用于溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的多重检测的核酸、试剂盒及方法

摘要

本发明涉及一组用于同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌的核酸、试剂盒和检测方法，其中，用于多重PCR同时检测三种病原菌的核酸包括分别用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物；用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的核酸还包括有各病原菌对应的探针。本发明还建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体这三种病原的检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生。

权利要求

1.一组用于多重PCR同时检测三种病原菌的核酸，其特征在于，包括用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物，其中，所述溃疡病菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

所述褐斑病菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；

所述丛枝病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示。

2.一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的核酸，其特征在于，包括如权利要求1中所述的用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物和各病原菌对应的探针，所述溃疡病菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；

所述褐斑病菌的探针序列如SEQ ID No.7所示；

所述丛枝病植原体的探针序列如SEQ ID No.11所示。

3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的阳性扩增产物，其中，所述检测溃疡病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.4中第29-194bp之间所示的序列；

所述检测褐斑病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.8中第20-213bp之间所示的序列；

所述检测丛枝病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第2-134bp之间所示的序列。

4.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求2中所述的用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记FAM-BHQ1、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的阳性扩增产物，其中，所述检测溃疡病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.4中第29-194bp之间所示的序列；

所述检测褐斑病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.8中第20-213bp之间所示的序列；

所述检测丛枝病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第2-134bp之间所示的序列。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括Premix EX TaqTM×2。

7.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的检测方法，其特征在于，该方法用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体这三种病原菌，具体包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用所述溃疡病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和BHQ1；所述褐斑病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，其探针5'端和3'端分别对应标记JOE和TAMRA；所述丛枝病植原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和BHQ3；

(3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：

1×Premix EX TaqTM，

所述溃疡病菌上游引物、下游引物的终浓度为0.45μmol/L，探针的终浓度为0.1μmol/L；所述褐斑病菌上游引物、下游引物的终浓度为0.45μmol/L，探针的终浓度为0.1μmol/L；

所述丛枝病植原体上游引物、下游引物终浓度为0.6μmol/L，探针的终浓度为0.08μmol/L；

所述样品的DNA为1μL；

同时设置无核酸酶水为阴性对照；

同时分别设置包含如SEQ ID No.4所示的序列、SEQ ID No.8所示的序列、SEQ ID No.12所示的序列的基因作为阳性对照。

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃，5min；扩增阶段95℃，15sec；58℃，30sec；72℃，40sec，45个循环；

72℃，7min；4℃保温。

10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为

33，当Ct值≤33时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40时，无明显扩增曲线为阴性结果。

说明书

用于溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的多重检测的核酸、

试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物检测技术，具体涉及一种用于溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体多重检测的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

[0002] 苦楝(Melia azedarach)是我国重要的乡土树种之一，该树种在湿润的沃土上生长迅速，对土壤要求不严，在酸性土、中性土与石灰岩地区均能生长，是平原及低海拔丘陵区的良好造林树种，该树种也是良好的园林绿化树种的用材树种，此外也是高效、低毒的广谱植物源农药之一，苦楝产业在我国逐渐兴起。近年来，苦楝的溃疡病、褐斑病和丛枝病发病率逐渐上升，而且三者复合侵染的情况越来越多，给种植苦楝的用户造成极大损失。目前尚缺乏苦楝的溃疡病、褐斑病和丛枝病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这三种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延此外，还要加强非疫区的管理，防止这三种病害的侵入，因此，针对苦楝的溃疡病原、褐斑病和丛枝病，建立早期快速定量检测方法就显得尤为重要。

[0003] 苦楝溃疡病主要为害叶片和枝梢。叶片染病，初在叶背产生黄色或暗黄绿色油渍状小斑点，后叶面隆起，呈米黄色海绵状物。后隆起部破碎呈木栓状或病部凹陷，形成褶皱。后期病斑淡褐色，中央灰白色，并在病健部交界处形成一圈褐色釉光，凹陷部常破裂呈放射状。枝梢染病，初生圆形水渍状小点，暗绿色，后扩大灰褐色，木栓化，形成大而深的裂口，最后数个病斑融合形成黄褐色不规则形大斑，边缘明显。

[0004] 苦楝褐斑病主要危害叶片，病斑先在顶部叶片的尖端发生，最初为浅黄色，逐渐变为黄褐色或深褐色，圆形或椭圆形，小病斑常汇集在一起，严重时在叶片上出现几段甚至全部布满病斑，在叶鞘和叶脉上出现较大的褐色斑点，发病后期病斑表现破裂，叶细胞组织呈坏死状，散出褐色粉末，叶脉和维管束残存如丝状。

[0005] 苦楝丛枝病主要由类菌原体和真菌所致，枝条受害后，因顶芽生长受到抑制而刺激侧芽提前萌发成的小枝，不仅生长缓慢，且其顶芽不久也受到病原物的抑制，而刺激其侧芽再萌发成小枝。如此反复进行，使枝条呈丛生状。枝上的叶小而带黄绿色，内部栅状组织与海绵组织的分化不明显。病枝初时可开花、结果，但花果往往畸形。渐后则花而不实，最后不开花。枝丛多能存活若干年，终因累生新的枝叶，养分消耗过度而枯死。由于枝条组织较正常者柔嫩，易遭冻害。

[0006] 目前，溃疡病菌的常规检验法有典型症状目测法、组织病理切片法和病原菌分离培养及致病性测定法。常规的致病性测定法可以测定病菌的存活状态，因而可以正确评价检疫性有害生物传播扩散的危险性。但需要通过病原菌的分离培养、致病性测定来验证。但常规方法检测周期长，容易误判。分离培养对于显症样品可以取一小块病健交界处的病组织，在灭菌蒸馏水中捣碎制成菌悬液。如果看不到症状，可以取混合叶片样品，用蛋白胨磷酸缓冲液浸泡振荡在室温下富集培养6-8小时，然后将菌悬液直接或离心浓缩后在PSA或YSA培养基上划线，28℃分离2-3天后选取全缘、隆起鲜亮的淡黄色圆形小菌落。可见现有的溃疡病菌的检测方法存在有检测时间长等缺陷。

[0007] 苦楝溃疡病、褐斑病、丛枝病在广东、海南、福建江西、安徽等省的苦楝种植区均由发生，严重林段发病率达50％以上，常造成苦楝大量死亡，已经成为部分地区发展苦楝种植及成片造林的严重阻碍。针对溃疡病原、褐斑病原和丛枝病植原体的检测方法，目前尚无能够快速同时检测这三种病原菌的方法。

发明内容

[0008] (一)要解决的技术问题

[0009] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于多重PCR同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的核酸，还提供了采用多重实时荧光定量PCR检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的核酸、试剂盒及其检测方法。

[0010] (二)技术方案

[0011] 为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

[0012] 一组用于多重PCR同时检测三种病原菌的核酸，其包括用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物，其中，所述溃疡病菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

[0013] 所述褐斑病菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；

[0014] 所述丛枝病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示。

[0015] 一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的核酸，其包括如上所述溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物及各病原菌对应的探针，其中，

[0016] 所述溃疡病菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；

[0017] 所述褐斑病菌的探针序列如SEQ ID No.7所示；

[0018] 所述丛枝病植原体的探针序列如SEQ ID No.11所示。

[0019] 如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括包含检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的阳性扩增产物，其中，

[0020] 所述检测溃疡病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.4中第29-194bp之间所示的序列；

[0021] 所述检测褐斑病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.8中第20-213bp之间所示的序列；

[0022] 所述检测丛枝病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第2-134bp之间所示的序列。

[0023] 一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的试剂盒，该试剂盒包括：如权利要求2所述的溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记FAM-BHQ1、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。

[0024] 如上所述的试剂盒，优选地，还包括检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌的阳性扩增产物，其中，

[0025] 所述检测溃疡病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.4中第29-194bp之间所示的序列；

[0026] 所述检测褐斑病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.8中第20-213bp之间所示的序列；

[0027] 所述检测丛枝病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第2-134bp之间所示的序列。

[0028] 如上所述的试剂盒，优选地，还包括Premix EX TaqTM×2。

[0029] 一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的检测方法，该方法用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌，具体包括以下步骤：

[0030] (1)从样品中提取DNA；

[0031] (2)对提取的所述DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用所述溃疡病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和BHQ1；所述褐斑病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，其探针5'端和3'端分别对应标记JOE和TAMRA；所述丛枝病植原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和BHQ3；

[0032] (3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

[0033] (4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

[0034] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：

[0035] 1×Premix EX TaqTM，

[0036] 所述溃疡病菌上游引物、下游引物的终浓度为0.45μmol/L，探针的终浓度为0.1μmol/L；所述褐斑病菌上游引物、下游引物的终浓度为0.45μmol/L，探针的终浓度为0.1μmol/L；所述丛枝病植原体上游引物、下游引物终浓度为0.6μmol/L，探针的终浓度为0.08μmol/L；

[0037] 所述样品的DNA为1μL；

[0038] 同时设置无核酸酶水为阴性对照；

[0039] 同时分别设置包含如SEQ ID No.4所示的序列、SEQ ID No.8所示的序列、SEQ ID No.12所示的序列的基因作为阳性对照。

[0040] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃，5min；扩增阶段95℃，15sec；58℃，30sec；72℃，40sec，45个循环；72℃，7min；4℃保温。

[0041] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为33，当Ct值≤33时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40时，无明显扩增曲线为阴性结果。

[0042] (三)有益效果

[0043] 本发明的有益效果是：

[0044] 本发明提供了一种用于普通PCR检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌的核酸组，该组核酸可用于单一病原菌的检测，也可用于这三种病原菌同步检测的多重扩增使用。用于同步检测这三种病原菌时，经过验证，相互之间不发生交叉反应，其检测灵敏度高，特异性强。

[0045] 本发明还提供了一种用于荧光定量PCR同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌的核酸及试剂盒，同时建立了一种比较高效、灵敏的，特异性强，并可同时检测这三种病原的检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病原菌分离培养来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，成本低，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，也就减少了在操作过程的污染，避免重复操作而消耗过多的劳动力，节省时间，有效节约成本，实现了快速筛查，所用试剂盒的检测效果好，特异性强，灵敏度高。本发明提供的核酸、试剂盒及其检测方法，以解决现有技术没有能同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的技术问题，即对同一样品进行一次检测即可获得对三种病原的检测。

[0046] 提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化来获得定量的结果，不需要普通PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的筛查检测。

附图说明

[0047] 图1为同时检测三种病原菌的PCR电泳结果。

[0048] 图2为本发明荧光定量PCR同时检测三种病原菌时，检测溃疡病菌的灵敏度测试结果图；

[0049] 图3为本发明荧光定量PCR同时检测三种病原菌时，检测褐斑病菌的灵敏度测试结果图；

[0050] 图4为本发明荧光定量PCR同时检测三种病原菌时，检测丛枝病植原体的灵敏度测试结果图。

具体实施方式

[0051] 为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容，所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

[0052] 实施例1引物、探针的设计

[0053] 荧光定量PCR检测是在普通PCR检测的基础上，进一步通过特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。所以荧光定量PCR检测的前提是要进行PCR扩增反应，扩增反应之间的引物及产物需尽量避免交叉反应，再进一步保证特异性探针与各个扩增产物、引物均不应有交叉反应。又由于本发明采用的是多重荧光定量，所以探针的选择也比较关键，不仅要对软件设计出来的探针要经过筛选，三个基因的探针信号还不能相互干扰。

[0054] 首先分别筛选溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的特异目标基因，根据检测目的，对每种病原菌从GenBank下载多条病原菌基因序列，进行比对分析，选取对应检测菌种的保守序列，在保守序列上设计用于扩增的引物及适合荧光定量PCR反应体系的杂交探针。

[0055] 由于本发明是多重荧光定量，首先探针的选择比较关键，其次软件设计出来的探针要经过筛选，三个基因的探针不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑三对引物和三条探针之间都不能相互干扰。

[0056] 分别设计出溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体这三种病原菌特异的多条引物序列和杂交探针序列，并对对拟选用的探针和引物组合进行序列同源性和适配性分析评估，并通过大量的检测试验进行验证，最终选定这三种病原菌特异，且适合多重荧光定量反应体系的引物与探针组合。

[0057] 需要注意的是，设计时，普通PCR引物的设计原则并不适用荧光定量PCR引物的设计，荧光定量PCR引物的设计比普通PCR引物的设计要求苛刻，但是荧光定量PCR引物是肯定可用于普通PCR扩增反应的。

[0058] 对于每种病原菌设计的扩增引物首先要进行单个病原菌的扩增检测，确认单个病原菌扩增检测没有非特异性扩增后，再进行多重病原菌的扩增，设计的引物就需要尽量避免发生交叉反应，还要考虑扩增的条件要尽量一致，最终通过杂交反应排除交叉反应；根据上述设计、生物信息学分析和发明人的经验设计及大量实验检测试验筛选结果确定用于同时检测溃疡病菌、褐斑病菌及丛枝病植原体这三病原菌的引物及探针，如下序列：

[0059] 溃疡病菌特异的扩增引物对和探针：如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.3所示的杂交探针序列，具体如下：

[0060] SEQ IDNo.1：5′-CCACACGAATTGCTTGATTCATTG-3′

[0061] SEQ IDNo.2：5′-TGACCAACTTCACCAGGTAACTG-3′

[0062] SEQ IDNo.3：5′-CGAACTGCCGACCTCACCCTTATCA-3′

[0063] 褐斑病菌特异的扩增引物对和探针：如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.7所示的特异探针序列，具体如下：

[0064] SEQ IDNo.5：5′-TCGCACTCTCTATCAGCAAAGG-3′

[0065] SEQ IDNo.6：5′-CGGACTCTAAAAGAGCCAGATTTC-3′

[0066] SEQ IDNo.7：5′-TGTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3′；

[0067] 丛枝病植原体特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示的特异扩增上下游引物，以及如SEQ ID No.11所示的杂交探针序列，具体如下：

[0068] SEQ IDNo.9：5′-TGGTCTAAGTGCAATGCTCAAC-3′

[0069] SEQ IDNo.10：5′-CCGCCTTCGCTACTGGTGTTCC-3′

[0070] SEQ IDNo.11：5′-TTGCCTCTATCTTACTCTA-3′。

[0071] 本发明中，探针的设计尤为关键，探针可以在引物扩增的片段之间进行选择，首先，探针自身不可形成引物二聚体，否则会导致假阴性检测结果，其次，用于多重病原菌进行检测时，进行多重检测的片段及引物之间不可有交叉反应，否则会导致假阳性或假阴性结果。设计探针时要使每种病原体探针的报告基团的荧光发射最大波长处于不同的光谱范围，以确保荧光定量PCR仪的检测通道能区分每种病原体的探针。所以设计中，除了用primer select软件进行评估，确保理论上的尽可能符合多重反应以外，还应根据反应的扩增曲线进行引物和探针浓度的适当调整，直至扩增出最佳扩增曲线。

[0072] 本发明选用的FAM、JOE、CY5三种荧光染料，用来标记探针，其波长处于不同光谱范围，相互间不能干扰，具有明显的区分效果和信号强度。

[0073] 经大量实验验证，采用上述引物、探针时，可单独用于检测各对应的病原菌的检测，其探针的5′端和3′端分别可选用标记FAM-BHQ1、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。但进行同时检测三种病原菌时，各探针标记则应对应标记这三种组合关系，也就是说采用FAM-BHQ1、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3分别标记溃疡病菌的探针，褐斑病菌的探针，丛枝病植原体的探针，各探针5′端和3′端标记的荧光基团是不重合的，但是可随意进行组合，检测结果不受影响，当然单独一个病原菌进行检测时，探针也可选用其它荧光基团如VIC、NED和Texred等作为发光基团，使用如BHQ、MGB和BHQ2等作为荧光淬灭基团。

[0074] 实施例2普通PCR检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌[0075] 根据实施例1筛选的溃疡病菌在GenBank中序列号为AY342165中的保守序列，其筛选的保守序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，在此保守序列中设计的引物和探针。并确定溃疡病菌引物扩增片段大小为166bp，扩增序列为如SEQ IDNo.4所示第29-194bp之间的序列。

[0076] SEQ IDNo.4：ATCGACGACTCAGCTGCACCATAAGCACCCACACGAATTGCTTGATTCATTGAAGAAGACGATGAGAAGCAGCTTTTGCTTTGCACACCCGATTTTGGGTCTGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGGCAGTTCGAATCTGCCCAGACCCACCAGTTACCTGGTGAAGTTGGTCAGAGCGCGT。

[0077] 褐斑病菌选用GenBank中序列号为AY154712，筛选的保守序列其核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示，在此序列中设计的引物和探针，引物扩增片段大小为194bp，扩增序列为如SEQ IDNo.8所示的第20-213bp之间的序列。

[0078] SEQ ID No.8：TTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTTAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTACGTGGTCGCTGGCT。

[0079] 丛枝病植原体选用GenBank中序列号为EF990733，筛选的保守序列如SEQ IDNo.12所示，在此序列中设计的引物和探针，引物扩增片段大小为132bp，其核苷酸序列如SEQ IDNo.12所示的第2-134bp的片段。

[0080] SEQ IDNo.12：TATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAA。

[0081] 对实施例1中的引物及上述扩增片段进行合成，获得引物及携带有如序列SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12所示序列的阳性质粒DNA。

[0082] 利用引物和阳性质粒DNA并进行普通PCR扩增，采用宝生物工程(大连)有限公司公司的Premix EX TaqTM×2，25μL反应体系：各上下游引物(10μM)0.5μL；Premix EX TaqTM×2 12.5μL；各阳性质粒DNA模板1μL，其余用无核酸酶水补足。

[0083] PCR扩增反应条件优选为：

[0084] 反应条件：预变性阶段95℃，4min；扩增阶段94℃，25sec；58℃，30sec；72℃，45min，30个循环；72℃，7min；4℃保温。

[0085] 对扩增产物进行电泳，如图1所示，图中，B为空白对照、1为溃疡病菌、2为褐斑病菌、3为丛枝病植原体的扩增结果，M为DNA Marker。结果显示，所设计的引物可有效扩增出对应的溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的阳性条带。

[0086] 实施例3三种病原菌荧光定量PCR检测试剂盒

[0087] 溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌的荧光定量PCR检测试剂盒包括以下成分：

[0088] Premix EX TaqTM×2；

[0089] 溃疡病菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示，探针SEQ IDNo.3的5′标记FAM，3′标记BHQ1；

[0090] 褐斑病菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示，探针序列如SEQ ID No.7所示其中，探针SEQ IDNo.7的5′标记JOE，3′标记TAMRA；

[0091] 丛枝病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示，探针序列如SEQ ID No.11所示，其中，探针SEQ IDNo.11的5′标记CY5，3′标记BHQ3。

[0092] 进一步，为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有作为阳性对照及阴性对照试剂，阴性对照采用无核酸酶水；

[0093] 阳性对照采用携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12所示。

[0094] 阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

[0095] 其中，所述Premix EX TaqTM×2、无核酸酶水可购自宝生物工程(大连)有限公司；引物、探针、质粒可委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

[0096] 实施例4同时检测三种病原菌荧光定量PCR的方法

[0097] 采用荧光定量PCR同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌的方法包括以下步骤：

[0098] (1)病原菌DNA提取

[0099] 所用的试剂有：液氮，CTAB抽提缓冲液：2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，1％β-巯基乙醇1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl pH8.0，3M NaAC，50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA，氯仿：异戊醇(24:1)，异丙醇，70％乙醇，TE buffer。

[0100] 提取步DNA的方法，步骤如下：将苦楝植物材料剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中；加入液氮速冷，研磨成细粉(越细越好)；在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5mL，60℃保温1小时；15 000rpm，离心10分钟；上清转入另一个新的离心管中；加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀抽提至水乳胶融状；15 000rpm，离心10分钟；上清转入另一个新的离心管中；加入2/3倍体积预冷异丙醇，-20℃保温30min，缓缓混匀DNA成絮状折出；15 000rpm，离心10分钟，弃上清；DNA沉淀用70％乙醇洗2次；加入400μl TE buffer溶解DNA。

[0101] (2)荧光定量PCR扩增

[0102] 采用实施例3制备的试剂盒配置反应体系，采用25μL反应体系：溃疡病菌、褐斑病菌的上下游引物终浓度为0.45μmol/L，探针浓度为0.1μmol/L和丛枝病植原体的上下游引物终浓度为0.60μmol/L，探针终浓度为0.08μmol/L，Premix EX TaqTM×2加入12.5μL，每个样品提取的DNA量加入1μL。

[0103] 设置阳性对照时，分别采用含有各病原菌的阳性扩增序列的质粒替换样本DNA，设置阴性对照时，采用无核酸酶水替换样本DNA。

[0104] 扩增条件：优选以下扩增条件：

[0105] 预变性阶段95℃，5min；扩增阶段95℃，15sec；58℃，30sec；72℃，40s，45个循环；72℃，7min；4℃保温。

[0106] (3)收集荧光信号，分别选择FAM、JOE、Cy5的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

[0107] (4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性，具体本实施例中，阈值为33，当Ct值≤33，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40无明显扩增曲线为阴性结果。

[0108] 实施例5本发明试剂盒灵敏度的检测

[0109] 将溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的质粒DNA，经测定，其浓度分别为0.23ng/μL、0.18ng/μL、0.26ng/μL，按10倍比进行稀释后，即获得的溃疡病菌DNA的浓度分别为2.3×10-2ng/μL、2.3×10-3ng/μL、2.3×10-4ng/μL、2.3×10-5ng/μL、2.3×10-6ng/μL；褐斑病菌DNA的浓度分别为1.8×10-2ng/μL、1.8×10-3ng/μL、1.8×10-4ng/μL、1.8×10-5ng/μL、1.8×10-6ng/μL，丛枝病植原体DNA的浓度分别为2.6×10-2ng/μL、2.6×10-3ng/μL、2.6×10-4ng/μL、2.6×10-5ng/μL、2.6×10-6ng/μL。利用实施例3制备的试剂盒分别对上述不同浓度的DNA模板进行溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体这三种病原菌的检测，其中，

[0110] 1)NTC：无核酸酶水；

[0111] 反应体系采用25μL反应体系，由12.5μL Premix EX TaqTM×2，溃疡病菌、褐斑病菌的上下游引物(20μM)均为0.56μL和丛枝病植原体的上下游引物(20μM)均为0.75μL；溃疡病菌、褐斑病菌的探针(20μM)各为0.125μL，丛枝病植原体的探针(20μM)为0.1μL，样品DNA的量1μL。样本DNA采用上述稀释后的阳性模板进行检测，优选扩增条件：95℃-5min；95℃-15s，58℃-30s；72℃，40sec，45个循环；72℃，7min；4℃保温。实时荧光定量PCR检测在ABI7500 PCR仪上进行。

[0112] 2)每个梯度做三个平行样。

[0113] 结果判定：Ct值≤33有明显扩增曲线为阳性结果，Ct值＞40无明显扩增曲线为阴性结果。

[0114] 检测结果的荧光值图，其中，溃疡病菌的灵敏度测试结果如图2所示，图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为2.3×10-2ng/μL、2.3×10-3ng/μL、2.3×10-4ng/μL、2.3×10-5ng/μL、2.3×10-6ng/μL的溃疡病菌DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为2.3-6
×10 ng/μL的溃疡病菌DNA都可以检出。褐斑病菌的灵敏度测试结果如图3所示，图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为1.8×10-2ng/μL、1.8×10-3ng/μL、1.8×10-4ng/μL、1.8×
10-5ng/μL、1.8×10-6ng/μL的褐斑病菌DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为
1.8×10-6ng/μL的褐斑病菌DNA都可以检出。丛枝病植原体的灵敏度测试结果如图4所示。图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为2.6×10-2ng/μL、2.6×10-3ng/μL、2.6×10-4ng/μL、
2.6×10-5ng/μL、2.6×10-6ng/μL的丛枝病植原体DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为2.6×10-6ng/μL的丛枝病植原体DNA都可以检出。可见本发明方法检测溃疡病菌、褐斑病菌、丛枝病植原体的灵敏度分别为2.3×10-6ng/μL、1.8×10-6ng/μL、2.6×10-6ng/μL。

[0115] 实施例6本发明试剂盒的特异性

[0116] 利用本发明的试剂盒对黄曲霉(cfcc 84919)、尖孢镰刀菌(cfcc 89008)、细极链格孢(cfcc 84543)，盘长孢状刺盘孢(cfcc 82273)，枯草芽胞杆菌(cfcc 14476)、黄曲霉(CICC 2090)、蜡状芽孢杆菌(cfcc2692)、绿木霉(CICC2535)、白假丝酵母(cfcc 3529)进行了检测。

[0117] 上述菌种可通过商购获得，将上述菌种活化培养后，取菌液进行提取DNA。将提取DNA进行实施例4所述方法进行检测。检测结果表明，上述菌种均没有扩增曲线，检测结果为阴性，即表明本发明设计的引物、探针具有特异性，没有非特异性扩增，特异性强。

[0118] 实施例7：利用本发明试剂盒对样品进行检测

[0119] 采集表现为典型丛枝症状、溃疡病症状、褐斑病症状和健康苦楝样品，均采自山东青岛地区，其中溃疡病症状有13个样品，溃疡病症状9个样品、典型丛枝症状的有15个。

[0120] 对上述样品进行提取DNA，可采用如实施例4提取DNA的方法进行，并采用本发明的试剂盒对提取的DNA进行检测。用实施例4所述的荧光定量方法进行检测，结果显示，溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体症状的样品都有明显示扩增曲线，结果都呈阳性，说明该检测方法对样品的检测具有很好的适用性，该检测在ABI7500荧光定量PCR仪进行，检测准确率达100％。

[0121] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。