一株四环素类抗生素降解菌及其应用

摘要

本发明涉及微生物降解处理的一株能同时降解四环素、氧四环素和金霉素三种四环素类抗生素降解菌Methylobacteriumsp.YWF1。所述的降解菌YWF1经鉴定为甲基杆菌（Methylobacterium），于2017年04月17日保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，其保藏编号为CGMCC No.14040。Methylobacteriumsp. YWF1能够同时降解四环素、氧四环素和金霉素三种四环素类抗生素，可将该菌制备成微生物菌剂悬液，应用于畜牧废水、四环素类制药企业废水、医药废水或土壤等不同环境介质中四环素类抗生素污染物的降解去除，具备良好的工业应用前景和环境效益。

权利要求

1.一株四环素类抗生素降解菌YWF1，其特征在于：所述四环素类抗生素降解菌YWF1于

2017年04月17日保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，其保藏号CGMCC No.14040。

2.根据权利要求1所述的四环素类抗生素降解菌YWF1种子液，其特征在于：将保种的菌YWF1用含乙酸钠的磷酸钠缓冲溶液培养基进行活化，并制成种子液。

说明书

一株四环素类抗生素降解菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及环境保护与新型有机污染物微生物降解技术领域，尤其是涉及一株四环素类抗生素降解菌YWF1及其应用。

背景技术

[0002] 四环素类抗生素是由链霉菌培养液中提取或经半合成而得的一类抗生素，因分子结构中有4个环而得名，故称四环素族。其中，四环素(Tetracycline, TC)、氧四环素(Oxytetracycline, OTC)和金霉素(Chlorotetracycline, CTC)是四环素类抗生素应用广泛的三种主要抗生素。四环素类抗生素的作用机理为通过细胞外膜的亲水性孔，由内膜上能量依赖性转移系统进入细胞，与核糖体30S亚基特异结合，阻止氨基酰-tRNA联结，从而抑制肽链延长和蛋白质合成。此外，也可以改变细菌细胞膜通透性，导致胞内重要成分外漏，迅速抑制DNA的复制，从而抑制细菌生长。在一些国家，四环素类抗生素被广泛应用于农牧养殖业中，被大量用作生长促进剂投喂给动物，而据文献报道，进入动物体内的四环素类抗生素无法被其机体完全吸收，大量的四环素类抗生素母体或其活性成分以动物的粪便和尿液的形式排出体外，从而进入众多环境媒介。此外，由于其结构稳定而在环境中长期赋存，且传统的污水处理系统无法有效地完全去除四环素类抗生素，故发现一种能够同时降解多种四环素类抗生素的工程菌，投加于受污染环境，具有重要的意义。

[0003] 通过对国内外研究的调查发现，目前所筛选出的对四环素类抗生素具有降解能力的工程菌较少，并且大多数只能对TC或CTC具有降解效果，无法对受到多种四环素类抗生素污染的环境起到很好的降解修复效果。中国专利号：CN 201210049934.5和专利号：CN 201310390986.3分别报道了一株木霉菌Hypocrea Lixii  LJ245  和一株米曲霉Aspergillus oryzae LJ366用于降解CTC，两株不同的菌株均可以CTC为唯一碳源作为能源生长，其菌剂能够应用于受CTC污染环境的生物修复。但目前未发现能同时降解三种四环素类抗生素（TC、OTC和CTC）的降解工程菌，而当前环境的污染现状常是多种抗生素同时存在的复杂污染体系，而不是单一抗生素的简单体系，所以筛选出一株能够同时降解多种四环素类抗生素的降解工程菌，并将其制成微生物菌剂应用于实际受到一种或多种抗生素污染的环境中，提高对抗生素污染物的降解去除，这对降低由抗生素污染所引起环境破坏、生态失衡和减少抗性菌的产生等风险具有重要的现实意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株四环素类抗生素降解菌YWF1及其应用。筛选出的四环素类抗生素降解菌YWF1，能高效同步降解三种四环素类抗生素，可将降解工程菌制备成微生物菌剂悬液，应用于畜牧废水、四环素类制药企业废水、医药废水或土壤等不同环境介质中四环素类抗生素污染物的高效降解，具有高效、节能和环保等优点，具备良好的工业应用前景和环境效益。

[0005] 上述目的与任务是通过如下技术方案实现：

[0006] 一株四环素类抗生素工程菌YWF1，其特征在于：所述四环素类抗生素降解菌YWF1于2017年04月17日保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，其保藏号CGMCC No.14040。经鉴定该菌为甲基杆菌属（Methylobacterium）的一种。

[0007] 所述的四环素类抗生素降解菌YWF1是在37 ℃下从农场猪粪样品中，通过富集、驯化和分离纯化得到。该菌的筛选方法具体步骤如下：

[0008] 1）扩大培养驯化：取5 mL猪粪所浸取的上清液，加入含1 g/L乙酸钠的100 mL 50 mmol/L磷酸钠缓冲溶液溶液中，扩大培养猪粪中所得微生物；待培养一周后，将培养基离心并把沉淀菌体添加入含10 mg/L TC、OTC和CTC的上述培养基中，每隔一周转接一次菌体，直至5周之后进行平板划线分离。

[0009] 2）平板划线分离纯化：从上述扩大培养驯化的培养基中取2 mL菌液，在超净工作台中，在含5 mg/L TC、OTC和CTC混合抗生素筛选平板中划线分离后置于37 ℃恒温培养箱中避光培养。

[0010] 3）液体培养基纯化培养：等到上述筛选平板中的菌落长出，挑选单菌落至以5 mg/L TC、OTC和CTC为唯一碳源的液体培养基中，置于37 ℃摇床避光振荡培养。

[0011] 4）重复纯化：待上述液体培养基菌液浑浊，重复上述平板划线分离工作6 10次，直~至筛选出以TC、OTC和CTC为唯一碳源的降解纯菌YWF1为止。

[0012] 上面所述的50 mmol/L 磷酸钠缓冲溶液（pH为7.0）组成为：Na2HPO4.12H2O（10.92 g/L），NaH2PO4. 2H2O（3.04 g/L），NH4Cl（0.31 g/L），KCl（0.13 g/L）。

[0013] 上面所述的 TC、OTC和CTC混合抗生素选择性筛选平板制备方法为：配制100 mL 50 mmol/L磷酸钠缓冲溶液，加入2g琼脂条，放入高压蒸汽灭菌锅中以121 ℃灭菌20 min后取出置于超净工作台冷却。待冷却至一定程度后（手触摸温度不烫手，但也要保证琼脂不凝固），分别加入0.5 mL 1g/L TC、OTC和CTC母液，然后轻轻振荡摇晃混合均匀，再倾倒在一次性无菌培养皿中，待其冷却凝固后制备出含5 mg/L TC、OTC和CTC混合抗生素的筛选平板。

[0014] 上面所述的TC、OTC和CTC混合抗生素液体培养基配制：配制100 mL 50 mmol/L 磷酸钠缓冲溶液，放入高压灭菌锅中以121 ℃灭菌20 min后取出置于超净工作台完全冷却，在超净工作台中向培养基中分别加入0.5 mL 1 g/L TC、OTC和CTC母液，混匀，即为以5 mg/L TC、OTC和CTC为唯一碳源的液体培养基。

[0015] 所述的四环素类抗生素降解能力测试方法为：将保种的菌YWF1用含1 g/L乙酸钠的磷酸钠缓冲溶液液体培养基进行活化，并制成种子液。将种子液接种至分别以10 mg/L TC、OTC和CTC为唯一碳源的磷酸钠缓冲溶液培养基（pH为7.0）和以10 mg/L TC、OTC和CTC为混合碳源的液体培养基（四环素类抗生素总浓度为30 mg/L，pH为7.0），置于37℃，摇床转速为150 rpm条件下避光培养，定时取样检测其中抗生素浓度变化，根据检测结果可知，降解菌YWF1分别以TC、OTC和CTC为唯一碳源时的去除效果如下：在36h内，降解菌YWF1对10 mg/L CTC去除效率最高，达到99.00% ± 0.01%，其次是OTC，去除率为62.44% ± 2.19%，而对TC去除率为7.37% ± 4.87%。而在混合类抗生素处理组中，CTC在36h内去除率达到83.18% ± 0.82%，而OTC和TC去除率分别为27.71% ± 2.98%和24.40% ± 2.40%。上述结果表明，降解菌YWF1既能在单一四环素类抗生素存在的情况下实现良好降解，也能在同时受三种四环素类抗生素污染的环境中实现降解去除。

[0016] 所述的四环素类抗生素降解菌YWF1可作为微生物菌剂应用于单一四环素类抗生素污染的环境中，也可以投加于混合四环素类抗生素污染的生活污水或医药废水等环境中，降解其中的四环素类抗生素污染物。

附图说明

[0017] 图1为Methylobacteriumsp. YWF1扫描电子显微镜下的形貌

[0018] 图2为Methylobacteriumsp. YWF1对四环素、氧四环素和金霉素单一抗生素的降解

[0019] 图3为Methylobacteriumsp. YWF1对四环素、氧四环素和金霉素混合抗生素的降解。

具体实施方式

[0020] 下面结合附图详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0021] 实施例1

[0022] 将预先在乙酸钠为碳源中培养好的降解菌YWF1悬液接种入分别以10 mg/L TC、OTC和CTC为唯一碳源的液体培养基，将其放在37 ℃的摇床中以150 rpm转速避光培养。定时取样，利用高效液相色谱测定其中抗生素浓度变化。由附图2可知，降解菌YWF1分别以TC、OTC和CTC为唯一碳源时的去除效果如下：相比于无菌对照组，在36h内，降解菌YWF1对10 mg/L CTC、OTC和TC的去除效率分别为99.00% ± 0.01%、62.44% ± 2.19% 和7.37% ± 4.87%。上述结果表明，降解菌YWF1能在单一四环素类抗生素存在的情况下实现良好降解。

[0023] 上述实验中，以10 mg/L TC、OTC和CTC为唯一碳源的液体培养基配制如下：配制100 mL 50 mmol/L磷酸钠缓冲溶液，放入高压灭菌锅中以121 ℃灭菌20 min后取出置于超净工作台完全冷却，在超净工作台中向培养基中分别加入1mL 1 g/L TC、OTC和CTC母液，混匀，即为以10 mg/L TC、OTC和CTC为唯一碳源的液体培养基。

[0024] 实施例2

[0025] 将预先在乙酸钠为碳源中培养好的降解菌YWF1悬液接种入以TC、OTC和CTC为混合碳源的液体培养基（四环素类抗生素总浓度为30mg/L，pH为7.0），将其放在37 ℃的摇床中以150 rpm转速避光培养。定时取样，利用高效液相色谱测定其中三种抗生素的浓度变化，同时利用紫外分光光度计测定OD600来研究降解菌YWF1在以混合四环素类抗生素为唯一底物下的生长情况。由附图3可知，降解菌YWF1能在三种四环素类同时存在的液体培养基中，以三种四环素类抗生素为混合碳源生长。降解菌YWF1在混合类抗生素处理组中在36h内对CTC、OTC和TC的去除率分别为83.18% ± 0.82%、27.71% ± 2.98%和24.40% ± 2.40%。上述结果表明，降解菌YWF1能在同时受三种四环素类抗生素污染的环境中实现降解去除。

[0026] 上述实验中，以TC、OTC和CTC为混合碳源的液体培养基配制如下：配制100 mL 50 mmol/L磷酸钠缓冲溶液，放入高压灭菌锅中以121 ℃灭菌20 min后取出置于超净工作台完全冷却，在超净工作台中分别加入1 mL 1 g/L TC、OTC和CTC母液于上述一瓶磷酸钠缓冲溶液中，混匀，即为以10mg/L TC、OTC和CTC为混合碳源的液体培养基。