制造用于将抗癌药物递送到肿瘤细胞的氮化硼纳米颗粒的方法

摘要

技术领域。本发明涉及纳米医学技术，即涉及制造用于递送抗癌化疗药物的纳米载体。发明内容。本发明的技术效果包括：通过增加含有抗癌药物的纳米颗粒的细胞吞噬来增加抗癌化疗的效率，并避免使用分散的直径为50‑300nm且具有良好外表面的氮化硼纳米颗粒带来的纳米容器的细胞毒性。技术效果通过以下方法实现。制造用于将抗癌药物递送到肿瘤细胞的氮化硼纳米颗粒的方法，包括通过化学气相沉积合成尺寸为50‑300nm且具有良好外表面的球形氮化硼纳米颗粒，所述化学气相沉积使用反应气氨气、运输气氩气和由无定型硼和氧化制剂组成的粉末混合物进行。所述化学气相沉积在以下条件下进行：1000≤T≤1430，1.2≤ξ≤8，其中，T是粉末混合物的温度，ξ是特定的流量比FAr/FNH3，其中，FAr是运输气的流量，FNH3是反应气的流量。超声处理氮化硼纳米颗粒的团聚物，再饱和吸附抗癌药物，然后用蒸馏水洗涤。

权利要求

1.制造用于将抗癌药物递送到肿瘤细胞的氮化硼纳米颗粒的方法，包括通过化学气相沉积合成尺寸为50-300nm且具有良好外表面的球形氮化硼纳米颗粒，所述化学气相沉积使用反应气氨气、运输气氩气和基于无定型硼和氧载体化合物的粉末混合物进行，所述化学气相沉积在以下条件下进行：

1000℃≤T≤1430℃

1.2≤ξ≤8

其中，T是粉末混合物的温度，ξ是特定的流量比FAr/FNH3，其中，FAr是运输气的流量，FNH3是反应气的流量，随后，将得到的氮化硼纳米颗粒的团聚物使用功率为40-100W的超声处理30分钟来分散氮化硼纳米颗粒，再饱和吸附抗癌药物，然后用蒸馏水洗涤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氧载体化合物选自硼酸、和/或氧化镁、和/或铁氧化物Ⅱ、和/或锡氧化物Ⅱ和/或它们的混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粉末混合物中铁氧化物的含量和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：铁氧化物 70-91

无定形硼 9-30。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粉末混合物中氧化镁的含量和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：氧化镁 65-84

无定形硼 16-35。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粉末混合物中锡氧化物的含量和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：锡氧化物 75-95

无定形硼 5-25。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粉末混合物中硼酸的含量和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：硼酸 85-92％

无定形硼 8％-15％。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粉末混合物中铁氧化物、氧化镁和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：铁氧化物 59-86

氧化镁 5-12

无定形硼 9-32。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粉末混合物中硼酸、氧化镁和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：硼酸 65-91

氧化镁 3-10

无定形硼 6-25。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过持续搅拌加有分散的氮化硼纳米颗粒的抗癌药物溶液来使氮化硼纳米颗粒吸附抗癌药物，所述抗癌药物溶液的浓度为0.5-

5.0mg/ml，所述持续搅拌使用磁力搅拌器，以250rpm的速度，搅拌12-24小时。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过超声处理加有分散的氮化硼纳米颗粒的抗癌药物溶液来使氮化硼纳米颗粒吸附抗癌药物，所述抗癌药物溶液的浓度为0.5-

5.0mg/ml，所述超声处理的功率为150W，时长15-60分钟。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗癌药物选自合成的或天然的抗癌药物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述合成的抗癌药物选自烷基化药物或代谢拮抗剂或其它类型的合成药物。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述烷基化合成的抗癌药物选自氯乙氨、或亚乙基胺、或亚硝基脲衍生物或甲磺酸衍生物。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述代谢拮抗剂合成抗癌药物选自叶酸拮抗剂、或嘌呤拮抗剂或嘧啶拮抗剂。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述其它类型的合成的抗癌药物选自普洛斯必定(prospidinum)、或斯普拉塞定(spirasidine)、或达卡巴嗪(dicarbasine)、或甲基苄肼(natulan)、或西普拉汀(cisplatine)或咪唑羧酰胺(imizadolecarboxamide)。

16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述天然抗癌药物选自抗生素或植物源性药物。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述天然抗癌药物抗生素选自阿霉素、或博莱霉素、或放线菌素D、或变红菌素、或棕霉素或丝裂霉素C。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述天然抗癌植物源性药物选自秋水仙胺、或长春花碱或长春新碱。

说明书

制造用于将抗癌药物递送到肿瘤细胞的氮化硼纳米颗粒的

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及纳米医学技术，更具体地，涉及用于递送抗癌化疗药物的纳米制剂的改进。

[0002] 在治疗肿瘤患者的过程中，抗癌化疗的效率降低主要归因于恶性肿瘤的发展和随着肿瘤发展产生的所谓的多药耐药的肿瘤细胞，该细胞耐药性来源于可将抗肿瘤药物从细胞移除的膜转运因子的激活。并且，许多用于治疗肿瘤的药物是低亲水性的并且对健康身体组织有毒性效应。解决这些问题的一种方法是使用纳米运输制剂将药物输送到肿瘤细胞中。

背景技术

[0003] 已知一种通过化学气相沉积获得球形氮化硼纳米颗粒的方法(US20110033707，2011年2月10日公开)。该方法可获得直径小于50nm得氮化硼纳米颗粒。该方法包括：在氨和氩气中加热醚、硼酸和氮的混合物，生成产物，产物进一步结晶，生成球形的纳米颗粒前体，最后在惰性气体中加热该前体。

[0004] 这种方法的缺点是颗粒小并且表面光滑，光滑的表面使其无法负载能有效抗癌的药物量并且限制这些颗粒附着到肿瘤细胞和渗透入肿瘤细胞。

[0005] 已知一种制造用于药物递送的纳米颗粒的方法(WO2014124329，2014年8月12日公开)。该方法使用铁或氧化铁的球形磁性颗粒，包括涂覆有金或氧化硅的颗粒。药物通过链接物，例如醚，连接到磁性颗粒上以用于治疗肿瘤疾病。通过外部加热或电磁场作用在所述颗粒，链接物分子内环化，释放药物。该方法控制药物释放从而最小化副作用并增加常用药物的治疗效率。

[0006] 这种方法的缺点是必须使用额外的外部作用来实现所需的治疗效率。该方法的另一个缺点是，某些形式的磁性颗粒会导致毒性。

[0007] 已知一种纳米载体和用于治疗肿瘤疾病的抗癌药物和纳米载体和药物组合物的复合体的制造方法(US20140147508，2014年5月29日公开)。

[0008] 该发明涉及一种用于抗癌药物的纳米载体，包括球形金属纳米颗粒与用于连接药物的多聚核苷酸。该方法通过控制释放药物对受影响的区域提供治疗。

[0009] 该方法的缺点在于该纳米载体不能将药物直接输送到肿瘤细胞，所以药物在细胞附近释放。这降低了该方法的效率，因为肿瘤细胞发展出了多重抗药性。

[0010] 还已知的一种使用金属纳米颗粒将抗癌药物递送到癌细胞的方法(US20130331764，2013年12月12日公开)。使用对pH敏感的5-15nm的金颗粒递送抗肿瘤药物。pH敏感的金属纳米颗粒进入体内后分散到正常细胞，正常细胞是中性或碱性。纳米颗粒选择性地聚集在肿瘤细胞，肿瘤细胞为酸性pH。该方法通过抗肿瘤药物的化学作用和聚集的颗粒被NIR辐射加热产生的热辐射达到治疗效果，NIR辐射辐射能深入患者身体。

[0011] 这种方法的缺点是需要额外的IR辐射，当对患者身体没有额外的外部作用时，不具有深入给药的治疗效果。此外，颗粒选择性地在肿瘤细胞中聚集，因此该方法的效率无法预测。并且，网状内皮系统会快速吸收大小为5-15nm的颗粒，所以这种大小并不合适。

[0012] 作为原型，我们选择一种方法获得用于化疗药物的细胞内递送的介孔二氧化硅官能化的氮化硼纳米管(X.Li，Ch.zhi，N.Hanagata，M.Yamaguchi，Y.Bando，D.Golberg，用于化疗药物的细胞内递送的介孔二氧化硅官能化的氮化硼纳米管，化学通讯(Сhem.Commun.)，2013，49，7337)。该方法暗示通过化学气相沉积获得氮化硼纳米管，其在空气中氧化5小时，通过TEOS水解形成介孔二氧化硅涂层，进一步饱和吸收抗肿瘤药物。与游离阿霉素相比，该方法可以增加抗肿瘤药物阿霉素的效率3-4倍。

[0013] 这种方法的主要缺点是氮化硼的形态不利于细胞吸收。已知纳米管形状的颗粒的细胞摄取不多，并且它们可能是有毒的。

发明内容

[0014] 在本发明实现的技术效果是，通过增加含有抗癌药物的纳米颗粒的细胞吞噬来增加抗癌化疗的效率，并避免使用分散的尺寸为50-300nm且具有良好外表面的氮化硼纳米颗粒带来的细胞毒性。

[0015] 所述技术效果通过特定途径实现。

[0016] 制造用于将抗癌药物递送到肿瘤细胞的氮化硼纳米颗粒的方法，包括通过化学气相沉积合成尺寸为50-300nm且具有良好外表面的球形氮化硼纳米颗粒，所述化学气相沉积使用反应气氨气、运输气氩气和基于无定型硼和氧载体化合物的粉末混合物进行。

[0017] 所述化学气相沉积在以下条件下进行：

[0018] 1000≤T≤1430

[0019] 1.2≤ξ≤8

[0020] 其中，T是粉末混合物的温度，ξ是特定的流量比FAr/FNH3，其中，FAr是运输气的流量，FNH3是反应气的流量。

[0021] 随后，将得到的氮化硼纳米颗粒的团聚物用超声分散，再饱和吸附抗癌药物，然后用蒸馏水洗涤。

[0022] 可以使用硼酸、和/或氧化镁、和/或氧化铁(Ⅱ)、和/或氧化锡(Ⅱ)和/或它们的混合物作为氧载体化合物。

[0023] 所述粉末混合物中氧化铁的含量和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：

[0024] 氧化铁   70-91

[0025] 无定形硼 9-30

[0026] 所述粉末混合物中氧化镁的含量和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：

[0027] 氧化镁   65-84

[0028] 无定形硼 16-35

[0029] 所述粉末混合物中氧化锡的含量和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：

[0030] 氧化锡   75-95

[0031] 无定形硼 5-25

[0032] 所述粉末混合物中硼酸的含量和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：

[0033] 硼酸     85-92％

[0034] 无定形硼 8％-15％

[0035] 所述粉末混合物中氧化铁、氧化镁和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：

[0036] 氧化铁   59-86

[0037] 氧化镁   5-12

[0038] 无定形硼 9-32

[0039] 所述粉末混合物中硼酸、氧化镁和无定形硼的含量的重量比为，wt.％：

[0040] 硼酸     65-91

[0041] 氧化镁   3-10

[0042] 无定形硼 6-25

[0043] 使用功率为40-100W的超声处理30分钟来分散氮化硼纳米颗粒。

[0044] 通过持续搅拌加有分散的氮化硼纳米颗粒的抗癌药物溶液来使氮化硼纳米颗粒吸附抗癌药物，所述抗癌药物溶液的浓度为0.5-5.0mg/ml，所述持续搅拌使用磁力搅拌器，以250rpm的速度，搅拌12-24小时。

[0045] 还可以通过超声处理加有分散的氮化硼纳米颗粒的抗癌药物溶液来使氮化硼纳米颗粒吸附抗癌药物，所述抗癌药物溶液的浓度为0.5-5.0mg/ml，所述超声处理的功率为150W，时长15-60分钟。

[0046] 所述抗癌药物选自合成的或天然的抗癌药物。

[0047] 所述合成的抗癌药物选自烷基化药物或代谢拮抗剂或其它类型的合成药物。

[0048] 所述烷基化类的合成抗癌药物选自氯乙氨、或亚乙基胺、或亚硝基脲衍生物或甲磺酸衍生物。

[0049] 所述代谢拮抗剂类的合成抗癌药物选自叶酸拮抗剂、或嘌呤拮抗剂或嘧啶拮抗剂。

[0050] 所述其它类型的合成抗癌药物选自普洛斯必定(prospidinum)、或斯普拉塞定(spirasidine)、或达卡巴嗪(dicarbasine)、或甲基苄肼(natulan)、或西普拉汀(cisplatine)或咪唑羧酰胺(imizadolecarboxamide)。

[0051] 所述天然抗癌药物选自抗生素或植物源性药物。

[0052] 所述天然抗癌药物抗生素选自阿霉素、或博莱霉素、或放线菌素D、或变红菌素、或棕霉素或丝裂霉素C。

[0053] 所述天然抗癌植物源性药物选自秋水仙胺、或长春花碱或长春新碱。

[0054] 具有良好外表面的球形氮化硼纳米颗粒的特征在于中空的球形中央部分和多个在侧部区域的暴露的花瓣状氮化硼层。该纳米颗粒具有高孔隙率和显著增加的比表面积，使氮化硼纳米颗粒得以保持其药效分子，并将它们递送到癌细胞，从而增加抗癌治疗的效率。实施例

[0055] 本发明是这样实现的：

[0056] 制备含有氧化反应物和无定形硼的粉末混合物。使用以下的反应物：硼酸和/或氧化镁和/或氧化铁(Ⅱ)和/或氧化锡(Ⅱ)和/或它们的混合物。

[0057] 在马弗炉或管式电炉中在空气气氛下于400℃对氧化镁粉末进行初步退火。

[0058] 使用精确度为0.1mg的实验室天平称量所述粉末混合物的组分。

[0059] 使用高温感应炉合成球形氮化硼纳米颗粒。将含有所述粉末混合物的坩埚置于反应器的底部，该反应器由氮化硼制成，并安装在反应器腔室内的石墨加热器中。

[0060] 该反应器是一种可拆卸的圆柱形结构，其外直径为75mm，内直径为55mm，高度为340mm。在反应器侧壁上部有直径为3mm的开口，用于释放所合成的球形氮化硼纳米颗粒。反应器的石墨加热器由碳/碳复合衬与反应器腔室的壁隔开。反应器设计成从下到上运送氩气运输气，并从上到下运送氨反应气。

[0061] 颗粒的尺寸和化学组成通过使用装有能量色散X射线光谱检测器的JEOL JSM-7600F电子显微镜(JEOL，日本)来控制。

[0062] 球形纳米颗粒的平均粒径在50-300nm范围内，主要取决于合成温度和运输气(氩气)和反应气(氨气)的流速。

[0063] 实验温度决定了在合成产物中氮化硼纳米颗粒的体积分数和它们的形态。为了获得所需的大小和形态的氮化硼纳米颗粒，并且体积含量大于80％，应使用粉末混合物在合成温度为1000-1430℃进行合成。在低于1000℃时，由于硼和氧化反应物之间反应速度较低，氮化硼结构的生长速率明显减缓。当高于1430℃时，所需大小的球形氮化硼纳米颗粒的体积分数减小。

[0064] 无定形硼和氧化反应物之间的反应产生挥发性硼氧化物，并由其输送气(氩气)携带至氨反应区域，在该区域完成纳米结构的合成。

[0065] 氩气输送气和氨反应气的流量的比例决定了氮化硼纳米颗粒合成的动力学和纳米结构的直径。在流量比ξ＝FAr/FNH3为1.2≤ξ≤8时，可以得到高体积分数的大小为50-300nm的纳米颗粒(＞80vol％)。

[0066] 在流量比ξ≤1.2时，氨到达粉末混合物并在其表面产生氮化硼微米颗粒层，这将阻碍气态氧化硼的进一步释放，因此将明显妨碍球形氮化硼纳米颗粒的合成，导致最终产品氮化硼颗粒的量的急剧下降。

[0067] 在流量比ξ≥8时，气态氧化硼没有足够的时间与氨完成反应，这也将减小球形氮化硼纳米颗粒的输出并导致形成大量的固体氧化硼。

[0068] 粉末混合物中的组分的比例选自上述的范围。

[0069] 超出该范围，要么没有球形氮化硼纳米颗粒形成，要么它们的尺寸改变，或者合成产物中所需大小的球形氮化硼纳米颗粒的量减小。

[0070] 具有良好外表面的球形氮化硼纳米颗粒的形成，是氮化硼蒸汽和氨在一定温度范围(1000-1430℃)内，在特定的流量比的携带气态氮化硼的运输气氩气和反应气氨气的条件下，相互作用的结果。

[0071] 在合成产物中，球形氮化硼纳米颗粒往往聚集在一起。为了得到包含分散的氮化硼纳米颗粒的悬浮液，应在40ml蒸馏水中，在40-100W功率下，进行超声分散30分钟。之所以选择超声波功率范围为40-100W，是因为在较低功率时氮化硼纳米颗粒的聚集体无法被分散为个体颗粒，而更高的功率导致悬浮液变热，可能导致水解部分氮化硼纳米颗粒。如果超声波处理的时间小于30分钟，则无法使聚集体分散到满意的程度，而超声处理的时间多于30分钟可能破坏纳米颗粒。

[0072] 为了制备能破坏肿瘤细胞的氮化硼纳米颗粒，需要将该纳米颗粒饱和吸附抗肿瘤药物。

[0073] 通过持续搅拌加有分散的氮化硼纳米颗粒的抗癌药物溶液来使氮化硼纳米颗粒吸附抗癌药物，所述抗癌药物溶液的浓度为0.5-5.0mg/ml，所述持续搅拌使用磁力搅拌器Heidolph MR(Hei-Standard,德国)，以250rpm的速度，搅拌12-24小时。如果药物浓度低于0.5mg/ml则不能确保治疗效率，如果药物浓度大于5.0mg/ml，则超过24小时后，氮化硼纳米颗粒悬浮液无法保持稳定。

[0074] 氮化硼纳米颗粒饱和吸附抗癌药物所需时间至少为12小时。吸附少于12小时则氮化硼纳米颗粒未达到该药物的饱和吸附。吸附12-24小时则纳米颗粒的表面可以达到抗癌药物的饱和吸附极限。吸附24小时以上也无法使纳米颗粒更多吸附抗癌药物。

[0075] 还可以通过使用Bandelin Sonoplus HD2200设备,德国，进行超声处理氮化硼纳米颗粒来使其饱和吸附抗癌药物，所述超声处理的功率为150W，时长15-60分钟。

[0076] 更高的功率和更长的处理可破坏抗肿瘤药物的分子，而当功率低于这个范围则超声处理不能使氮化硼纳米颗粒吸收足量的抗癌药物。

[0077] 氮化硼纳米颗粒的生物相容性的研究表明，就从肿瘤细胞吸收而言，尺寸为50-300nm的纳米颗粒最优。此外，更小的颗粒其表面不能输送足量药物以有效的破坏癌细胞，而更大的颗粒无法被癌细胞吞噬。

[0078] 具有良好外表面的球形氮化硼纳米颗粒提供足量的药物吸附，并将其递送至肿瘤细胞。

[0079] 表1给出了不同合成参数的具有良好外表面的球形氮化硼纳米颗粒的实施例。表2给出了本发明的不同的抗癌药物饱和的方法的实施例。

[0080] 实施例1

[0081] 球形氮化硼纳米颗粒通过化学气相沉积在立式感应炉VIN-1,6-20(Vac ETO公司，俄罗斯)中合成。将含有59wt.％氧化铁、12wt.％氧化镁和29wt.％无定形硼的粉末混合物(质量是10.88g)充分混合均匀，放入坩埚，然后将坩埚放置在炉子中。将反应器的工作室加热至300℃，并使用永久真空泵除去吸附于工作室表面的水和氧气。然后将该室充入氩气至大气压。炉加热至850℃后，运输气氩气和氨反应气流被打开的。加热至1310℃后，将温度保持恒定200分钟。合成结束后，将工作室冷却至40-50℃，然后用空气和开口通风。

[0082] 合成后得到280mg雪白蓬松的粉末。根据扫描式电子显微镜观察，该雪白粉末是氮化硼纳米颗粒的聚集体，直径在1-5μm。单独的氮化硼纳米颗粒的直径为100-150nm，并具有球形形状和良好的外表面。

[0083] 使用超声波分散机"Sonoplus HD2200"(Bandelin，德国)得到具有良好外表面的单独的氮化硼纳米颗粒的稳定悬浮液。为了分散氮化硼纳米颗粒的聚集体，在40ml蒸馏水中，功率为100W的超声处理中处理聚集体30分钟。氮化硼纳米颗粒的浓度为2mg/ml。超声波处理后的粒径分布的研究表明，80％以上的颗粒具有100-200nm的直径。

[0084] 通过在磁力搅拌器"Heidolph MR"(Hei-Standard标准，德国)上，在抗肿瘤药物溶液中连续混合氮化硼纳米颗粒，以使球形氮化硼纳米颗粒饱和吸附抗肿瘤药物。使用Eppendorf(德国)离心机将纳米颗粒从液相中分离出来。抗肿瘤药物阿霉素的水溶液的浓度为0.5mg/ml。饱和吸附抗肿瘤药物之后，用蒸馏水洗涤氮化硼纳米颗粒三次，并离心去除纳米颗粒表面的药物残留。

[0085] 通过Alexa 488-falloidine染色的细胞培养物的共聚焦显微镜，来研究饱和吸附了药物的纳米颗粒被癌细胞吞噬的情况。细胞在加入有饱和吸附了药物的纳米颗粒的培养基中培养7天，培养过程中通过测量转化细胞的增值的动态，来研究肿瘤细胞暴露在纳米颗粒的活性，并将结果与对照组样品对比，使用荧光显微镜和DAPI染色。

[0086] 共聚焦显微镜表明，负载有阿霉素的氮化硼纳米颗粒能够渗入IAR-6-1转化(肿瘤)的细胞系。存活能力试验结果表明，纳米颗粒中的阿霉素在肿瘤细胞内释放并破坏细胞。

[0087] 实施例2

[0088] 将质量为11.76g的粉末混合物放入反应器的坩埚内，该粉末混合物包含78wt.％的硼酸、4wt.％的氧化镁和18wt.％的无定形硼。将反应器初步去除杂质后，充入惰性气体，加热至工作温度并输送的运输气和反应气(实施例1的方法)，工作温度为1190℃并保持恒定320分钟。合成后得到345mg雪白蓬松的粉末，为直径为70-100nm的氮化硼纳米颗粒的聚集体。

[0089] 在蒸馏水中，在80W功率下，超声处理氮化硼聚集体30分钟。氮化硼纳米颗粒的浓度为2mg/ml。颗粒粒径分布研究表明，尺寸大于250nm的纳米颗粒及其聚集体的量小于1％。

[0090] 在5mg/ml的阿霉素水溶液中，超声处理氮化硼纳米颗粒15分钟，使其饱和吸收抗肿瘤药物。

[0091] 根据实施例1中的方法，使用IAR-6-1转化(肿瘤)的细胞，做生物实验，结果表明细胞成功吸收了负载有阿霉素的纳米颗粒，并造成细胞死亡。

[0092]

[0093]