凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途转让专利
申请号 : CN201780001366.2
文献号 : CN107531797B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : 应华 , 刘佳建 , 付雅媛 , 张玲 , 张昊颖 , 孙嘉康 , 张连山 , 陶维康 , 孙飘扬 , 胡齐悦
申请人 : 江苏恒瑞医药股份有限公司 , 上海恒瑞医药有限公司
摘要 :
本发明提供了凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途。进一步地，本发明提供了包含所述凝血酶抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含凝血酶抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗凝药物的用途。特别地，本发明提供了一种人源化的凝血酶抗体在制备用于治疗凝血酶介导的疾病或病症的药物中的用途。
权利要求 :
1.一种凝血酶抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区，其中，
所述抗体重链可变区包含：如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的HCDR3；
所述抗体轻链可变区包含：分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和 SEQ ID NO：12所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其功能片段。
3.根据权利要求2所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段进一步包含鼠源κ链或鼠源κ链变体的轻链FR区、或者进一步包含鼠源λ链或鼠源λ链变体的轻链FR区；和/或其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、或进一步包含IgG2或其变体的重链FR区、或进一步包含IgG3或其变体的重链FR区。
4.根据权利要求3所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：5的重链可变区和SEQ ID NO：6的轻链可变区。
5.根据权利要求2所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中凝血酶抗体或其抗原结合片段进一步包含鼠源κ链或其变体的轻链恒定区、或者鼠源λ链或其变体的轻链恒定区；
和/或其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链恒定区、或进一步包含IgG2或其变体的重链恒定区、或进一步包含IgG3或其变体的重链恒定区。
6.根据权利要求1所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其功能片段。
7.根据权利要求1所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其功能片段。
8.根据权利要求7所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其抗原结合片段的重链FR区序列来源于人种系重链IGHV3‑23*04和hjh6.1的组合序列；其中所述的人源化抗体或其抗原结合片段包含人种系重链IGHV3‑23*04的FR1、FR2、FR3区和hjh6.1的FR4区。
9.根据权利要求8所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：13所示的重链可变区。
10.根据权利要求8所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其抗原结合片段的重链FR区序列具有选自R87K、K98R、Q3K和S49A的氨基酸回复突变。
11.根据权利要求10所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：15所示的重链可变区。
12.根据权利要求7所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其抗原结合片段的轻链FR区序列来源于人种系轻链模板IGKV1‑39*01和hjk4.1的组合序列；
其中所述的人源化抗体或其功能片段包含人种系轻链IGKV1‑39*01的FR1、FR2、FR3区和hjk4.1的FR4区。
13.根据权利要求12所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：16所示的轻链可变区。
14.根据权利要求12所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其抗原结合片段的轻链FR区序列具有选自Y49S、T69K、K45R、L47I和F71Y的氨基酸回复突变。
15.根据权利要求14所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的轻链可变区。
16.根据权利要求7所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO：13所示的重链可变区和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：14所示的重链可变区和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：15所示的重链可变区和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：13所示的重链可变区和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：14所示的重链可变区和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：15所示的重链可变区和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：13所示的重链可变区和如SEQ ID NO：18所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：14所示的重链可变区和如SEQ ID NO：18所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：15所示的重链可变区和如SEQ ID NO：18所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：27所示的重链可变区和如SEQ ID NO：18所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：28所示的重链可变区和如SEQ ID NO：18所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：29所示的重链可变区和如SEQ ID NO：18所示的轻链可变区，或者如SEQ ID NO：30所示的重链可变区和如SEQ ID NO：18所示的轻链可变区。
17.根据权利要求7所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶抗体或其抗原结合片段进一步包含选自人源IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4或其变体的重链恒定区， 所述凝血酶抗体或其抗原结合片段的轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
18.根据权利要求17所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶抗体或其抗原结合片段包含人源IgG4或其变体的重链恒定区。
19.根据权利要求17所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述凝血酶抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：19所示的重链恒定区，和如SEQ ID NO：20所示的轻链恒定区。
20.根据权利要求1所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体、双抗体和dsFv的抗原结合片段。
21.根据权利要求1 至20 任一项所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其结合一个或多个选自凝血酶的R70，Y71，E72，R73，N74，I75 和Y114的残基。
22.根据权利要求21所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其进一步结合凝血酶的第
9、24、60、62、64、66、69、78和113位的残基。
23.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
24.一种DNA分子，其编码根据权利要求1‑22中任一项所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段。
25.一种表达载体，其含有根据权利要求24所述的DNA分子。
26.一种宿主细胞，其为用根据权利要求25所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，所述宿主细胞不是胚胎干细胞，也不是植物细胞。
27.根据权利要求26所述宿主细胞，其中所述宿主细胞选自CHO细胞和NSO 细胞。
28.根据权利要求1至22任一项所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段或根据权利要求
23所述的药物组合物或根据权利要求24所述的DNA分子在制备用于治疗凝血酶介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症为血栓性疾病。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述的疾病或病症为：静脉血栓形成或动脉血栓形成。
30.根据权利要求28所述的用途，其中所述的疾病或病症为：肺栓塞、血栓形成引起的中风、动脉粥样硬化疾病、脑动脉病或末梢动脉病。
31.根据权利要求28所述的用途，其中所述的疾病或病症为：末梢动脉形成。
32.根据权利要求28所述的用途，其中所述的疾病或病症为：静脉血栓形成。
33.根据权利要求28所述的用途，其中所述的疾病或病症为血栓形成引起的中风或动脉粥样硬化。
34.用于检测或测定人凝血酶的试剂，所述试剂包含权利要求1 至22任一项的抗体或其抗原结合片段。
说明书 :
凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途
技术领域
[0001] 本发明涉及凝血酶抗体以及其抗原结合片段，进一步地，本发明涉及包含所述凝血酶抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，本发明还涉及包含所述凝血酶抗体及其抗原结合
片段的药物组合物，以及其作为抗凝药物的用途。
片段的药物组合物，以及其作为抗凝药物的用途。
背景技术
[0002] 血液凝固是防止受损血管出血(止血)的重要过程。然而，阻塞血液流经血管(血栓形成)或脱落后沉积在体内其它部位的血管(血栓栓塞)的血凝块对健康是严重的威胁。血
栓症(如急性心肌梗塞(AMI)、静脉血栓塞等)是一类严重危及人类健康及生命的心血管疾
病。世界卫生组织2008年统计，到目前，心血管发病及死亡率已经跃居第一位。世界每年心
血管病死亡人数约1733万人，占死亡总数30％，中国心血管患者2.9亿人，每年死亡约350万
人，占总死亡原因41％。2010年全球疾病负担研究(GBD)统计，中风是我国居民第一大死因。
所以近年来，研究有效的治疗心血管疾病的药物及方法引起了人们越来越多的关注。目前，
一些抗凝血疗法可以治疗病理学血液凝固，例如使用传统药物肝素、小分子肝素或华法林，
或者使用直接凝血酶抑制剂达比加群酯(Dabigatran)等。这些疗法的普遍缺陷是增加出血
风险。许多抗凝药物起效剂量(阻止血栓形成)和安全剂量(最高无出血风险)之间的窗口不
够大，考虑到个体病人的反应差异，该窗口将进一步缩小。以凝血酶为靶点，用凝血酶拮抗
剂来抑制血栓的生成即是临床治疗血栓的方法之一。
栓症(如急性心肌梗塞(AMI)、静脉血栓塞等)是一类严重危及人类健康及生命的心血管疾
病。世界卫生组织2008年统计，到目前，心血管发病及死亡率已经跃居第一位。世界每年心
血管病死亡人数约1733万人，占死亡总数30％，中国心血管患者2.9亿人，每年死亡约350万
人，占总死亡原因41％。2010年全球疾病负担研究(GBD)统计，中风是我国居民第一大死因。
所以近年来，研究有效的治疗心血管疾病的药物及方法引起了人们越来越多的关注。目前，
一些抗凝血疗法可以治疗病理学血液凝固，例如使用传统药物肝素、小分子肝素或华法林，
或者使用直接凝血酶抑制剂达比加群酯(Dabigatran)等。这些疗法的普遍缺陷是增加出血
风险。许多抗凝药物起效剂量(阻止血栓形成)和安全剂量(最高无出血风险)之间的窗口不
够大，考虑到个体病人的反应差异，该窗口将进一步缩小。以凝血酶为靶点，用凝血酶拮抗
剂来抑制血栓的生成即是临床治疗血栓的方法之一。
[0003] 凝血反应是一个复杂的信号级联过程，凝血酶(Thrombin)在其中占有核心地位。凝血酶将循环系统的纤维蛋白原分解为纤维蛋白单体(可聚合形成纤维蛋白，血液凝块的
纤维基质)，对细胞也有很多直接调控。作为一种丝氨酸蛋白酶，它触发血小板发生形变，释
放血小板活化剂ADP、血清素和血栓烷A2，以及趋化因子和生长因子。除此以外，还促进粘附
分子P‑选择素和CD40配体迁移到血小板表面，进而激活整合素aIIb/b3。后者结合纤维蛋白
原和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)，进而介导血小板的聚集。凝血酶还
刺激血小板表面的促凝血活性，反过来促进凝血酶的表达。在内皮细胞的培养中，凝血酶促
进vWF的释放，细胞质膜的P‑选择素的出现和趋化因子的产生。这些反应被认为触发体内血
小板和白细胞与内皮细胞表面的结合。内皮细胞随即改变形状，内皮细胞层通透性增加。这
些反应被预计将促进血浆蛋白的局部渗出，促进水肿。在非内皮组织中，凝血酶通过作用于
平滑肌细胞引起血管收缩。在成纤维细胞或血管平滑肌细胞的体外培养中，凝血酶调节细
胞因子的产生并促进有丝分裂，在T淋巴细胞中它触发钙信号和其他的反应。这些细胞反应
表明凝血酶将组织损伤与止血过程、炎症反应、甚至加强免疫应答的机体调控关联在了一
起。这些细胞反应也提出了一种可能性：除了组织受损外，内皮细胞和其他类型细胞的凝血
酶可能在白细胞外渗，血管重塑和/或血管生成中也扮演了一定的角色。因此，凝血酶成为
了一个极具潜力的，新的抗凝血抗栓靶标。
纤维基质)，对细胞也有很多直接调控。作为一种丝氨酸蛋白酶，它触发血小板发生形变，释
放血小板活化剂ADP、血清素和血栓烷A2，以及趋化因子和生长因子。除此以外，还促进粘附
分子P‑选择素和CD40配体迁移到血小板表面，进而激活整合素aIIb/b3。后者结合纤维蛋白
原和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)，进而介导血小板的聚集。凝血酶还
刺激血小板表面的促凝血活性，反过来促进凝血酶的表达。在内皮细胞的培养中，凝血酶促
进vWF的释放，细胞质膜的P‑选择素的出现和趋化因子的产生。这些反应被认为触发体内血
小板和白细胞与内皮细胞表面的结合。内皮细胞随即改变形状，内皮细胞层通透性增加。这
些反应被预计将促进血浆蛋白的局部渗出，促进水肿。在非内皮组织中，凝血酶通过作用于
平滑肌细胞引起血管收缩。在成纤维细胞或血管平滑肌细胞的体外培养中，凝血酶调节细
胞因子的产生并促进有丝分裂，在T淋巴细胞中它触发钙信号和其他的反应。这些细胞反应
表明凝血酶将组织损伤与止血过程、炎症反应、甚至加强免疫应答的机体调控关联在了一
起。这些细胞反应也提出了一种可能性：除了组织受损外，内皮细胞和其他类型细胞的凝血
酶可能在白细胞外渗，血管重塑和/或血管生成中也扮演了一定的角色。因此，凝血酶成为
了一个极具潜力的，新的抗凝血抗栓靶标。
[0004] 分离的抗凝血酶抗体分子可在体内抑制凝血酶，而不促进或大幅促进出血(bleeding)或溢血(haemorrhage)，即该抗体分子不抑制或大幅抑制对血管损伤的正常生
理反应(即止血)。例如，止血不会被抗体分子抑制或会被其最低程度地抑制(即微小程度地
抑制，不会影响病人的健康或需要进一步干预)。出血不会被抗体分子增加或会被其最低程
度地增加。
理反应(即止血)。例如，止血不会被抗体分子抑制或会被其最低程度地抑制(即微小程度地
抑制，不会影响病人的健康或需要进一步干预)。出血不会被抗体分子增加或会被其最低程
度地增加。
[0005] 尽管目前已有少量抗凝血酶抗体的专利公开，如WO2013123591、WO2014153195、WO2014202992和WO2014202993，但到目前为止，还没有抗凝血酶抗体药物上市或进入临床
研究，有必要进一步开发一种新的抗凝血酶抗体进行相关的临床研究和应用。本发明即提
供一种亲和力高，对血栓生成具有显著抑制活性的新型凝血酶抗体。
研究，有必要进一步开发一种新的抗凝血酶抗体进行相关的临床研究和应用。本发明即提
供一种亲和力高，对血栓生成具有显著抑制活性的新型凝血酶抗体。
发明内容
[0006] 本发明提供一种凝血酶抗体或其抗原结合片段，其包含任意1个或多个选自以下的CDR区序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：抗体重链可变区HCDR区序列：
SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:21；和抗体轻链可变区LCDR区序列：SEQ ID NO:
10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:21；和抗体轻链可变区LCDR区序列：SEQ ID NO:
10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
[0007] 其中所述的SEQ ID NO:21如通式(I)所示：
[0008] DHYX1G X2SYVFD X3(I)；
[0009] 其中X1选自H、I、L或M；X2选自N或A；X3选自Y、S、L或T。
[0010] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ
ID NO:21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或与SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:21具
有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
ID NO:21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或与SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:21具
有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[0011] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的通式(I)SEQ ID NO:21的序列选自：
[0012] DHYHGNSYVFDY SEQ ID NO：9；
[0013] DHYIGASYVFDY SEQ ID NO：23；
[0014] DHYLGNSYVFDS SEQ ID NO：24；
[0015] DHYLGNSYVFDL SEQ ID NO：25；
[0016] 或DHYMGNSYVFDT SEQ ID NO：26。
[0017] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和
SEQ ID NO:12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或与SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID
NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或与SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID
NO:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[0018] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其功能片段。
[0019] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段的轻链可变区进一步包含鼠源κ链或鼠源κ链
变体的轻链FR区、或者进一步包含鼠源λ链或鼠源λ链变体的轻链FR区；和/或其中所述的凝
血酶抗体或其抗原结合片段的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、
或进一步包含IgG2或其变体的重链FR区、或进一步包含IgG3或其变体的重链FR区。
变体的轻链FR区、或者进一步包含鼠源λ链或鼠源λ链变体的轻链FR区；和/或其中所述的凝
血酶抗体或其抗原结合片段的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、
或进一步包含IgG2或其变体的重链FR区、或进一步包含IgG3或其变体的重链FR区。
[0020] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5的重链可变区序列和SEQ
ID NO:6的轻链可变区序列。
ID NO:6的轻链可变区序列。
[0021] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段进一步包含鼠源κ链或其变体的轻链恒定区、
或者鼠源λ链或其变体的轻链恒定区；和/或其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段进一
步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、或进一步包含IgG2或其变体的重链FR区、或进一步
包含IgG3或其变体的重链FR区。
或者鼠源λ链或其变体的轻链恒定区；和/或其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段进一
步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、或进一步包含IgG2或其变体的重链FR区、或进一步
包含IgG3或其变体的重链FR区。
[0022] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其功能片段。
[0023] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其功能片段。
[0024] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其功能片段的重链FR区序列来源于人种系重链IGHV3‑23*04
和hjh6.1的组合序列及其突变序列；其中所述的人源化抗体或其功能片段包含人种系重链
IGHV3‑23*04的FR1、FR2、FR3区和hjh6.1的FR4区及其突变序列。
和hjh6.1的组合序列及其突变序列；其中所述的人源化抗体或其功能片段包含人种系重链
IGHV3‑23*04的FR1、FR2、FR3区和hjh6.1的FR4区及其突变序列。
[0025] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其功能片段包含SEQ ID NO:13所示的重链可变区序列，或与SEQ
ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区序列；优选与SEQ ID NO:13
的氨基酸序列具有0‑10的氨基酸变化。
ID NO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区序列；优选与SEQ ID NO:13
的氨基酸序列具有0‑10的氨基酸变化。
[0026] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其功能片段的重链FR区序列有0‑10个氨基酸的回复突变，优
选所述回复突变选自R87K,K98R,Q3K和S49A的氨基酸回复突变。
选所述回复突变选自R87K,K98R,Q3K和S49A的氨基酸回复突变。
[0027] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其功能片段的包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:15所示的重链
可变区序列，或与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的
重链可变区序列；
可变区序列，或与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的
重链可变区序列；
[0028] 其中所述的SEQ ID NO:22如通式(II)所示：
[0029] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVS NINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYX1G X2SYVFD X3WGQGTTVTVSS(II)；
[0030] 其中X1选自H、I、L或M；X2选自N或A；X3选自Y、S、L或T。
[0031] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的通式(II)SEQ ID NO:22的序列选自：SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:27,SEQ ID
NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30。
NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30。
[0032] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其功能片段的的轻链FR区序列来源于人种系轻链模板IGKV1‑
39*01和hjk4.1的组合序列及其突变序列；其中所述的人源化抗体或其功能片段包含人种
系轻链IGKV1‑39*01的FR1、FR2、FR3区和hjk4.1的FR4区及其突变序列。
39*01和hjk4.1的组合序列及其突变序列；其中所述的人源化抗体或其功能片段包含人种
系轻链IGKV1‑39*01的FR1、FR2、FR3区和hjk4.1的FR4区及其突变序列。
[0033] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其功能片段包含SEQ ID NO:16所示的轻链可变区序列，或与SEQ
ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区序列；优选与所述SEQ ID
NO:16具有0‑10的氨基酸变化。
ID NO:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区序列；优选与所述SEQ ID
NO:16具有0‑10的氨基酸变化。
[0034] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其功能片段的轻链FR区序列有0‑10个氨基酸的回复突变，优
选所述回复突变选自Y49S,T69K,K45R,L47I和F71Y的氨基酸回复突变。
选所述回复突变选自Y49S,T69K,K45R,L47I和F71Y的氨基酸回复突变。
[0035] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体或其功能片段的包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的轻链可
变区序列，或与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻
链可变区序列。
变区序列，或与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻
链可变区序列。
[0036] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列选自SEQ ID NO:
13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15以及与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15具有
至少95％序列同一性的氨基酸序列；和/或(b)轻链可变区序列，所述轻链可变区序列选自
SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18以及与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ
ID NO:18具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15以及与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15具有
至少95％序列同一性的氨基酸序列；和/或(b)轻链可变区序列，所述轻链可变区序列选自
SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18以及与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ
ID NO:18具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[0037] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，其中凝血酶抗体或其抗原结合片段包含选自人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重
链恒定区，优选包含人源IgG4或其变体的重链恒定区，最优选包含SEQ ID NO:19所示的恒
定区；
链恒定区，优选包含人源IgG4或其变体的重链恒定区，最优选包含SEQ ID NO:19所示的恒
定区；
[0038] 所述凝血酶抗体或其抗原结合片段的轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区，最优选包含SEQ ID NO:20所示的恒定区。
[0039] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述抗原结合片段是选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的
肽的抗原结合片段。
肽的抗原结合片段。
[0040] 在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述凝血酶抗体或抗原结合片段，其结合一个或多个选自凝血酶的R70，Y71，E72，R73，N74，I75和Y114的残基；优选的，其进一步
结合凝血酶的第9、24、60、62、64、66、69、78和113位的残基。
结合凝血酶的第9、24、60、62、64、66、69、78和113位的残基。
[0041] 本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合一个、二个、三个、四个、五个、六个或七个选自凝血酶的R70，Y71，E72，R73，N74，I75和Y114的残基；优选
的，其进一步结合凝血酶的第9、24、60、62、64、66、69、78和113位的残基。
的，其进一步结合凝血酶的第9、24、60、62、64、66、69、78和113位的残基。
[0042] 本发明进一步提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0043] 本发明进一步提供一种编码如上所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
[0044] 本发明进一步提供一种如上所述的DNA分子的表达载体。
[0045] 本发明进一步提供一种如上所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
[0046] 本发明进一步提供一种如上所述的凝血酶抗体或其抗原结合片段或如上所述的药物组合物，在制备用于治疗凝血酶介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病
或病症优选为血栓性疾病(其包括血栓形成和血栓栓塞)；更优选为静脉血栓形成和肺栓
塞、动脉血栓形成、血栓形成引起的中风和末梢动脉形成、动脉粥样硬化疾病、脑动脉病或
末梢动脉病；最优选静脉血栓形成、血栓形成引起的中风和动脉粥样硬化。
或病症优选为血栓性疾病(其包括血栓形成和血栓栓塞)；更优选为静脉血栓形成和肺栓
塞、动脉血栓形成、血栓形成引起的中风和末梢动脉形成、动脉粥样硬化疾病、脑动脉病或
末梢动脉病；最优选静脉血栓形成、血栓形成引起的中风和动脉粥样硬化。
[0047] 可以使用本发明的抗体诊断的示例性疾病包括血栓性疾病(其包括血栓形成和血栓栓塞)，其包括以下的任何一种或多种：静脉血栓形成和肺栓塞、动脉血栓形成、血栓形成
引起的中风和末梢动脉形成、动脉粥样硬化疾病、脑动脉病或末梢动脉病。
引起的中风和末梢动脉形成、动脉粥样硬化疾病、脑动脉病或末梢动脉病。
[0048] 在一方面中，本发明提供治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状的方法：静脉血栓形成、血栓形成引起的中风和动脉粥样硬化，所述方法包括向所述个
体施用有效量的抗凝血酶抗体。本发明还提供有效量的拮抗胞外或循环凝血酶的抗凝血酶
抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防个体的血栓形成和/或至少一种以下
症状：肺栓塞、血栓形成引起的中风和动脉粥样硬化。
体施用有效量的抗凝血酶抗体。本发明还提供有效量的拮抗胞外或循环凝血酶的抗凝血酶
抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防个体的血栓形成和/或至少一种以下
症状：肺栓塞、血栓形成引起的中风和动脉粥样硬化。
[0049] 在一方面中，本发明用于检测或测定人凝血酶的试剂，所述试剂包含上述抗体或其抗原结合片段。
附图说明
[0050] 图1：抗凝血酶抗体CH‑1601对人凝血酶酶活的影响；数据结果显示CH‑1601与凝血酶结合后并不影响其对底物S2228的酶解活性；
[0051] 图2：本发明抗凝血酶抗体对人凝血酶酶活的影响；数据结果显示凝血酶抗体H1601‑008与凝血酶结合后并不影响其对底物S2228的酶解活性；
[0052] 图3：不同浓度凝血酶抗体对正常人血浆APTT值的影响；数据结果显示随着抗体CH‑1601和h1601‑008浓度的增加，正常人血浆的APTT值也有所延长；h1601‑008在最高浓度
3200nM时，APTT值的增加也达到28.7秒的峰值；
3200nM时，APTT值的增加也达到28.7秒的峰值；
[0053] 图4：H1601‑008静脉注射对猴AV‑shunt静脉血栓形成的影响；
[0054] 图5：本发明抗体对猴血浆的APTT值的影响。
[0055] 图6：纯化抗体H1601‑008被木瓜蛋白酶切割。
[0056] 图7：显示Fab的LCDR1,LCDR2,LCDR3,HCDR3与凝血酶紧密结合的晶体结构图。
[0057] 图8：凝血酶的R62,Y71，E72，R73,Y114残基分别与Fab的四个环有氢键作用。
具体实施方式
[0058] 一.术语
[0059] 为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员
通常理解的含义。
通常理解的含义。
[0060] 本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
[0061] 本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不
同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即
IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其
铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ
链或λ链。
同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即
IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其
铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ
链或λ链。
[0062] 在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
[0063] 在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
[0064] 抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对
保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可
变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的
顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重
链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR
区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1‑3，HCDE2‑3)，或者符
合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可
变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的
顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重
链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR
区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1‑3，HCDE2‑3)，或者符
合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
[0065] 本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
[0066] 术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人凝血酶的单克隆抗体。制备时用凝血酶抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗
体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源凝血酶抗体或其抗原结合片段，
可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其
变体的重链恒定区。
体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源凝血酶抗体或其抗原结合片段，
可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其
变体的重链恒定区。
[0067] 术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立
分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克
隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体
中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所
述的凝血酶嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的凝
血酶嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，
优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变)的IgG1、
IgG2或IgG4变体。
分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克
隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体
中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所
述的凝血酶嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的凝
血酶嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，
优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变)的IgG1、
IgG2或IgG4变体。
[0068] 术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR‑grafted antibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构
架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反
应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。
如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网
www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of
Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起
的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活
性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗
体。在本发明一个优选的实施方案中，所述的凝血酶人源化抗体中鼠的CDR序列选自SEQ ID
NO:7,8,9,10,11或12；人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的
轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV1‑39*01和hjk4.1的组合序列；其中所述抗体重链可
变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV3‑23*04和hjh6.1的组合序列。为避免免疫
原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持
活性。
架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反
应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。
如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网
www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of
Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起
的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活
性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗
体。在本发明一个优选的实施方案中，所述的凝血酶人源化抗体中鼠的CDR序列选自SEQ ID
NO:7,8,9,10,11或12；人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的
轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV1‑39*01和hjk4.1的组合序列；其中所述抗体重链可
变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV3‑23*04和hjh6.1的组合序列。为避免免疫
原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持
活性。
[0069] CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的凝血酶抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需
要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人凝血酶抗体或其抗原结合片
段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR
供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么
可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残
基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。
要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人凝血酶抗体或其抗原结合片
段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR
供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么
可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残
基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。
[0070] 术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，凝血酶)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结
合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、
CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两
个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL
结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341：544‑546)，其
由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的
两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编
码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配
对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)
Science242:423‑426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879‑5883)。此类
单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技
术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通
过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是
不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或
IgM抗体。
合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、
CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两
个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL
结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341：544‑546)，其
由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的
两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编
码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配
对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)
Science242:423‑426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879‑5883)。此类
单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技
术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通
过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是
不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或
IgM抗体。
[0071] 术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结
构：NH2‑VL‑接头‑VH‑COOH或NH2‑VH‑接头‑VL‑COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨
基酸序列或其变体组成，例如使用1‑4个重复的变体(Holliger等人(1993)，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444‑6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人
(1995)，Protein Eng.8:725‑731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94‑106，Hu等人
(1996)，Cancer Res.56:3055‑3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41‑56和
Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
构：NH2‑VL‑接头‑VH‑COOH或NH2‑VH‑接头‑VL‑COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨
基酸序列或其变体组成，例如使用1‑4个重复的变体(Holliger等人(1993)，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444‑6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人
(1995)，Protein Eng.8:725‑731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94‑106，Hu等人
(1996)，Cancer Res.56:3055‑3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41‑56和
Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
[0072] 术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of
immunological interest.NIH Publication91‑3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat
定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，
以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。
immunological interest.NIH Publication91‑3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat
定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，
以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。
[0073] 本文中使用的术语“抗体构架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
[0074] 术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，凝血酶分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，
11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in
Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in
Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
[0075] 术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体‑7 ‑8 ‑9
对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10 M，例如大约小于10 M、10 M
‑10
或10 M或更小的亲和力(KD)结合。
对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10 M，例如大约小于10 M、10 M
‑10
或10 M或更小的亲和力(KD)结合。
[0076] 术语"KD"或“Kd”是指特定抗体‑抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗‑8 ‑9 ‑10
体以小于大约10‑7M，例如小于大约10 M、10 M或10 M或更小的解离平衡常数(KD)结合凝
血酶，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。
体以小于大约10‑7M，例如小于大约10 M、10 M或10 M或更小的解离平衡常数(KD)结合凝
血酶，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。
[0077] 本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接
的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至
所述编码序列。
的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至
所述编码序列。
[0078] 术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施
方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载
体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附
加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组
一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载
体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附
加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组
一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
[0079] 现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5‑8章和15章。例如，鼠可以用人凝血酶或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯
化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明
所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。
人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从
ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，
2001ISBN012441351上获得。
化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明
所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。
人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从
ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，
2001ISBN012441351上获得。
[0080] 术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如
大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科
(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球
菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵
母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系
包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科
(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球
菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵
母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系
包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
[0081] 本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定
地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，
特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人凝血酶特异性结合的抗体得到稳定的克
隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养
液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗
去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS‑PAGE检测抗体片段，收集。
抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分
子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如‑70℃，或者冻干。
地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，
特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人凝血酶特异性结合的抗体得到稳定的克
隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养
液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗
去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS‑PAGE检测抗体片段，收集。
抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分
子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如‑70℃，或者冻干。
[0082] “给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体
的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的
处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和
“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。
“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊
断应用。
的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的
处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和
“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。
“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊
断应用。
[0083] “治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。
通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这
类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的
治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体
重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评
价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管
本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根
据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U
检验、Kruskal‑Wallis检验(H检验)、Jonckheere‑Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在
统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这
类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的
治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体
重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评
价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管
本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根
据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U
检验、Kruskal‑Wallis检验(H检验)、Jonckheere‑Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在
统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
[0084] “保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变
而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个
氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of
the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的
氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个
氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of
the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的
氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
[0085] “有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，
待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可
以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可
以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
[0086] “外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
[0087] “同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位
置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是
两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对
时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序
列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序
列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是
两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对
时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序
列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序
列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
[0088] 本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，
而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面
不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后
代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面
不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后
代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
[0089] 本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自
目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待
扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。
PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的
cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring Harbor
Symp.Ouant.Biol.51:263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。
本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯
一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特
定部分。
目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待
扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。
PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的
cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring Harbor
Symp.Ouant.Biol.51:263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。
本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯
一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特
定部分。
[0090] “任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1‑3个抗体重链可变区”意味着特定序
列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
[0091] “药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药
物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
[0092] 二.实施例与测试例
[0093] 以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验
手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，
为市场购买的常规试剂。
手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，
为市场购买的常规试剂。
[0094] 实施例1：凝血酶抗原及检测用蛋白的制备
[0095] 1、相关凝血酶及凝血酶原序列
[0096] 编码人凝血酶原(h‑prothrombin)序列、小鼠凝血酶原(m‑prothrombin)序列和食蟹猕猴凝血酶原(cyno‑prothrombin)序列由CRO公司上海旭冠生物科技发展有限公司合成
(以上凝血酶原蛋白均由本发明设计模版序列)，经过一步PCR在3’端带上His或Flag编码序
列后，带His标签的人凝血酶原(h‑prothrombin‑his)，带Flag标签的人凝血酶原(h‑
prothrombin‑flag)，带His标签的小鼠凝血酶原(m‑prothrombin‑his)和带His标签的食蟹
猕猴凝血酶原(cyno‑prothrombin‑his)分别克隆到pTT5载体上(Biovector，Cat#:
102762)，在HEK293E细胞内实现瞬时表达。重组表达得到的凝血酶原(prothrombin)通过初
步纯化和体外激活得到thrombin,并经过进一步纯化，得到的带Flag标签的人凝血酶(h‑
thrombin‑flag)用于免疫，带His标签的人凝血酶(h‑thrombin‑His)，带His标签的小鼠凝
血酶(m‑thrombin‑his)和带His标签的食蟹猕猴凝血酶(cyno‑thrombin‑his)用于体外筛
选。
(以上凝血酶原蛋白均由本发明设计模版序列)，经过一步PCR在3’端带上His或Flag编码序
列后，带His标签的人凝血酶原(h‑prothrombin‑his)，带Flag标签的人凝血酶原(h‑
prothrombin‑flag)，带His标签的小鼠凝血酶原(m‑prothrombin‑his)和带His标签的食蟹
猕猴凝血酶原(cyno‑prothrombin‑his)分别克隆到pTT5载体上(Biovector，Cat#:
102762)，在HEK293E细胞内实现瞬时表达。重组表达得到的凝血酶原(prothrombin)通过初
步纯化和体外激活得到thrombin,并经过进一步纯化，得到的带Flag标签的人凝血酶(h‑
thrombin‑flag)用于免疫，带His标签的人凝血酶(h‑thrombin‑His)，带His标签的小鼠凝
血酶(m‑thrombin‑his)和带His标签的食蟹猕猴凝血酶(cyno‑thrombin‑his)用于体外筛
选。
[0097] SEQ ID NO:1
[0098] 带Flag标签(DYKDDDDK)的人凝血酶原
[0099]
[0100] SEQ ID NO:2
[0101] 带His标签(HHHHHH)的人凝血酶原
[0102]
[0103] SEQ ID NO:3
[0104] 带His标签的食蟹猕猴凝血酶原
[0105]
[0106]
[0107] SEQ ID NO:4
[0108] 带His标签的小鼠凝血酶原
[0109]
[0110] 注：序列中双下划线部分为凝血酶序列，序列中单下划线部分为相应标签序列。
[0111] 2.凝血酶原相关重组蛋白的纯化、体外激活，凝血酶相关重组蛋白以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
[0112] 1).带His标签的人凝血酶原、带His标签的小鼠凝血酶原和带His标签的食蟹猕猴凝血酶原的纯化步骤：
[0113] 将细胞表达上清样品高速离心去除杂质。用PBS缓冲液(pH 7.4)平衡镍柱，冲洗2‑5倍柱体积，将上清样品以一定流速上Ni Sepharose excel柱。用PBS缓冲液冲洗柱子，至
A280读数降至基线，再用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出
液，最后用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用
脱盐柱将样品缓冲液换成PBS溶液，以备后续体外激活和进一步纯化。
A280读数降至基线，再用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出
液，最后用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用
脱盐柱将样品缓冲液换成PBS溶液，以备后续体外激活和进一步纯化。
[0114] 2).带Flag标签的人凝血酶原重组蛋白的纯化步骤：
[0115] 将样品高速离心去除杂质，并浓缩至适当体积。利用0.5×PBS(pH 7.4)平衡flag亲和柱，冲洗2‑5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品上柱。用0.5×PBS冲洗柱子，至
A280读数降至基线。用PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。用含有100μg/ml 3xFlag多肽的
TBS缓冲液洗脱目的蛋白，并收集，以备后续体外激活和进一步纯化。
A280读数降至基线。用PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。用含有100μg/ml 3xFlag多肽的
TBS缓冲液洗脱目的蛋白，并收集，以备后续体外激活和进一步纯化。
[0116] 3).凝血酶原相关重组蛋白的体外激活以及激活后凝血酶相关蛋白的进一步纯化：
[0117] 经过上述初步亲和层析(镍柱或Flag亲和柱)得到的凝血酶原，以质量比100：1与Ecarin酶混合均匀后于室温孵育过夜。激活后的样品高速离心去除沉淀后，用离子交换柱
和分子排阻色谱法SEC做进一步纯化。
和分子排阻色谱法SEC做进一步纯化。
[0118] 3.1)离子交换
[0119] 带His标签的人凝血酶、带His标签的小鼠凝血酶、带His标签的食蟹猕猴凝血酶用阳离子交换柱SP HP柱来纯化，带Flag标签的人凝血酶用阴离子交换柱QHP柱进一步纯化。
阳离子交换选用缓冲液A为10mM PB,pH6.8缓冲液，缓冲液B为10mM PB,pH6.8，1M NaCl缓冲
液，阴离子交换选用Buffer A为10mM Tris‑HCl,pH8.5缓冲液，缓冲液B为10mM Tris‑HCl,
pH8.5，1M NaCl缓冲液。
阳离子交换选用缓冲液A为10mM PB,pH6.8缓冲液，缓冲液B为10mM PB,pH6.8，1M NaCl缓冲
液，阴离子交换选用Buffer A为10mM Tris‑HCl,pH8.5缓冲液，缓冲液B为10mM Tris‑HCl,
pH8.5，1M NaCl缓冲液。
[0120] 离子交换柱预先用5个柱体积的缓冲液A缓冲液平衡，将换至缓冲液A缓冲液的激活后凝血酶样品以一定流速上样，上样结束后再以缓冲液A缓冲液平衡柱子至A280吸收值
到基线。用缓冲液B缓冲液在20个柱体积时间内从0％上升到80％的浓度梯度洗脱，收集各
洗脱峰，经过SDS‑PAGE鉴定目的蛋白所在组分，并进一步通过质谱和肽图验证。
到基线。用缓冲液B缓冲液在20个柱体积时间内从0％上升到80％的浓度梯度洗脱，收集各
洗脱峰，经过SDS‑PAGE鉴定目的蛋白所在组分，并进一步通过质谱和肽图验证。
[0121] 3.2)分子排阻色谱
[0122] SEC柱(superdex75)预先用PBS(pH 7.4)平衡，样品上样后用PBS作为流动相洗脱，收集各洗脱峰，经过SDS‑PAGE鉴定目的蛋白所在组分，并进一步通过质谱和肽图验证。
[0123] 3.3)杂交瘤，重组抗体的纯化
[0124] 将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，杂交瘤表达上清用Protein G柱，重组抗体表达上清用Protein A柱进行纯化。用PBS(pH 7.4)冲洗柱子，至A280读数降至基线。用
100mM乙酸pH3.0洗脱目的蛋白，用1M Tris‑HCl,pH8.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS
平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。
100mM乙酸pH3.0洗脱目的蛋白，用1M Tris‑HCl,pH8.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS
平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。
[0125] 实施例2：抗人凝血酶杂交瘤单克隆抗体的制备
[0126] 1.免疫
[0127] 抗人凝血酶单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012‑0001)。饲养环境：SPF
级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20‑25℃；湿度40‑
60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为带Flag标签的人凝血酶(SEQ ID
NO:1双下划线所示)。
级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20‑25℃；湿度40‑
60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为带Flag标签的人凝血酶(SEQ ID
NO:1双下划线所示)。
[0128] 免疫方案：用 Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)与ThermoAlum(Thermo Cat No.77161)交叉免疫。抗原与佐剂( Gold Adjuvant)比例为1:
1，抗原与佐剂(Thermo Alum)比例为3:1，50μg/只(初次免疫)，25μg/只(加强免疫)。
抗原乳化后进行接种，时间为第0、14、28、42、56天。
1，抗原与佐剂(Thermo Alum)比例为3:1，50μg/只(初次免疫)，25μg/只(加强免疫)。
抗原乳化后进行接种，时间为第0、14、28、42、56天。
[0129] 第0天腹膜内(IP)注射50μg/只的乳化后抗原。第14天皮下(sc)多点(一般背部6‑8点)注射25μg/只。第28，42天根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。
在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射50μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。
在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射50μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。
[0130] 于第22，36，50，64天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在4免以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。
[0131] 2.脾细胞融合
[0132] 采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(TM 6
CRL‑8287 )进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5‑1×10/ml的密度用MC
半固体完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI和2％Methyl cellulose的RPMI‑1640培养
基)重悬，分装于35mm细胞培养皿中，37℃，5％CO2孵育7‑9天。融合后第7‑9天，根据细胞克
隆大小，挑取单细胞克隆至加有200μl/well的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的
RPMI‑1640培养基)的96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2培养3天进行ELISA检测。
CRL‑8287 )进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5‑1×10/ml的密度用MC
半固体完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI和2％Methyl cellulose的RPMI‑1640培养
基)重悬，分装于35mm细胞培养皿中，37℃，5％CO2孵育7‑9天。融合后第7‑9天，根据细胞克
隆大小，挑取单细胞克隆至加有200μl/well的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的
RPMI‑1640培养基)的96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2培养3天进行ELISA检测。
[0133] 3.杂交瘤细胞筛选
[0134] 根据杂交瘤细胞生长密度，用凝血酶结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测(见测试例1)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞上清进行和凝血酶原结合的ELISA检测(见测
试例3)。阳性孔细胞及时进行扩增冻存保种和二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。
试例3)。阳性孔细胞及时进行扩增冻存保种和二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。
[0135] 每次亚克隆细胞均需进行凝血酶结合ELISA和凝血酶原结合ELISA检测。通过以上实验筛选得到杂交瘤克隆mAb‑1601，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯
化抗体，供在检测例中使用。
化抗体，供在检测例中使用。
[0136] 4.杂交瘤阳性克隆序列测定
[0137] 从阳性杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596‑018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA，用
TM
PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara,Cat No.2680A)。将反转录得
到的cDNA采用mouse Ig‑Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序
公司测序。得到的阳性克隆mAb‑1601的DNA对应的氨基酸序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6
所示：
TM
PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara,Cat No.2680A)。将反转录得
到的cDNA采用mouse Ig‑Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序
公司测序。得到的阳性克隆mAb‑1601的DNA对应的氨基酸序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6
所示：
[0138] 杂交瘤细胞获得重链可变区：
[0139]
[0140] 杂交瘤细胞获得轻链可变区：
[0141]
[0142] 注：顺序为FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
[0143] 表1.各重链及轻链CDR区序列
[0144]
[0145] 通过实施例4对阳性克隆mAb‑1601进行分子克隆和表达纯化，得到嵌合抗体CH‑1601，针对人凝血酶、凝血酶原进行结合活性鉴定(测试例1和测试例2)。同时，检测嵌合抗
体CH‑1601与猴属的凝血酶的交叉结合活性(见测试例3)，与人凝血酶的亲和力(见测试例
6)，以及对人凝血酶酶活的影响(见测试例5)。检测结果如下表2和图1所示：
体CH‑1601与猴属的凝血酶的交叉结合活性(见测试例3)，与人凝血酶的亲和力(见测试例
6)，以及对人凝血酶酶活的影响(见测试例5)。检测结果如下表2和图1所示：
[0146] 表2.嵌合抗体与不同种属的凝血酶及人凝血酶原结合的体外活性
[0147]
[0148] 表2结果表明，CH‑1601与不同种属的凝血酶，包括人、猴凝血酶均有强的结合力，但不与鼠源凝血酶结合。图1结果表明，CH‑1601与凝血酶结合后并不影响其对底物S2228的
酶解活性。
酶解活性。
[0149] 实施例3.鼠抗人凝血酶单克隆抗体的人源化
[0150] 1.杂交瘤克隆mAb‑1601人源化构架选择
[0151] 通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与mAb‑1601同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，将这两个鼠源抗体的CDR分别移植
到相应的人源模板中，形成次序为FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4的可变区序列。其中
氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
到相应的人源模板中，形成次序为FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4的可变区序列。其中
氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
[0152] 鼠源抗体mAb‑1601的人源化轻链模板为IGKV1‑39*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV3‑23*04和hjh6.1，人源化可变区序列如下：
[0153] >h1601‑001(CDR graft)人源化重链可变区
[0154]
[0155]
[0156] >h1601‑001(CDR graft)人源化轻链可变区
[0157]
[0158] 注：顺序为FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
[0159] 2.杂交瘤克隆CH‑1601的回复突变设计，见下表3。
[0160] 表3.杂交瘤克隆回复突变设计
[0161]
[0162] 注：如Q3K表示依照Kabat编号系统，将3位K突变回Q。
[0163] Graft代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
[0164] 突变后的具体序列举例如下：
[0165] h1601_VH.1B：
[0166] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYHGNSYVFDYWGQGTTVTVSS
[0167] SEQ ID NO：14
[0168] h1601_VH.1D：
[0169] EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYHGNSYVFDYWGQGTTVTVSS
[0170] SEQ ID NO：15
[0171] h1601_VL.1A：
[0172] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPWTFGGGTKVEIK
[0173] SEQ ID NO：17
[0174] h1601_VL.1C：
[0175] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGKAPRLIISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPWTFGGGTKVEIK
[0176] SEQ ID NO：18
[0177] 回复突变后的轻重链可变区进行重新组合，获得的抗体包含的轻重链可变区组合举例如下：
[0178] 表4.人源化抗体轻重链可变区序列
[0179] 抗体编号 重链可变区 轻链可变区h1601‑001 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：16
h1601‑002 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：16
h1601‑003 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：16
h1601‑004 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：17
h1601‑005 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：17
h1601‑006 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：17
h1601‑007 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：18
h1601‑008 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：18
h1601‑009 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：18
h1601‑002 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：16
h1601‑003 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：16
h1601‑004 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：17
h1601‑005 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：17
h1601‑006 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：17
h1601‑007 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：18
h1601‑008 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：18
h1601‑009 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：18
[0180] 上述可变区根据后面实施例4的制备方法进行抗体克隆和表达纯化，并通过测试例1的ELISA实验检测其与人凝血酶蛋白的结合活性。根据检测结果选择抗体进行下一步的
体内体外活性检测.
体内体外活性检测.
[0181] 实施例4.嵌合抗体以及人源化抗体的制备
[0182] 抗体选用人重链IgG4/轻链kappa的恒定区与各可变区组合，在Fc段做了S228P突变来增加IgG4抗体的稳定性，也可选用本领域其它已知的突变来增加其性能。
[0183] 重链恒定区：
[0184] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[0185] SEQ ID NO：19
[0186] 轻链恒定区：
[0187] RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0188] SEQ ID NO：20
[0189] 1.嵌合抗体的分子克隆
[0190] 杂交瘤筛选所获得的候选抗体分子经过测序后，得到可变区编码基因序列。以测序所得序列设计引物首尾引物，以测序基因为模板，经过PCR搭建各抗体VH/VK基因片段，再
与表达载体pHr(带信号肽及hIgG4恒定区基因(CH1‑FC/CL)片段)进行同源重组,构建重组
抗体全长表达质粒VH‑CH1‑FC‑pHr/VK‑CL‑pHr。
与表达载体pHr(带信号肽及hIgG4恒定区基因(CH1‑FC/CL)片段)进行同源重组,构建重组
抗体全长表达质粒VH‑CH1‑FC‑pHr/VK‑CL‑pHr。
[0191] 2.人源化抗体的分子克隆
[0192] 人源设计之后的抗体序列，经过密码子优化后产生人密码子偏好的编码基因序列，设计引物PCR搭建各抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因
(CH1‑FC/CL)片段)进行同源重组,构建人源化抗体全长表达质粒VH‑CH1‑FC‑pHr/VK‑CL‑
pHr。
(CH1‑FC/CL)片段)进行同源重组,构建人源化抗体全长表达质粒VH‑CH1‑FC‑pHr/VK‑CL‑
pHr。
[0193] 3.嵌合以及人源化抗体的表达与纯化
[0194] 分别表达抗体轻重链的质粒以1：1.5的比例转染HEK293E细胞，6天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用
100mM乙酸pH3.0洗脱目的蛋白，用1M Tris‑HCl,pH8.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS
平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。
100mM乙酸pH3.0洗脱目的蛋白，用1M Tris‑HCl,pH8.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS
平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。
[0195] 实施例5.抗原表位的确定
[0196] 纯化抗体H1601‑008被木瓜蛋白酶切割(图6)，分离Fab片段，与人PPACK‑凝血酶组合。其中，PPACK为凝血酶抑制剂，购自ApexBio。凝血酶为本专利SEQ ID NO：1中带双下划线
的序列。人PPACK‑凝血酶‑FAB复合物经结晶并用于结构分析。获得的结构统计结果如下：分
辨率为Rfactor＝23.4％，Rfree＝27.2％，不对称单元内有两个复合物，Ramachandran：
favoured＝93.5％，异常值＝0％。晶体结构显示Fab的LCDR1,LCDR2,LCDR3,HCDR3与凝血酶
紧密结合(图7)。
的序列。人PPACK‑凝血酶‑FAB复合物经结晶并用于结构分析。获得的结构统计结果如下：分
辨率为Rfactor＝23.4％，Rfree＝27.2％，不对称单元内有两个复合物，Ramachandran：
favoured＝93.5％，异常值＝0％。晶体结构显示Fab的LCDR1,LCDR2,LCDR3,HCDR3与凝血酶
紧密结合(图7)。
[0197] 特别地，凝血酶的R62,Y71，E72，R73,Y114残基分别与Fab的四个环有氢键作用(图8)。本实施例中凝血酶残基号的编号规则为从本发明所述凝血酶片段序列的N端到C端顺序
编号。
编号。
[0198] 对抗体‑凝血酶连接的PISA分析表明，复合物中总的隐藏表面积是 重链中的接触残基是(Kabat编码)：100、102、103、104、105、107、109。其均在CDR中。CDRL1‑
KASEDIYNRLA、CDRL2‑GATSLET、CDRL3‑QQYWSTPWT、CDRH3‑DHYHGNSYVFDY(下划线的残基接
触)。CDRL被发现较为重要，其提供抗体上57.3％的隐藏表面积。轻链中的接触残基是：30、
31、32、46、49、50、53、55、91、92、96。
KASEDIYNRLA、CDRL2‑GATSLET、CDRL3‑QQYWSTPWT、CDRH3‑DHYHGNSYVFDY(下划线的残基接
触)。CDRL被发现较为重要，其提供抗体上57.3％的隐藏表面积。轻链中的接触残基是：30、
31、32、46、49、50、53、55、91、92、96。
[0199] 凝血酶中的接触残基为：9、24、60、62、64、66、69、70、71、72、73、74、75、78、113、114。对隐藏表面积最重要的独立贡献为：肽段R70‑Y71‑E72‑R73‑N74‑I75和Y114。
[0200] 实施例6、h1601‑008选择活性提高
[0201] 我们决定对h1601‑008进行亲和力成熟，在提高对thrombin亲和力的前提下，尽可能降低或保持其对pro‑thrombin的结合活性，以提高h1601‑008对两种分子之间的选择性。
[0202] 提高选择活性采用M13噬菌体展示技术。采用codon‑based引物(在引物合成过程中，单个密码子都由野生型密码子和NNK组成)在每个CDR引入突变，每个CDR都构建一个单
独的噬菌体展示文库。根据CDR的长短，调整每个CDR需要掺入的NNK比例和需要文库的库容
大小，具体方案见表5。
独的噬菌体展示文库。根据CDR的长短，调整每个CDR需要掺入的NNK比例和需要文库的库容
大小，具体方案见表5。
[0203] 表5.文库库容及NNK掺入比例设计表
[0204]Lib CDR length NNK ratio Lib size
H1 5 50％ >2E7
H2 17 20％ >1E8
H3 14 20％ >1E8
L1 11 30％ >1E8
L2 7 50％ >1E8
L3 7 50％ >1E8
H1 5 50％ >2E7
H2 17 20％ >1E8
H3 14 20％ >1E8
L1 11 30％ >1E8
L2 7 50％ >1E8
L3 7 50％ >1E8
[0205] 构建好的6个文库经包装成噬菌体后，进行淘筛：在液相与高浓度pro‑thrombin预结合后，加入生物素化Thrombin结合，链霉亲和素捕获，淘洗，洗脱，重新侵染大肠杆菌，进
行下一个循环的淘筛。每一轮淘筛将生物素化Thrombin浓度降低2‑5倍。3轮淘筛之后，每个
文库挑取单克隆进行测序验证。发现只有HCDR3有明显的氨基酸富集，根据CDR区氨基酸残
基富集程度，挑选获得部分克隆如aTM‑1、aTM‑2、aTM‑4、aTM‑7，构建全长Ig进行哺乳动物细
胞表达。
行下一个循环的淘筛。每一轮淘筛将生物素化Thrombin浓度降低2‑5倍。3轮淘筛之后，每个
文库挑取单克隆进行测序验证。发现只有HCDR3有明显的氨基酸富集，根据CDR区氨基酸残
基富集程度，挑选获得部分克隆如aTM‑1、aTM‑2、aTM‑4、aTM‑7，构建全长Ig进行哺乳动物细
胞表达。
[0206] 所挑选的克隆与h1601‑008仅在HCDR3上有差异。相关的HCDR3通式及其相应重链可变区如下所描述。
[0207] 筛选获得的HCDR3序列通式如下：
[0208] DHYX1G X2SYVFD X3 SEQ ID NO：21；
[0209] 进而获得相关的重链可变区序列通式如下：
[0210] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYX1G X2SYVFD X3WGQGTTVTVSS SEQ ID NO：22；
[0211] 其中X1选自H、I，L，M；X2选自N，A；X3选自Y、S、L、T；
[0212] 获得的具体相关序列包括但不限于表6所述：
[0213] 表6.亲和力筛选所确定的重链可变区序列
[0214] 重链可变区 X1 X2 X3 VH序列代号 包含的HCDR3序列h1601‑008 H N Y SEQ ID NO：14 DHYHGNSYVFDY(SEQ ID NO：9)
aTM‑1 I A Y SEQ ID NO：27 DHYIGASYVFDY(SEQ ID NO：23)
aTM‑2 L N S SEQ ID NO：28 DHYLGNSYVFDS(SEQ ID NO：24)
aTM‑4 L N L SEQ ID NO：29 DHYLGNSYVFDL(SEQ ID NO：25)
aTM‑7 M N T SEQ ID NO：30 DHYMGNSYVFDT(SEQ ID NO：26)
aTM‑1 I A Y SEQ ID NO：27 DHYIGASYVFDY(SEQ ID NO：23)
aTM‑2 L N S SEQ ID NO：28 DHYLGNSYVFDS(SEQ ID NO：24)
aTM‑4 L N L SEQ ID NO：29 DHYLGNSYVFDL(SEQ ID NO：25)
aTM‑7 M N T SEQ ID NO：30 DHYMGNSYVFDT(SEQ ID NO：26)
[0215] 克隆蛋白经纯化后，利用biacore测定Thrombin和pro‑thrombin的亲合力。
[0216] 结果显示，选择活性aTM‑1提高了1.8倍(18.2/9.9)，对Thrombin的亲合力提高明显，同时对pro‑thrombin也有一定提高。结果见表10。
[0217] 以下用生化测试方法验证本发明抗体性能及有益效果。
[0218] 测试例1.凝血酶抗体结合人凝血酶蛋白的ELISA实验
[0219] 抗凝血酶抗体的结合力通过抗体与带His标签的人凝血酶的ELISA实验来检测。用生物素标记试剂盒(东仁化学，Cat No.LK03)标记的带His标签的凝血酶通过与包被在酶标
板中的链霉亲和素结合，从而固定到96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗
体和凝血酶的结合活性，具体实验方法如下。
板中的链霉亲和素结合，从而固定到96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗
体和凝血酶的结合活性，具体实验方法如下。
[0220] 用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417‑100TAB)缓冲液将链霉亲和素(Sigma，Cat No.S4762‑5MG)稀释至5μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板中，于37℃孵育箱中
放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/孔，
37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜(16‑18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，
并用PBST缓冲液(PH7.4 PBS含0.05％tweeen‑20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液
(PH7.4 PBS含1％BSA)稀释至0.5μg/ml的生物素标记的带His标签的人凝血酶(SEQ ID NO:
2双下划线所示)，置37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗
板6次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度的本发明凝血酶待测抗体，放于37℃
孵育箱孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记
的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109‑035‑003)，37℃孵育1小时。用PBST
洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52‑00‑03)，于室温孵育10‑15min，加入
50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算凝血酶抗体
对人凝血酶的结合EC50值。结果如表7所示。
放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/孔，
37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜(16‑18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，
并用PBST缓冲液(PH7.4 PBS含0.05％tweeen‑20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液
(PH7.4 PBS含1％BSA)稀释至0.5μg/ml的生物素标记的带His标签的人凝血酶(SEQ ID NO:
2双下划线所示)，置37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗
板6次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度的本发明凝血酶待测抗体，放于37℃
孵育箱孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记
的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109‑035‑003)，37℃孵育1小时。用PBST
洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52‑00‑03)，于室温孵育10‑15min，加入
50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算凝血酶抗体
对人凝血酶的结合EC50值。结果如表7所示。
[0221] 表7.嵌合抗体和人源化抗体的结合活性
[0222]人源化抗体 Binding ELISA EC50(nM)
h1601‑005 5.80
h1601‑006 4.45
h1601‑008 1.54
h1601‑009 1.49
h1601‑005 5.80
h1601‑006 4.45
h1601‑008 1.54
h1601‑009 1.49
[0223] 结果显示本发明筛选得到的人源化抗体与人凝血酶蛋白有较高的结合活性。
[0224] 测试例2.凝血酶抗体结合人凝血酶原蛋白的ELISA实验
[0225] 凝血酶原是酶解活化得到凝血酶的前体。抗凝血酶原抗体的结合力通过抗体与h‑prothrombin的ELISA实验来检测，具体实验方法如下。
[0226] 用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417‑100TAB)缓冲液将带His标签的人凝血酶原(SEQ ID NO:2)稀释至10μg/ml浓度，以100μl/孔的体积加入96孔酶标板中，4℃放置过夜
(16‑18小时)。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/
孔，37℃孵育箱孵育2.5小时进行封闭。封闭结束后弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4
PBS含0.05％tweeen‑20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液(PH7.4 PBS含1％BSA)梯度
稀释的本发明凝血酶待测抗体，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加
入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat
No.109‑035‑003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat
No.52‑00‑03)，于室温孵育10‑15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在
波长450nm处读取吸收值，计算凝血酶抗体对人凝血酶原的结合EC50值。
(16‑18小时)。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/
孔，37℃孵育箱孵育2.5小时进行封闭。封闭结束后弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4
PBS含0.05％tweeen‑20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液(PH7.4 PBS含1％BSA)梯度
稀释的本发明凝血酶待测抗体，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加
入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat
No.109‑035‑003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat
No.52‑00‑03)，于室温孵育10‑15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在
波长450nm处读取吸收值，计算凝血酶抗体对人凝血酶原的结合EC50值。
[0227] 测试例3.抗凝血酶抗体与不同种属凝血酶的交叉结合实验
[0228] 为检测筛选到的凝血酶抗体对于猴属来源的凝血酶的体外结合能力，食蟹猕猴凝血酶被用于进行体外结合检测。
[0229] 用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417‑100TAB)缓冲液将His‑tag antibody(GenScript，Cat No.A00174)稀释至0.5μg/ml浓度，以100μl/孔的体积加入96孔酶标板中，
于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封
闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜(16‑18小时)进行封闭。封闭结束
后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen‑20)洗板5次后，加入50μl/孔
用样品稀释液(PH7.4 PBS含1％BSA)稀释至0.5μg/ml的带His标签的食蟹猕猴凝血酶蛋白
(SEQ ID NO:3双下划线所示)，置37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应
液，用PBST洗板6次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度本发明凝血酶待测抗体，
放于37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入100μl/孔用样品稀释液稀释
的HRP标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109‑035‑003)，37℃孵育1小
时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52‑00‑03)，于室温孵育10‑
15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算
凝血酶抗体对食蟹猕猴凝血酶的结合EC50值。结果见表8。
于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封
闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜(16‑18小时)进行封闭。封闭结束
后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％tweeen‑20)洗板5次后，加入50μl/孔
用样品稀释液(PH7.4 PBS含1％BSA)稀释至0.5μg/ml的带His标签的食蟹猕猴凝血酶蛋白
(SEQ ID NO:3双下划线所示)，置37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应
液，用PBST洗板6次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度本发明凝血酶待测抗体，
放于37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入100μl/孔用样品稀释液稀释
的HRP标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109‑035‑003)，37℃孵育1小
时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52‑00‑03)，于室温孵育10‑
15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算
凝血酶抗体对食蟹猕猴凝血酶的结合EC50值。结果见表8。
[0230] 表8.本发明抗体与不同种属凝血酶的交叉结合活性
[0231] 本发明抗体 猴凝血酶EC50(nM)H1601‑008 11.18
[0232] 结果表明，本发明抗体h1601‑008与猴凝血酶有强的结合力。
[0233] 测试例4.BIAcore检测凝血酶抗体亲和力实验
[0234] 按照人抗捕获试剂盒(Cat.#BR‑1008‑39，GE)说明书中所述的方法将人抗捕获抗体共价偶联于CM5生物传感芯片(Cat.#BR‑1000‑12，GE)上，从而亲和捕获待测抗体，然后于
芯片表面流经凝血酶抗原带His标签的人凝血酶，利用Biacore仪器实时检测反应信号从而
获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值。在实验中每个循环解离完成后，用人抗捕
获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。结果见表9。
芯片表面流经凝血酶抗原带His标签的人凝血酶，利用Biacore仪器实时检测反应信号从而
获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值。在实验中每个循环解离完成后，用人抗捕
获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。结果见表9。
[0235] 表9.本发明抗体与人凝血酶的亲和力活性
[0236] 本发明抗体 人凝血酶BIAcoreKD(nM) 人凝血酶原BIAcoreKD(nM)H1601‑008 8.97 94.3
H1601‑009 8.17 ‑‑
H1601‑009 8.17 ‑‑
[0237] 结果表明本发明抗体h1601‑008、h1601‑009与CH‑1601一样，对人凝血酶有较强的结合活性和亲和力。
[0238] 对经噬菌体展示技术(实施例6)筛选获得的抗体进行亲和力测试，所得结果见表10。
[0239] 表10.抗体biacore测定结果
[0240]
[0241] 由上可知，通过噬菌体展示技术筛选得到的新抗体，在Thrombin的结合活性方面有了很大的提高，选择性也略有增高。
[0242] 测试例5.凝血酶抗体对凝血酶酶活的影响
[0243] 本实验通过测试凝血酶对其底物S2228的酶解活性，检测本发明抗体对凝血酶酶活的影响。
[0244] 用pH7.4的PBS梯度稀释带His标签的人凝血酶至浓度为100nM，25μl/孔，加入黑壁透明底96孔板中。用PBS把本发明凝血酶待测抗体梯度稀释至浓度为2000nM‑62.5nM(1:2梯
度稀释)，25μl/孔，也加入此板中。室温孵育30‑60分钟后，用PBS稀释S2228(用于检测凝血
酶活性的底物，吉尔生化(上海)有限公司合成)至浓度为4mM，50μl/孔，加入到上一步骤的
板中。阴性对照为仅加入凝血酶，或仅加入S2228的对照孔。室温孵育30分钟后，用NOVOStar
酶标仪在波长405nm处读取吸收值。结果见图2，其中凝血酶和S2228表示阴性对照孔测出的
OD值，0.625:1，1.25:1，2.5:1，5:1，10:1，20:1表示待测抗体与凝血酶的不同摩尔比时测出
的OD值。
度稀释)，25μl/孔，也加入此板中。室温孵育30‑60分钟后，用PBS稀释S2228(用于检测凝血
酶活性的底物，吉尔生化(上海)有限公司合成)至浓度为4mM，50μl/孔，加入到上一步骤的
板中。阴性对照为仅加入凝血酶，或仅加入S2228的对照孔。室温孵育30分钟后，用NOVOStar
酶标仪在波长405nm处读取吸收值。结果见图2，其中凝血酶和S2228表示阴性对照孔测出的
OD值，0.625:1，1.25:1，2.5:1，5:1，10:1，20:1表示待测抗体与凝血酶的不同摩尔比时测出
的OD值。
[0245] 图2结果表明，h1601‑008与凝血酶结合后，并不影响其对底物S2228的酶解活性。
[0246] 凝血酶抗体药效学实验
[0247] 测试例6.正常人血浆APTT实验
[0248] 本实验通过将正常人血浆与IgG和不同浓度的凝血酶抗体共孵育，测试本发明抗体对APTT值(activated partial thromboplastin time，活化部分凝血活酶时间)的影响。
[0249] IgG为阴性对照，即利用传统的亲和层析方法如ProteinA纯化获得的人免疫球蛋白；h1601‑008为本发明不同浓度待测抗体。
[0250] 实验结果如图3所示，随着抗体CH‑1601和h1601‑008浓度的增加，正常人血浆的APTT值也有所延长。h1601‑008在最高浓度3200nM时，APTT值的增加达到28.7秒的峰值(表
11)。
11)。
[0251] 表11.不同浓度凝血酶抗体的对正常人血浆的APTT值的增加量
[0252]
[0253] 测试例7.食蟹猴动静脉吻合模型
[0254] 16只健康食蟹猴(雌雄各半，海南金港生物技术股份有限公司提供)在实验室环境中适应两周，称重，根据体重均衡分成4组，每组4只。用舒泰进行麻醉，之后再追加戊巴比妥
进行深度麻醉。术前对不同组分别缓慢下肢静脉推注本发明抗体药物及对照药物(药物及
剂量见表12)。以下步骤均在37℃恒温手术台上操作。在腹股沟下手术分离出股动静脉，先
做左侧再做右侧。手术动静脉插管。插管固定好之后，放开动脉夹(放开左侧动脉夹时间为
给药后15分钟，右侧的时间为给药后25分钟)并同时开始计时，血流持续15分钟。用止血钳
或者血管夹夹住插管的两端防止栓子脱落，取出硅胶管放入有生理盐水的培养皿，然后用
手术剪取出带有血栓的促凝线，在擦手纸上两端各吸水3秒，后精密电子称称重，并算出血
栓的净重。
进行深度麻醉。术前对不同组分别缓慢下肢静脉推注本发明抗体药物及对照药物(药物及
剂量见表12)。以下步骤均在37℃恒温手术台上操作。在腹股沟下手术分离出股动静脉，先
做左侧再做右侧。手术动静脉插管。插管固定好之后，放开动脉夹(放开左侧动脉夹时间为
给药后15分钟，右侧的时间为给药后25分钟)并同时开始计时，血流持续15分钟。用止血钳
或者血管夹夹住插管的两端防止栓子脱落，取出硅胶管放入有生理盐水的培养皿，然后用
手术剪取出带有血栓的促凝线，在擦手纸上两端各吸水3秒，后精密电子称称重，并算出血
栓的净重。
[0255] 表12
[0256]
[0257]
[0258] 实验结果如图4所示，在3mg/kg及6mg/kg的剂量下，H1601‑008能显著的抑制食蟹猴血栓的生成，与阴性抗体组(IgG‑6mg/kg)的平均血栓重量相比较，具有统计学上的极显
著差异。
著差异。
[0259] 统计方法为One‑way ANOVA及student t test。与IgG组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0260] 测试例8.CT2值的测定及治疗窗口的估算
[0261] 本实验通过将正常食蟹猴血浆与不同浓度的凝血酶抗体共孵育(参考测试6的方法)，测试本发明抗体对APTT值的影响。
[0262] 实验结果如图5所示，随着抗体H1601‑008浓度的增加，正常猴血浆的APTT值也有明显延长。H1601‑008在最高浓度25600nM时，APTT值达到66.9秒的峰值(表13)。
[0263] 表13.不同浓度凝血酶抗体对正常食蟹猴血浆APTT值的影响
[0264]
[0265] 测试例9：本发明凝血酶抗体的药代动力学测试
[0266] 以食蟹猴为受试动物，用ELISA方法(见测试例4)检测给药后食蟹猴血清中的血药浓度，用Winnolin软件和EXCEL来计算受试药物的t1/2及其主要参数。研究本发明的化合物
在食蟹猴体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。
在食蟹猴体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。
[0267] 实验用食蟹猴，普通级，雄性，3‑5岁，3.5‑4.5公斤，成都华西海圻医药科技有限公司自养。饲养环境：普通区房间。实验室环境适应性饲养不小于3天，12/12小时光/暗周期调
节，温度16‑26℃，相对湿度40‑70％。对食蟹猴进行分组，每组3只。实验当天，每只食蟹猴分
别静脉注射受试药物，给药剂量为3mg/kg，10mg/kg。静脉注射体积为10ml/kg，给药速度2‑
4ml/分钟。
节，温度16‑26℃，相对湿度40‑70％。对食蟹猴进行分组，每组3只。实验当天，每只食蟹猴分
别静脉注射受试药物，给药剂量为3mg/kg，10mg/kg。静脉注射体积为10ml/kg，给药速度2‑
4ml/分钟。
[0268] 给药后采血时间点为0.25h,2h,4h,8h,1d,2d,3d,4d,7d,10d,14d,21d,28d,35d。每次约取血1mL，肝素钠抗凝，冰盒暂存，2‑8℃1800g离心10分钟分装，‑70℃保存。
[0269] 用ELISA方法检测血清中的血药浓度，用Winnolin软件和EXCEL来计算受试药物的t1/2及其主要参数，结果如下：
[0270] 本发明抗体的药代动力学参数见下表14：
[0271] 表14
[0272]
[0273] 结论：本发明抗体的药代性质良好。