5号为浓度1×103copies/ml-1×107copies/ml的内含肠道病毒5’端非转录编码区DNA序列的阳性质粒样品。

[0009] 引物探针混合液中五组上游引物和下游引物以及相应的五种不同荧光标记的探针序列如下：

[0010] 上游引物EV-F:5’-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3’，

[0011] 下游引物EV-R:5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’，

[0012] 特异性探针EV-P:5’-ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ2-3’，[0013] 上游引物EV71-F:5’-GAGYATGATYGARACACGCTG-3’，

[0014] 下游引物EV71-R:5’-CGCTCTRCTRAAGAARCTATC-3’，

[0015] 特异性探针EV71-P:5’-FAM-AACTCGCACAGTACRGCTGARACCAC-BHQ1-3’，[0016] 上游引物CVA16-F:5’-CCCAATGGYGAGYTAGTCCCC-3’，

[0017] 下游引物CVA16-R:5’-GTTGGTRGCWGTYTGCCAAGC-3’，

[0018] 特异性探针CVA16-P:5’-VIC-AGTAYATGTATGTCCCRCCAGGGGCT-BHQ1-3’，[0019] 上游引物CVA6-F:5’-AARCCRGATAGYAGGAAATC-3’，

[0020] 下游引物CVA6-R:5’-GGGGTGGATCACTCAATTTTG-3’，

[0021] 特异性探针CVA6-P:5’-CY5-CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG–BHQ3-3’，[0022] 上游引物CVA10-F:5’-GAGACTGGACGYGTRCCA-3’，

[0023] 下游引物CVA10-R:5’-GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG-3’，

[0024] 特异性探针CVA10-P:5’-TAMRA-CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC-BHQ2-3’，[0025] 其中EV、EV71、CVA16、CVA6、CVA10的特异性探针序列5’端分别采用ROX、FAM、VIC、CY5、TAMARA等5种不同荧光基团标记，3’端分别采用与荧光基团对应的BHQ1、BHQ2或BHQ3淬灭基团标记。

[0026] 本发明提供的肠道病毒荧光定量试剂盒需于-20℃条件下储存，尽量减少反复冻融；荧光PCR检测混合液需避光条件保存。

[0027] 本发明的另一个目的是提供上述检测试剂盒在肠道病毒以及其四个亚型的核酸检测中应用。所述肠道病毒的四个亚型分别为EV71、CVA16、CVA6、CVA10。

[0028] 本发明试剂盒的使用方法：在每次标本检测中应设立阳性对照和阴性对照，且阳性对照品及阴性对照品需参与核酸提取过程。EV定量标准品1-5为浓度1×103copies/ml-17
×10copies/ml的阳性质粒样品，不需提取。如仅做定性实验时，EV定量标准品可不参与检测。

[0029] 粪便或咽拭子样本核酸的提取：取约0.2g粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置10min，以8000r/min离心5min。吸取200ml上清加入到EP管中，进行核酸提取。咽拭子标本的处理只需直接加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀后，其余处理过程同粪便样本。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction KitII或QIAGEN公司的QIAamp Viral RNAMini Kit，按照试剂盒说明书进行提取,取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。

[0030] 核酸的检测：取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为25μl，其中荧光PCR检测混合液15μl，酶混合液1μl，模板5μl，加水补足至25μl。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃，15min；95℃5min热启动，然后95℃15s，55℃45s，在55℃进行荧光检测，共进行40个循环。

[0031] 荧光定量结果报告：①EV、EV71、CVAl6、CVA6、CVA10检测的各自Ct值对应相应的荧光标记的病毒，检测样本CT值为40、0和无数值时，报告为阴性。②检测样本Ct值≤37时，报告为相应病毒阳性，其中EV71、CVAl6、CVA6、CVA10病毒阳性，需同时满足EV病毒阳性；仅EV病毒阳性，则报告为其他肠道病毒阳性。③检测样本Ct值＞37且小于40的样本，建议复检，复检结果Ct值≤37者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本相应病毒的病毒量(copies/ml)。

[0032] 本研究针对肠道病毒高度保守且各型间存在较大差异的VP1基因分别设计EV71、CVAl6、CVA6、CVA10的引物探针。采用单管一步法五重实时荧光定量RT-PCR，能够单管内一次反应同时检测出肠道病毒以及其四个亚型(EV71、CVAl6、CVA6、CVA10)，不仅极大的节省了试剂耗材，缩短了检测时间，并且依然具有极高的特异性和灵敏性。

[0033] 本发明运用一步法实时荧光定量RT-PCR技术，采用EV及EV71、CVAl6、CVA6、CVA10病毒高度特异的引物和荧光标记探针，研制用于肠道病毒以及其四个亚型(EV71、CVAl6、CVA6、CVA10)检测的五重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从粪便标本中同时检测出是否有肠道病毒的存在，并同时进行主要肠道病毒型别的分型鉴定，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。同时，对检测的病毒进行实时准确定量，根据病毒感染的滴度，为临床上患者提供早期诊断，为临床治疗方案的制定提供参考依据；可应用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急诊断、肠道病毒快速筛查分型、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

附图说明

[0034] 图1为本试剂盒检测肠道病毒的灵敏度，从左到右(1-6)依次为108、107、106、105、104、103copies/ml。

[0035] 图2为本试剂盒肠道病毒灵敏度实验实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，电泳条带大小约146bp，其中Lane M为DL2000Marker，Lane 1-6分别为EV阳性质粒(108copies/ml)十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。

[0036] 图3为本试剂盒EV标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。

[0037] 图4为本试剂盒用于检测确诊肠道病毒感染患者粪便标本EV71病毒阳性的实例。

[0038] 图5为本试剂盒用于检测确诊肠道病毒感染患者粪便标本CVA6病毒阳性的实例。

[0039] 图6为本试剂盒用于检测确诊肠道病毒感染患者粪便标本其它肠道病毒阳性的实例。

具体实施方式

[0040] 下面具体实施例结合附图对本发明进行进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。

[0041] 实施例1

[0042] 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，包含：荧光PCR检测混合液、酶混合液、引物探针混合液、标EV阳性对照品、阴性对照品、EV定量标准品1-5号。其中荧光PCR检测混合液内含有PCR反应缓冲液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)和引物探针混合液(含EV及EV71、CVAl6、CVA6、CVA10五组引物和相应的五种不同荧光标记的探针)；酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；阴性对照品为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水；EV阳性对照品为内含肠道病毒5’端非转录编码区RNA序列的病毒样颗粒；EV定量标准品1-5为阳性质粒样品，其中EV定量标准品1质粒浓度为103copies/ml，EV定量标准品2质粒浓度为104copies/ml，EV定量标准品3质粒浓度为
105copies/ml，EV定量标准品4质粒浓度为106copies/ml，EV定量标准品5质粒浓度为
107copies/ml。荧光PCR检测混合液需存放于棕色管。

[0043] 引物探针混合液中五组上游引物和下游引物以及相应的五种不同荧光标记的探针序列如下：

[0044] 上游引物EV-F:5’-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3’，

[0045] 下游引物EV-R:5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’，

[0046] 特异性探针EV-P:5’-ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ2-3’，[0047] 上游引物EV71-F:5’-GAGYATGATYGARACACGCTG-3’，

[0048] 下游引物EV71-R:5’-CGCTCTRCTRAAGAARCTATC-3’，

[0049] 特异性探针EV71-P:5’-FAM-AACTCGCACAGTACRGCTGARACCAC-BHQ1-3’，[0050] 上游引物CVA16-F:5’-CCCAATGGYGAGYTAGTCCCC-3’，

[0051] 下游引物CVA16-R:5’-GTTGGTRGCWGTYTGCCAAGC-3’，

[0052] 特异性探针CVA16-P:5’-VIC-AGTAYATGTATGTCCCRCCAGGGGCT-BHQ1-3’，[0053] 上游引物CVA6-F:5’-AARCCRGATAGYAGGAAATC-3’，

[0054] 下游引物CVA6-R:5’-GGGGTGGATCACTCAATTTTG-3’，

[0055] 特异性探针CVA6-P:5’-CY5-CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG–BHQ3-3’，[0056] 上游引物CVA10-F:5’-GAGACTGGACGYGTRCCA-3’，

[0057] 下游引物CVA10-R:5’-GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG-3’，

[0058] 特异性探针CVA10-P:5’-TAMRA-CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC-BHQ2-3’，[0059] 其中EV、EV71、CVA16、CVA6、CVA10的特异性探针序列5’端分别采用ROX、FAM、VIC、CY5、TAMARA等5种不同荧光基团标记，3’端分别采用与荧光基团对应的BHQ1、BHQ2或BHQ3淬灭基团标记。

[0060] 本发明提供的荧光定量试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；荧光PCR检测混合液需避光条件保存。

[0061] 实施例2

[0062] 1材料与方法

[0063] 1.1临床标本与病毒核酸：

[0064] 临床样本来源于浙江大学医学院附属第一医院及浙江省内其他几家医院手足口病确诊患者及疑似患者的粪便标本，样本采集后运送至实验室。EV71、CVA16、CVA6、CVA10及其他肠道病毒如柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒B1-B4型、埃克病毒9型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、支原体、金黄色葡萄球菌等的阳性核酸由传染病诊治国家重点实验室提供。

[0065] 1.2引物与探针

[0066] 从NCBI基因库下载了涵盖国内外各型别的肠道病毒及EV71、CVA16、CVA6、CVA10病毒的多条基因序列。利用BioEditor软件对其进行同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区。使用Primer Express 3.0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针，引物和探针序列均通过Blast验证，具有较好特异性。设计后最终筛选的引物探针序列如上所述，引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成。

[0067] 1.3病毒核酸的提取与标准品定量标准：

[0068] 取约0.2g粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置10min，以8000r/min离心5min。咽拭子标本的处理只需直接加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀后，其余处理过程同粪便样本。吸取200μl上清加入到EP管中，采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction KitII或QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit，按照试剂盒说明书进行提取,取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。

[0069] 合成EV定量标准品阳性核酸片段，将其连接到质粒载体pMDTM19-T Simple Vector(TaKaRa公司)，转化后培养。鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop  ND-2000 Spectrophotometer测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做十倍稀释至最低浓度，低温保存备用。1.4五重实时荧光定量RT-PCR反应体系和条件的优化：

[0070] 反应总体积为25μl，其中荧光PCR检测混合液15μl，酶混合液1μl，模板5μl，加水补足至25μl。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃,15min；95℃5min热启动，然后95℃15s，55℃45s，在55℃进行荧光检测，共进行40个循环。

[0071] 结果判断：选择荧光检测模式FAM、VIC、ROX、CY5、TAMARA荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物及探针在终浓度0.1～1μM范围内调整，采用矩阵法优选引物和探针的最佳配比，根据最低CT值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最佳引物和探针浓度。

[0072] 1.5五重实时荧光定量RT-PCR试剂盒的特异性、敏感性和重复性试验

[0073] 使用本试剂盒分别检测EV71、CVA16、CVA6、CVA10病毒及其他肠道病毒如柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒B1-B4型、埃克病毒9型、埃克病毒30型，以验证本试剂盒对不同亚型肠道病毒的覆盖检测能力。分别选择EV71、CVA16、CVA6、CVA10病毒的阳性核酸(均通过基因测序鉴定)和其他肠道病毒如柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒B1-B4型、埃克病毒9型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、支原体、金黄色葡萄球菌等的阳性核酸，用本试剂盒验证其特异性；对已标定拷贝数(copies/ml)的EV阳性假病毒颗粒样品稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个指定浓度的EV阳性假病毒颗粒样品作3次重复检测，得到的Ct值计算其标准差和变异系数，验证该方法的重复性。

[0074] 1.6五重实时荧光定量RT-PCR标准曲线的建立

[0075] 使用已标定拷贝数(copies/ml)的EV定量标准品1(103copies/ml)、EV定量标准品4 5 6
2(10copies/ml)、EV定量标准品3(10copies/ml)、EV定量标准品4(10copies/ml)、EV定量标准品5(107copies/ml)为模板用本试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增后，以标准品浓度的对数值为X轴，循环数为Y轴，绘制标准曲线。

[0076] 2结果

[0077] 2.1五重实时荧光定量RT-PCR反应体系及条件

[0078] 该方法的反应总体积为25μl，其中荧光PCR检测混合液15μl(其中PCR反应缓冲液12.5μl和引物探针混合液2.5μl；EV、EV71、CVA6引物和相应探针浓度比为2:1，CVAl6、CVA10引物和相应探针浓度比为3:2)，酶混合液1μl，模板5μl，加水补足至25μl。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃，15min；95℃5min热启动，然后95℃15s，55℃
45s，在55℃进行荧光检测，共进行40个循环。可获得最低Ct值和最高荧光强度。

[0079] 2.2特异性试验

[0080] 本发明建立的一步法五重荧光定量RT-PCR方法对肠道病毒及EV71、CVA16、CVA6、CVA10病毒具有极好的特异性，能完全检出临床阳性标本。本试剂盒能检出各不同亚型的肠道病毒，且EV71、CVA16、CVA6、CVA10之间无交叉反应。

[0081] 本发明中的EV71、CVA16、CVA6、CVA10引物探针与其他肠道病毒如柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒B1-B4型、埃克病毒9型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、支原体、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应。

[0082] 2.3敏感性试验

[0083] 对已标定拷贝数(copies/ml)的EV阳性假病毒颗粒样品十倍梯度稀释后，用本试剂盒进行检测，结果显示该方法检测敏感性达到102copies/ml。结果参见图1。取实时荧光定量RT-PCR产物3μl，120V恒压电泳20min，凝胶成像系统拍照。结果参见图2。其中Lane M为8
DL2000 Marker，Lane 1-6分别为片段(10 copies/ml)十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。电泳条带单一，亮度梯度分明，说明本试剂盒特异性好，定量结果相对准确。

[0084] 2.4重复性试验

[0085] 取已标定拷贝数(copies/ml)的EV阳性假病毒颗粒样品(终浓度为106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml)，对每一个浓度的样本作3个重复检测，结果不同浓度各自的检测CT值标准差在0.40～0.45之间，变异系数均低于1.96％，具有较好的重复性(结果见表
1)。

[0086] 表1 五重实时荧光定量RT-PCR检测EV阳性假病毒颗粒的重复性试验

[0087]

[0088]

[0089] 2.5标准曲线的建立

[0090] 实时荧光定量PCR扩增后，以标准品浓度的对数值为X轴，循环数为Y轴，绘制标准曲线。EV标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线如图3所示，其中斜率为3.552，截距为43.98，相关系数为0.995。由此可见，标准品浓度的对数值与循环数具有较好的线性关系。

[0091] 实施例3

[0092] 采用本试剂盒对临床样本的检测主要依托“十三五”重大专项-传染病病原检测技术平台项目(2017ZX10103008)和浙江省公益技术应用研究项目(2017C33044)。采集的临床样本主要来源于2013年3月至2014年4月间浙江大学医学院附属第一医院以及浙江省内其他几家医院手足口病患者及疑似患者粪便标本总共1340份。采用本方法中的五重实时荧光定量RT-PCR对收集到的标本进行验证，检测结果如下：肠道病毒阳性1090份，阳性检出率81.34％。EV71病毒阳性194份，占肠道病毒的17.80％；CVA16病毒阳性51份，占肠道病毒的
4.68％；CVA6病毒阳性550份，占肠道病毒的50.46％；CVA10病毒阳性114份，占肠道病毒的
10.46％。EV71、CVA16、CVA6、CVA10病毒四种肠道病毒型别的总数占检出肠道病毒的
83.39％。其中，本试剂盒用于检测确诊肠道病毒感染患者粪便标本EV71病毒阳性的实例如图4所示；检测确诊肠道病毒感染患者粪便标本CVA6病毒阳性的实例如图5所示；检测确诊肠道病毒感染患者粪便标本其他肠道病毒阳性的实例如图6所示。检测阳性结果与其已报告结果完全相符。