衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法

摘要

本发明公开了一种衍生化HPLC‑UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，该方法使用二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂对甲磺酸酯衍生化后生成在紫外光区有较强吸收的产物；衍生化反应液作为进样样品，基于反相高效液相色谱法的原理在紫外光区分离并测定甲磺酸酯的衍生化产物，从而实现对甲磺酸酯的定性或定量检测。本发明基于甲磺酸酯与二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂反应后生成产物具有紫外吸收特性，建立了一种简单、通用的衍生化HPLC‑UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法。方法学验证的结果显示该方法专属性和灵敏度良好。

权利要求

1.一种衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）、取甲磺酸样品，水：乙腈混合溶液溶解后加入反应体系中，用氢氧化钠调节反应体系pH到7-8，在80 ℃-100 ℃条件下，使用二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂进行衍生化反应

1-5 h获得反应液；其中，所述的反应体系为N,N-二甲基乙酰胺或二甲亚砜；所述的二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂为二乙基二硫代氨基甲酸钠、二苄基二硫代氨基甲酸钠和乙基黄原酸钾中的任意一种；

（2）、以步骤（1）中衍生化反应结束后的反应液作为进样样品，利用HPLC-UV法在272-

284 nm测定其中甲磺酸酯的衍生化产物，从而实现对甲磺酸中甲磺酸酯的定性或定量检测；其中，所述的甲磺酸酯为烷基取代的甲磺酸酯；所述的HPLC-UV法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；色谱柱采用250 mm×4.6 mm,5 μm的GL Sciences IntertSustain C18柱，采用极性流动相，流动相梯度：A相为乙腈，B相为5 mmol/L乙酸铵，0 min 60% A相，

16min 60% A相，21min 80%A相，26min 80% A相，27 min 60% A相，34 min 60% A相；检测波长位于272-284 nm。

2.根据权利要求1所述的衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，其特征在于所述的甲磺酸酯为甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯中的任意一种。

3.根据权利要求1或2所述的衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，其特征在于所述的衍生化反应的条件：以N,N-二甲基乙酰胺为反应体系，以二乙基二硫代氨基甲酸钠为衍生化试剂，用氢氧化钠调节反应体系pH到7，在80℃条件下进行衍生化反应；其中，二乙基二硫代氨基甲酸钠浓度为0.2-2 mg/mL，反应时间为1 h。

4.根据权利要求3所述的衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，其特征在于所述的衍生化反应的条件：以N,N-二甲基乙酰胺为反应体系，以二乙基二硫代氨基甲酸钠为衍生化试剂，用氢氧化钠调节反应体系pH到7，在80℃条件下进行衍生化反应；其中，二乙基二硫代氨基甲酸钠浓度为0.2 mg/mL，反应时间为1 h。

5.根据权利要求1所述的衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，其特征在于检测波长位于275-277 nm。

6.根据权利要求5所述的衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，其特征在于检测波长位于277 nm。

7.根据权利要求6所述的衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，其特征在于步骤（2）中，所述的HPLC-UV法使用的仪器为Shimadzu LC 20AT液相色谱仪，该色谱仪配置有在线真空脱气机、二元梯度泵，自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站；色谱柱采用250 mm×4.6 mm,5 μm的GL Sciences IntertSustain C18柱；进样量：20 μL；流动相流速：1.0 mL/min；流动相梯度：A相为乙腈，B相为5 mmol/L乙酸铵，0 min 60% A相，16min 60% A相，21min 80%A相，26min 80% A相，27 min 60% A相，34 min 60% A相；柱温：30 ℃；检测波长：277 nm。

说明书

衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法

技术领域

[0001] 本发明属于药品分析检测领域，涉及一种衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸酯的方法，尤其涉及一种衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法。

背景技术

[0002] 潜在基因毒性杂质(potential genotoxic impurities)是强致突变剂和致癌剂，能够引起 DNA突变、染色体断裂或者DNA重组，还可能导致人类肿瘤的发生[1,2]。近几年来，随着基因毒性杂质法规的逐步完善，美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药物管理局(EMEA)等部门对基因毒性杂质的监管要求越来越高[3,4]。药物中基因毒性杂质如果控制不当，可能会导致临床隐患，同时也会影响新药上市时间，因此，在药物生产过程中，对于潜在基因毒性杂质的控制十分重要[5,6]。

[0003] 甲磺酸酯是一类常见的潜在基因毒性杂质，近年来越来越受到药品监管部门的关注，这主要与2007年罗氏公司生产的泛罗赛因含过量甲磺酸乙酯而被从欧洲市场撤市有[7-10]关 。经调查，泛罗赛中残留的甲磺酸乙酯主要来源是原料甲磺酸中含有的甲磺酸乙酯残留[11]。在药物合成过程中，甲磺酸常作为平衡离子被用来进行成盐反应，而这类成盐反应一般都在药品生产的最后一步[12,13]，因此甲磺酸中残留的甲磺酸酯是原料药中甲磺酸酯的主要来源[14,15]。甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)是两种常见的甲磺酸酯基因毒性杂质，欧洲药典8.0收载了气相色谱-质谱(GC-MS)法用于检测甲磺酸中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的标准方法，该方法需要将待测物衍生化成可挥发性的碘代烷烃，然后液液萃取，方能进行分析[16-18]。而其他常见的用于测定甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的方法大多数也都是基于质谱方法，虽然质谱检测器是一种灵敏和通用的检测器，然而高昂的价格限制了它的广泛使用[2,5,19-23]。

[0004] 高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)法是药物质量控制的常用手段，开发一种简单、灵敏、稳定的HPLC-UV法用于甲磺酸中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯具有重要意义。然而该方法的开发面临一个重要挑战，即甲磺酸酯缺乏能用于紫外检测的发色基团，因此我们希望通过液相衍生化技术，利用亲核取代反应，引入发色基团来解决这个问题。三乙胺和哌啶被报道作为衍生化试剂用于液相色谱-质谱(LC-MS)法和毛细管色谱-质谱(CE-MS)法测定甲磺酸酯的含量[19-21]。然而，这些衍生化试剂的产物(季铵盐)由于硅羟基作用会造成拖尾现象，降低检测灵敏度。五氟硫酚和硫氰酸盐是强亲核试剂，被用作衍生化试剂用于气相色谱-质谱(GC-MS)法测定甲磺酸酯含量[22,23]。但五氟硫酚极易氧化，用于HPLC检测，会产生干扰。而硫氰酸盐衍生化会产生多种衍生化产物，导致低灵敏度。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸酯的方法。

[0006] 本发明的另一目的是提供衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法。

[0007] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：

[0008] 一种衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸酯的方法，包括：使用二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂对甲磺酸酯衍生化生成在紫外光区272-284nm有较强的吸收的衍生化产物，利用 HPLC反相分配色谱法在紫外光区272-284nm测定甲磺酸酯的衍生化产物，从而实现对甲磺酸酯的定性或定量检测。

[0009] 优选的，所述的衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸酯的方法，包含以下步骤：

[0010] (1)、用氢氧化钠调节反应体系pH到7-8，在80-100℃条件下，使用二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂对甲磺酸酯衍生化反应生成在紫外光区272-284nm有较强的吸收的产物；

[0011] (2)、利用HPLC-UV法，基于反相分配色谱法原理在紫外光区272-284nm测定步骤 (1)中获得的甲磺酸酯衍生化产物，从而实现对甲磺酸酯的定性或定量检测。

[0012] 所述的甲磺酸酯为烷基取代的甲磺酸酯，优选为甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯中的任意一种。

[0013] 所述的二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂选自二乙基二硫代氨基甲酸钠、二苄基二硫代氨基甲酸钠和乙基黄原酸钾中的任意一种，优选为二乙基二硫代氨基甲酸钠，二乙基二硫代氨基甲酸钠与甲磺酸酯衍生化生成在紫外光区275-277nm有较强吸收的衍生化产物。

[0014] 所述的反应体系为N,N-二甲基乙酰胺或二甲亚砜，优选为N,N-二甲基乙酰胺。

[0015] 优选的，所述的衍生化反应的条件：以N,N-二甲基乙酰胺为反应体系，以二乙基二硫代氨基甲酸钠为衍生化试剂，用氢氧化钠调节反应体系pH到7，在80℃条件下进行衍生化反应；其中，二乙基二硫代氨基甲酸钠浓度为0.2-2mg/mL，优选为0.2mg/mL，反应时间为1-5h，优选为1h。

[0016] 所述的HPLC-UV法：采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于272-284nm、优选为275-277nm、进一步优选为277 nm。

[0017] 优选的，所述的HPLC-UV法使用的仪器为Shimadzu LC 20AT液相色谱仪，该色谱仪配置有在线真空脱气机、二元梯度泵，自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的GL Sciences IntertSustain C18柱；进样量： 20μL；流动相流速：1.0mL/min；流动相梯度：A相为乙腈，B相为5mmol/L乙酸铵溶液，0min 60％A相，16min 60％A相，21min 80％A相，26min 80％A相，27min 60％A 相，34min 60％A相；柱温：30℃；检测波长：277nm。

[0018] 本发明所述的方法在用于甲磺酸样品中甲磺酸酯的定性与定量检测的应用。

[0019] 一种衍生化HPLC-UV法测定甲磺酸中甲磺酸酯的方法，包含以下步骤：

[0020] (1)、取甲磺酸样品，水：乙腈混合溶液溶解后加入反应体系中，用氢氧化钠调节反应体系pH到7～8，在80℃～100℃条件下，使用二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂进行衍生化反应1-5h获得反应液；

[0021] (2)、以步骤(1)中衍生化反应结束后的反应液作为进样样品，利用HPLC-UV法在272-284nm测定其中甲磺酸酯的衍生化产物，从而实现对甲磺酸中甲磺酸酯的定性或定量检测。

[0022] 所述的甲磺酸酯选自烷基取代的甲磺酸酯，优选为甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯中的任意一种。

[0023] 所述的二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂选自二乙基二硫代氨基甲酸钠、二苄基二硫代氨基甲酸钠和乙基黄原酸钾中的任意一种，优选为二乙基二硫代氨基甲酸钠。

[0024] 所述的反应体系为N,N-二甲基乙酰胺或二甲亚砜，优选为N,N-二甲基乙酰胺。

[0025] 所述的水：乙腈混合溶液由等体积的水和乙腈混合而成。所述的甲磺酸和水：乙腈混合溶液的用量比为5mg：4μL。甲磺酸在反应体系中的终浓度为50mg/mL。

[0026] 优选的，所述的衍生化反应的条件：以N,N-二甲基乙酰胺为反应体系，以二乙基二硫代氨基甲酸钠为衍生化试剂，用氢氧化钠调节反应体系pH到7，在80℃条件下进行衍生化反应；其中，二乙基二硫代氨基甲酸钠浓度为0.2mg/mL，反应时间为1h。

[0027] 优选的，所述的HPLC-UV法：采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于272-284nm、优选为275-277nm、进一步优选为277nm。

[0028] 优选的，所述的HPLC-UV法使用的仪器为Shimadzu LC 20AT液相色谱仪，该色谱仪配置有在线真空脱气机、二元梯度泵，自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的GL Sciences IntertSustain C18柱；进样量： 20μL；流动相流速：1.0mL/min；流动相梯度：A相为乙腈，B相为5mmol/L乙酸铵，0 min 60％A相，16min 60％A相，21min 80％A相，26min 80％A相，27min 60％A相，34 min 60％A相；柱温：30℃；检测波长：277nm。

[0029] 本发明的有益效果：

[0030] 本发明基于二硫代氨基甲酸盐类衍生化试剂的烷基衍生化产物具有紫外吸收的特征，建立了一种简单、通用的衍生化HPLC-UV测定甲磺酸酯的方法。方法学验证的结果显示甲磺酸中甲磺酸和其他杂质均不会对分析造成干扰，该方法专属性良好。此外，方法的检测限为 0.01μg/mL,定量限为0.03μg/mL，线性关系良好(r>0.999)；日内和日间精密度分别小于 4.8％和6.8％；平均回收率在88.7-103.8％之间(RSD<5.0％)，无明显的基质干扰；且衍生化产物在8h内稳定性良好。

附图说明

[0031] 图1为以二乙基二硫代氨基甲酸钠为衍生化试剂，相同衍生化反应条件下，不同甲磺酸酯衍生化产物的色谱图；a为甲磺酸酯混合贮备液的衍生化产物色谱图，b为第一批甲磺酸样品的衍生化产物色谱图，c为第二批甲磺酸样品的衍生化产物色谱图，d为第三批甲磺酸样品的的衍生化产物色谱图，e为二乙基二硫代氨基甲酸钠空白溶液。

[0032] 图2为反应溶剂对甲磺酸酯衍生化反应的影响：A为有机溶剂对衍生化效率的影响；B 为pH值对衍生化效率的影响。

[0033] 图3为反应条件对甲磺酸酯衍生化反应的影响：A为反应温度和反应时间对甲磺酸甲酯衍生化效率的影响；B为反应温度和反应时间对甲磺酸乙酯衍生化效率的影响；C为二乙基二硫代氨基甲酸钠浓度对衍生化效率的影响。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明。

[0035] 1.1.仪器

[0036] Shimadzu LC 20AT液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵，自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站)；Aglient 6520 LC-TOF液相色谱串联质谱仪 (含在线真空脱气机、高压二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、电喷雾 (ESI)接口和Agilent Mass Hunter Acquisition Software Ver.A.01.00工作站)；METTLER TOLEDO AB135-S分析天平(梅特勒瑞典公司)；sartorious BS110分析天平(北京赛多利斯有限公司)。

[0037] 1.2.试剂

[0038] 甲磺酸甲酯(99.0％)、甲磺酸乙酯(98.5％)，甲磺酸(99.0％)，二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物(99.0％)，二苄基二硫代氨基甲酸钠X水合物(98.0％)，乙基黄原酸钾 (98.0％)，乙腈(色谱纯)，N,N-二甲基甲酰胺(色谱纯)，N,N-二甲基乙酰胺(色谱纯)，二甲亚砜(DMSO)，二甲基吡咯烷酮(色谱纯)，丙酮(分析纯)，乙酸铵，氢氧化钠(分析纯)，纯化水，乙腈(色谱纯)。

[0039] 1.3.溶液的制备

[0040] 甲磺酸酯贮备液和系列混合贮备液的制备：

[0041] 甲磺酸甲酯贮备液：取甲磺酸甲酯约25mg，精密称定，置于25mL量瓶中，用N,N- 二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀即可。

[0042] 甲磺酸乙酯贮备液：取甲磺酸乙酯约25mg，精密称定，置于25mL量瓶中，用N,N- 二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀即可。

[0043] 系列甲磺酸酯混合贮备液：精密移取等量甲磺酸甲酯贮备液和甲磺酸乙酯贮备液，置于 10mL量瓶中，加入N,N-二甲基乙酰胺定容到刻度，稀释成含有相同浓度甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的一系列混合贮备液(浓度为1.5、2.5、5、10、25、100、250μg/mL)。

[0044] 衍生化试液的制备：

[0045] 二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)、二苄基二硫代氨基甲酸钠(DBDTC)和乙基黄原酸钾(PEX)试液：分别取上述试剂约20mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀即可。

[0046] 10mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液：取NaOH 20.0g，精密称定，置于50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即可。需新鲜配制。

[0047] 1.4.HPLC-UV条件

[0048] 色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的GL Sciences IntertSustain C18柱；流动相流速： 1.0mL/min；流动相梯度：A相为乙腈，B相为5mmol/L乙酸铵，0min 60％A相，16min 60％A相，21min 80％A相，26min 80％A相，27min 60％A相，34min 60％A相；柱温：30℃；检测波长：277nm。

[0049] 实施例1衍生化试剂的比较

[0050] 精密移取三次、每次100μL的浓度为250μg/mL的甲磺酸酯混合贮备液，分别置于三个5mL量瓶中，依次加入200μL水和500μL的二硫代氨基甲酸盐类衍生化试液，加N,N- 二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-DAD进样分析。

[0051] HPLC-DAD条件：Shimadzu LC 20AT液相色谱仪(含在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站)；色谱条件同1.4所述； DAD扫描波长：200-400nm。

[0052] 3种衍生化试剂与甲磺酸甲酯生成的衍生化产物紫外最大吸收波长分别为275nm(二乙基二硫代氨基甲酸钠)、276nm(二苄基二硫代氨基甲酸钠)和277nm(乙基黄原酸钾试液)。三种衍生化试剂与甲磺酸乙酯生成的衍生化产物紫外最大吸收波长分别为277nm(二乙基二硫代氨基甲酸钠)、272nm(二苄基二硫代氨基甲酸钠)和284nm(乙基黄原酸钾试液)。3种二硫代氨基甲酸盐衍生物都具有较强紫外检测灵敏度，其中二乙基二硫代氨基甲酸钠灵敏度最强，且二乙基二硫代氨基甲酸钠是最常见的商品化二硫代氨基甲酸盐试剂，故而，本发明选择二乙基二硫代氨基甲酸钠进行后续研究。

[0053] 实施例2衍生化产物的鉴定

[0054] 精密移取100μL浓度为250μg/mL的甲磺酸酯混合贮备液，置于5mL量瓶中，依次加入200μL水和500μL的DDTC衍生化试液，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10 s，摇匀。80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-MS进样分析。

[0055] HPLC-MS条件：Agilent 6224-TOF高效液相色谱-精密质谱联用仪；色谱条件同1.4所述；质谱离子源：ESI(+)；扫描范围：m/z 90-230；干燥气体(N2)流速：8.0L/min；干燥气体温度：325℃；毛细管电压：3.5kV；分辨率：200，000。

[0056] 高效液相色谱精密质谱测定结果为：甲磺酸甲酯与DDTC的衍生化产物峰的测定分子量为164.0555，与二乙基二硫代氨基甲酸甲酯的理论计算值(164.0562)之间的误差为4.27 ppm，表明反应生成的产物为二乙基二硫代氨基甲酸甲酯；甲磺酸乙酯与DDTC的衍生化产物峰的测定分子量为178.0712，与二乙基二硫代氨基甲酸乙酯的理论计算值(178.0719)之间的误差为3.93ppm，表明反应生成的产物为二乙基二硫代氨基甲酸乙酯。

[0057] 实施例3衍生化溶剂的优化

[0058] 亲核取代反应在非质子性溶剂中速率较快，因此本实验选择了包括N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜在内的六种非质子性溶剂进行优化。

[0059] 精密移取六次、每次100μL的5μg/mL甲磺酸酯混合贮备液，分别置于六个5mL量瓶中，加入200μL水和500μL的DDTC衍生化试剂，分别加六种上述非质子性溶剂稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。

[0060] 图2A显示，当对甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯进行衍生化时，甲磺酸乙酯衍生化产物的生成明显受到反应溶剂的影响。当反应溶剂为N,N-二甲基乙酰胺和二甲亚砜时，衍生化产物峰面积较高。而N,N-二甲基乙酰胺的空白干扰较二甲亚砜小，所以选择N,N-二甲基乙酰胺作为衍生化反应溶剂进行后续研究。

[0061] 实施例4衍生化溶剂pH值的考察

[0062] 取六份甲磺酸约250mg，精密称定，分别置于5mL量瓶中，加入200μL水：乙腈混合溶液(50:50，v/v)溶解，加入不同量的氢氧化钠溶液将六份溶液分别调节到pH值3.0、 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，再加入100μL的5μg/mL甲磺酸酯混合贮备液和500μL的DDTC 衍生化试液，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。

[0063] 图2B显示，当对甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯进行衍生化时，甲磺酸酯衍生化产物的生成明显受到溶液pH的影响。当反应溶液pH值为3-4时，衍生化产物峰面积很少，而pH为7- 8时，衍生化产物峰面积明显增高并达到平台。由于过高pH可能损伤色谱柱，所以选择7 作为样品溶液pH值。

[0064] 实施例5衍生化温度和时间的考察

[0065] 精密移取六次、每次100μL的5μg/mL甲磺酸酯混合贮备液，分别置于六个5mL量瓶中，加入200μL水和500μL的DDTC衍生化试液，分别加六种上述非质子性溶剂稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。分别在60℃水浴加热0.5、1、2、3、4、5h后取20μL注入 HPLC-UV进样分析。同法考察衍生化产物峰面积在80℃和100℃反应时的变化。

[0066] 图3A表明甲磺酸甲酯衍生化产物峰面积在80℃-100℃间受温度影响较小；由图3B可以看出甲磺酸乙酯衍生化产物峰面积在80℃时最佳，且在1h后其提升趋势较为缓慢。因此选择衍生化反应温度为80℃，反应时间为1h。

[0067] 实施例6衍生化试剂浓度的考察

[0068] 精密移取十次、每次100μL的5μg/mL甲磺酸酯混合贮备液，分别置于十个5mL量瓶中，加入200μL水和不同体积的DDTC衍生化试液，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，配置成DDTC浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/mL的样品溶液，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入 HPLC-UV进样分析。

[0069] 图3C显示，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯衍生化产物峰面积随着衍生化试剂浓度的增加而增加，当浓度大于0.2mg/mL后逐渐趋于饱和，因此选择衍生化试剂在样品溶液中的终浓度为0.2mg/mL。

[0070] 实施例7方法学验证与应用

[0071] 7.1.专属性

[0072] 精密移取100μL的5μg/mL甲磺酸酯混合贮备液，置于5mL量瓶中，加入200μL水和500μL的DDTC衍生化试液，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。 80℃水浴加热
1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。色谱图将图1中a。

[0073] 分别称取三个不同批次的甲磺酸约250mg，精密称定，分别置于5mL量瓶中，加入 200μL水：乙腈混合溶液(50:50，v/v)溶解和500μL的DDTC衍生化试液，用氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热 1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。色谱图见图1中b、 c、d。

[0074] 精密移取100μL的空白乙腈，置于5ml量瓶中，加入200μL水和500μL的DDTC衍生化试液，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。色谱图如图1中e。

[0075] 上述色谱图中衍生化产物色谱峰与衍生化试剂色谱峰、甲磺酸色谱峰分离度良好，其他杂质峰亦不干扰甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的测定，说明方法的专属性良好。

[0076] 7.2.线性与范围

[0077] 分别精密移取100μL的甲磺酸酯系列混合贮备液，置于5mL量瓶中，加入200μL水和500μL的DDTC衍生化试液，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀，制成含甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯浓度分别为0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、2、5μg/mL的甲磺酸酯对照品溶液。
上述溶液80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入 HPLC-UV进样分析。

[0078] 以甲磺酸酯浓度C(μg/mL)为横坐标，衍生化产物峰面积(A)为纵坐标，采用最小二乘法进行线性回归分析，计算线性回归方程及相关系数。结果显示，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯线性范围为0.03～5μg/mL，且各待测物线性关系良好(r>0.999)。结果见表1。

[0079] 7.3.检测限与定量限

[0080] 以信噪比3:1为方法的检测限，以信噪比10:1为方法的定量限。结果显示，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的检测限为0.01μg/mL，定量限为0.03μg/mL。具体见表1。

[0081] 7.4.精密度试验(日内精密度和日间精密度)

[0082] 按7.2.项下方法配制浓度为0.05μg/mL的甲磺酸酯对照品溶液，上述溶液80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV重复进样6次，计算衍生化产物峰面积之间的RSD作为日内精密度；同一浓度样品连续3天每天重复进样6次，计算衍生化产物峰面积计算RSD值作为日间精密度。由表1可知，此方法的日内精密度和日间精密度良好，RSD分别小于4.8％和6.8％。

[0083] 7.5.衍生物稳定性

[0084] 按7.2.项下方法配制浓度为0.05μg/mL的甲磺酸酯对照品溶液，上述溶液80℃水浴加热1h，取出放冷0，1，2，4，6、8h时分别取20μL注入HPLC-UV进样分析，以待测物峰面积的变化考察衍生物的稳定性。由表1可知，衍生化产物室温放置时，在0～8h内峰面积的RSD小于4.1％，即稳定性良好。

[0085] 表1方法学试验结果

[0086]

[0087] x-待测物浓度(μg/mL),y-峰面积,r-回归方程的相关系数。

[0088] 7.6.加样回收率

[0089] 为了评价该方法的准确性，分别计算了各甲磺酸酯在甲磺酸中的加样回收率。

[0090] 对照品溶液：按7.2项下方法配制不同浓度(0.03、0.05、0.5、5μg/mL)的甲磺酸酯对照品溶液，不加甲磺酸本底，每个浓度水平3份。上述溶液80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。

[0091] 回收率样品溶液：取十二份甲磺酸约250mg，精密称定，分别置于5mL量瓶中，再精密移取100μL不同浓度的甲磺酸酯混合贮备液配置成含甲磺酸酯浓度为0.03、0.05、0.5、5 μg/mL的四组回收率样品溶液，每组样品三份；每份样品加入200μL水：乙腈混合溶液 (50:50，v/v)溶解和500μL的DDTC衍生化试液，用氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。上述溶液80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。

[0092] 空白样品溶液：称取甲磺酸约250mg，精密称定，分别置于5mL量瓶中，加入200μL 水：乙腈混合溶液(50:50，v/v)溶解和500μL的DDTC衍生化试液，用氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。

[0093] 加样回收率＝(回收率样品溶液峰面积-空白样品溶液峰面积)/对照品溶液峰面积×100％。

[0094] 由表2可知，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的加样回收率在88.73～103.8％之间，且RSD 均小于5.0％。

[0095] 表2加样回收率试验结果

[0096]

[0097] 实施例8

[0098] 精密移取100μL的5μg/mL甲磺酸酯混合贮备液，置于5ml量瓶中，加入200μL水和 500μL的DDTC衍生化试液，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热
1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。

[0099] 称取甲磺酸约250mg，精密称定，分别置于5mL量瓶中，加入200μL水：乙腈混合溶液(50:50，v/v)溶解和500μL的DDTC衍生化试液，用氢氧化钠溶液调节pH值为 7.0，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，涡旋10s，摇匀。80℃水浴加热1h，取出放冷至室温，过滤后，取20μL注入HPLC-UV进样分析。

[0100] 按外标法根据衍生化产物的峰面积计算甲磺酸中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量 (μg/g)，共测定三批不同来源的甲磺酸样品，结果如表3所示。

[0101] 表3本发明方法在三批甲磺酸样品中的测定结果

[0102]

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