一种大株红景天胶囊指纹图谱及其构建方法转让专利
申请号 : CN201610490030.4
文献号 : CN107543889B
文献日 : 2019-02-22
发明人 : 萧伟 , 耿婷 , 刘光大 , 李艳静 , 黄文哲 , 王振中 , 赵祎武
申请人 : 江苏康缘药业股份有限公司
摘要 :
本发明提供了一种大株红景天胶囊指纹图谱及其构建方法，本发明提供的大株红景天胶囊指纹图谱的构建方法，通过在高效液相检测时采用流动相为甲醇和0.1vol％甲酸水溶液，并且以得到的液相色谱中的10号峰红景天苷作为内参物，得到指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积，该数据能够真实的反应大株红景天中的组成成分，并能够全面有效的评价大株红景天以及大株红景天胶囊的质量。
权利要求 :
1.一种大株红景天胶囊指纹图谱的建立方法，包括：
将大株红景天胶囊制备的供试品溶液通过高效液相色谱检测，并以10号峰红景天苷作为内参物，得到大株红景天胶囊指纹图谱；
以没食子酸、5-羟甲基糠醛、rhodiocyanoside A、3，4-二羟基苯甲酸、云杉苷、红景天苷、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷、酪醇、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯、岩白菜素、对羟基苯乙酸、丁香酸、6″-O-galloylsalidroside、草质素、草质素苷、红景天素、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷作为对照品；
其中，色谱柱为Agilent Eclipse Plus-C18；
所述检测的流动相为甲醇和0.1vol％甲酸水溶液；
所述流动相的洗脱为梯度洗脱；所述梯度洗脱中，以甲醇作为A相，以0.1vol％甲酸水溶液作为B相，洗脱程序为：0～10min，10～15％A；10～20min，15～25％A；20～30min，25～
40％A；30～60min，40～60％A。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述检测的流速为0.8～1.2mL/min。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述检测的波长为270～280nm。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述将大株红景天胶囊制备的供试品溶液按照以下方法制备得到：将大株红景天胶囊内容物溶于75vol％甲醇水溶液中，超声处理，得到供试品溶液。
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述大株红景天胶囊内容物与所述甲醇水溶液的用量比为1g：(20～30)mL。
6.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述超声处理的时间为50～70min。
7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，以红景天苷作为内参物，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间为0.29±0.01、0.34±0.02、0.37±
0.02、0.40±0.02、0.48±0.02、0.59±0.03、0.67±0.03、0.91±0.05、0.94±0.05、1.04±
0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、1.59±0.08、1.78±0.09、1.95±0.10、2.31±0.12、2.34±
0.12、2.64±0.13、2.70±0.14、2.82±0.14。
8.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，以红景天苷作为内参物，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它峰的相对峰面积为0.49±0.10、0.56±0.11、17.39±3.48、1.42±0.28、0.92±0.18、0.32±0.06、0.19±0.06、0.18±0.05、0.60±0.12、0.72±0.14、0.39±0.08、0.31±0.06、0.18±0.05、0.61±0.12、0.81±0.16、0.11±0.03、0.10±0.03、0.33±0.07、0.29±0.06、1.41±0.28。
9.根据权利要求7所述的建立方法，其特征在于，相对出峰时间为0.37±0.02、0.48±
0.02、0.67±0.03、0.91±0.05、0.94±0.05、1.00、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、
1.78±0.09、2.64±0.13、2.82±0.14时对应的化合物依次为没食子酸、5-羟甲基糠醛、3，
4-二羟基苯甲酸、没食子酸-3-甲基醚、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、酪醇、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯和岩白菜素、6″-O-galloylsalidroside(6″-氧-没食子酰基红景天甙)、草质素、草质素苷和红景天素。
说明书 :
一种大株红景天胶囊指纹图谱及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明中药分析领域，尤其涉及一种大株红景天胶囊指纹图谱及其构建方法。
背景技术
[0002] 中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制和评价中药材或中成药的质量具有重要的意义。
[0003] 大株红景天胶囊由单味药材大株红景天Rhodiola kirilowii(Regel.)Maxim提取、精制而成，具有活血化瘀，通脉止痛的功效，主要用于治疗冠心病、心绞痛等心血瘀阻证，临床疗效显著。目前研究多将红景天苷等少数几个成分作为评价红景天属植物及相关制剂质量的主要指标，大株红景天胶囊现行质量标准也主要通过控制红景天苷的含量来对其进行质量评价及控制，存在一定的局限性。因此，为了更好地反映大株红景天胶囊的内在质量，建立大株红景天胶囊的指纹图谱是非常必要的。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种大株红景天胶囊指纹图谱及其构建方法，本发明提供的指纹图谱能够全面、有效的评价大株红景天胶囊的质量。
[0005] 本发明提供了一种大株红景天胶囊指纹图谱，其特征在于，以红景天苷作为内参物，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间为0.29±0.01、0.34±0.02、0.37±0.02、0.40±0.02、0.48±0.02、0.59±0.03、0.67±0.03、0.91±0.05、0.94±
0.05、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、1.59±0.08、1.78±0.09、1.95±0.10、2.31±
0.12、2.34±0.12、2.64±0.13、2.70±0.14、2.82±0.14。
0.05、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、1.59±0.08、1.78±0.09、1.95±0.10、2.31±
0.12、2.34±0.12、2.64±0.13、2.70±0.14、2.82±0.14。
[0006] 优选的，以红景天苷作为内参物，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它峰的相对峰面积为0.49±0.10、0.56±0.11、17.39±3.48、1.42±0.28、0.92±0.18、0.32±0.06、0.19±0.06、0.18±0.05、0.60±0.12、0.72±0.14、0.39±0.08、0.31±0.06、0.18±0.05、
0.61±0.12、0.81±0.16、0.11±0.03、0.10±0.03、0.33±0.07、0.29±0.06、1.41±0.28。
0.61±0.12、0.81±0.16、0.11±0.03、0.10±0.03、0.33±0.07、0.29±0.06、1.41±0.28。
[0007] 本发明还提供了一种大株红景天胶囊指纹图谱的建立方法，包括：
[0008] 将大株红景天胶囊制备的供试品溶液通过高效液相色谱检测，并以10号峰红景天苷作为内参物，得到大株红景天胶囊指纹图谱；
[0009] 其中，所述检测的流动相为甲醇和0.1vol％甲酸水溶液。
[0010] 优选的，所述相对出峰时间为0.37±0.02、0.48±0.02、0.67±0.03、0.91±0.05、0.94±0.05、1.00、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、1.78±0.09、2.64±0.13、2.82±
0.14时对应的化合物依次为没食子酸、5-羟甲基糠醛、3，4-二羟基苯甲酸、没食子酸-3-甲基醚、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、酪醇、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯和岩白菜素、6″-O-galloylsalidroside(6″-氧-没食子酰基红景天甙),、草质素、草质素苷和红景天素。
0.14时对应的化合物依次为没食子酸、5-羟甲基糠醛、3，4-二羟基苯甲酸、没食子酸-3-甲基醚、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、酪醇、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯和岩白菜素、6″-O-galloylsalidroside(6″-氧-没食子酰基红景天甙),、草质素、草质素苷和红景天素。
[0011] 优选的，所述流动相的洗脱为梯度洗脱；所述梯度洗脱中，以甲醇作为A相，以0.1vol％甲酸水溶液作为B相，洗脱程序为：0～10min，10～15％A；10～20min，15～25％A；
20～30min，25～40％A；30～60min，40～60％A。
20～30min，25～40％A；30～60min，40～60％A。
[0012] 优选的，所述检测的流速为0.8～1.2mL/min。
[0013] 优选的，所述检测的波长为270～280nm。
[0014] 优选的，所述将大株红景天胶囊制备的供试品溶液按照以下方法制备得到：
[0015] 将大株红景天胶囊内容物溶于70～80vol％乙醇水溶液中，超声处理，得到供试品溶液。
[0016] 优选的，所述大株红景天胶囊内容物与所述乙醇水溶液的用量比为1g：(20～30)mL。
[0017] 优选的，所述超声处理的时间为50～70min。
[0018] 与现有技术相比，本发明提供了一种大株红景天胶囊指纹图谱及其构建方法，本发明提供的指纹图谱通过选择以红景天苷作为内参物，即使其相对保留时间为1.00，进而确定指纹图谱中其它20个共有峰的相对保留时间为0.29±0.01、0.34±0.02、0.37±0.02、0.40±0.02、0.48±0.02、0.59±0.03、0.67±0.03、0.91±0.05、0.94±0.05、1.04±0.05、
1.07±0.05、1.12±0.06、1.59±0.08、1.78±0.09、1.95±0.10、2.31±0.12、2.34±0.12、
2.64±0.13、2.70±0.14、2.82±0.14；使得到的指纹图谱能够全面有效的评价大株红景天以及大株红景天胶囊的质量。
1.07±0.05、1.12±0.06、1.59±0.08、1.78±0.09、1.95±0.10、2.31±0.12、2.34±0.12、
2.64±0.13、2.70±0.14、2.82±0.14；使得到的指纹图谱能够全面有效的评价大株红景天以及大株红景天胶囊的质量。
[0019] 本发明提供的大株红景天胶囊指纹图谱的构建方法，通过在高效液相检测时采用流动相为甲醇和0.1vol％甲酸水溶液，并且以得到的液相色谱中的10号峰红景天苷作为内参物，使得到的大株红景天胶囊指纹图谱能够真实的反应大株红景天中的组成成分，能够全面有效的评价大株红景天以及大株红景天胶囊的质量。
附图说明
[0020] 图1为本发明提供的10批大株红景天胶囊供试样品的HPLC-UV图；
[0021] 图2为大株红景天胶囊标准指纹图谱；
[0022] 图3为大株红景天胶囊正负离子模式下的TIC；
[0023] 图4供试品溶液和混合标准品溶液色谱图。
具体实施方式
[0024] 本发明提供了一种大株红景天胶囊指纹图谱，其特征在于，以红景天苷作为内参物，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间优选为0.29±0.01、0.34±0.02、0.37±0.02、0.40±0.02、0.48±0.02、0.59±0.03、0.67±0.03、0.91±0.05、
0.94±0.05、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、1.59±0.08、1.78±0.09、1.95±0.10、
2.31±0.12、2.34±0.12、2.64±0.13、2.70±0.14、2.82±0.14；更优选为0.29、0.34、
0.37、0.40、0.48、0.59、0.67、0.91、0.94、1.04、1.07、1.12、1.59、1.78、1.95、2.31、2.34、
2.64、2.70、2.82。以红景天苷作为内参物，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它峰的相对峰面积优选为0.49±0.10、0.56±0.11、17.39±3.48、1.42±0.28、0.92±0.18、0.32±
0.06、0.19±0.06、0.18±0.05、0.60±0.12、0.72±0.14、0.39±0.08、0.31±0.06、0.18±
0.05、0.61±0.12、0.81±0.16、0.11±0.03、0.10±0.03、0.33±0.07、0.29±0.06、1.41±
0.28；更优选为0.49、0.56、17.39、1.42、0.92、0.32、0.19、0.18、0.6、0.72、0.39、0.31、
0.18、0.61、0.81、0.11、0.1、0.33、0.29、1.41。所述相对出峰时间为0.37±0.02、0.48±
0.02、0.67±0.03、0.91±0.05、0.94±0.05、1.00、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、
1.78±0.09、2.64±0.13、2.82±0.14时对应的化合物依次为没食子酸、5-羟甲基糠醛、3，
4-二羟基苯甲酸、没食子酸-3-甲基醚、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、酪醇、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯和岩白菜素、6″-O-galloylsalidroside(6″-氧-没食子酰基红景天甙)、草质素、草质素苷和红景天素。
0.94±0.05、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、1.59±0.08、1.78±0.09、1.95±0.10、
2.31±0.12、2.34±0.12、2.64±0.13、2.70±0.14、2.82±0.14；更优选为0.29、0.34、
0.37、0.40、0.48、0.59、0.67、0.91、0.94、1.04、1.07、1.12、1.59、1.78、1.95、2.31、2.34、
2.64、2.70、2.82。以红景天苷作为内参物，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它峰的相对峰面积优选为0.49±0.10、0.56±0.11、17.39±3.48、1.42±0.28、0.92±0.18、0.32±
0.06、0.19±0.06、0.18±0.05、0.60±0.12、0.72±0.14、0.39±0.08、0.31±0.06、0.18±
0.05、0.61±0.12、0.81±0.16、0.11±0.03、0.10±0.03、0.33±0.07、0.29±0.06、1.41±
0.28；更优选为0.49、0.56、17.39、1.42、0.92、0.32、0.19、0.18、0.6、0.72、0.39、0.31、
0.18、0.61、0.81、0.11、0.1、0.33、0.29、1.41。所述相对出峰时间为0.37±0.02、0.48±
0.02、0.67±0.03、0.91±0.05、0.94±0.05、1.00、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、
1.78±0.09、2.64±0.13、2.82±0.14时对应的化合物依次为没食子酸、5-羟甲基糠醛、3，
4-二羟基苯甲酸、没食子酸-3-甲基醚、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、酪醇、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯和岩白菜素、6″-O-galloylsalidroside(6″-氧-没食子酰基红景天甙)、草质素、草质素苷和红景天素。
[0025] 本发明提供了一种大株红景天胶囊指纹图谱及其构建方法，本发明提供的指纹图谱通过选择以红景天苷作为内参物，即使其相对保留时间为1.00，进而确定指纹图谱中其它20个共有峰的相对保留时间为0.29±0.01、0.34±0.02、0.37±0.02、0.40±0.02、0.48±0.02、0.59±0.03、0.67±0.03、0.91±0.05、0.94±0.05、1.04±0.05、1.07±0.05、1.12±0.06、1.59±0.08、1.78±0.09、1.95±0.10、2.31±0.12、2.34±0.12、2.64±0.13、2.70±0.14、2.82±0.14；使得到的指纹图谱能够全面有效的对大株红景天以及大株红景天胶囊的质量控制。
[0026] 本发明还提供了一种大株红景天胶囊指纹图谱的建立方法，包括：
[0027] 将大株红景天胶囊制备的供试品溶液通过高效液相色谱检测，并以10号峰红景天苷作为内参物，得到大株红景天胶囊指纹图谱；
[0028] 其中，所述检测的流动相为甲醇和0.1vol％甲酸水溶液。
[0029] 按照本发明，将大株红景天胶囊制备的供试品溶液通过高效液相色谱检测，并以10号峰红景天苷作为内参物，得到大株红景天胶囊指纹图谱；其中，所述色谱柱为Agilent Eclipse Plus-C18，所述流动相的洗脱优选为梯度洗脱，所述梯度洗脱中，以甲醇作为A相，以0.1vol％甲酸水溶液作为B相，洗脱程序为：0～10min，10～15％A；10～20min，15～25％A；20～30min，25～40％A；30～60min，40～60％A；所述检测的流速为0.8～1.2mL/min，更优选为1～1.1mL/min；所述检测的波长优选为270～280nm，更优选为275～276nm；本发明对选择波长时选用的仪器并没有特殊要求，优选为DAD检测器；所述检测的柱温优选为30～40℃，更优选为35～36℃。
[0030] 其中，洗脱程序中，％A指的是体积比，如10～15％A是指每100mL洗脱剂中含有10～15mL的A。
[0031] 本发明中，所述将大株红景天胶囊制备的供试品溶液按照以下方法制备得到：
[0032] 将大株红景天胶囊内容物溶于70～80vol％乙醇水溶液中，超声处理，得到供试品溶液。其中，所述乙醇水溶液的浓度优选为75～76vol％；所述大株红景天胶囊内容物与所述乙醇水溶液的用量比优选为1g：(20～30)mL，更优选为1g：(25～28)mL；所述超声处理的时间优选为50～70min，更优选为60～65min。
[0033] 此外，本发明中，本发明还通过使用对照品以及采用高效液相质谱联仪(HPLC/Q-TOF MS)对指纹图谱中的共有峰进行了定性分析，以研究药品中活性成分化学结构，确定了21个共有峰的分子式，结合对照品及质谱信息对其中12个色谱峰进行结构推断，其中，以10号峰红景天苷作为内参物，其相对保留时间为1.00，确定了指纹图谱中其它20个共有峰的相对保留时间为0.29、0.34、0.37、0.40、0.48、0.59、0.67、0.91、0.94、1.04、1.07、1.12、
1.59、1.78、1.95、2.31、2.34、2.64、2.70、2.82。其中，得到的已知化合物为没食子酸(3号峰)、5-羟甲基糠醛(5号峰)、3，4-二羟基苯甲酸(7号峰)、没食子酸-3-甲基醚(8号峰)、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷(9号峰)、红景天苷(10号峰)、酪醇(11号峰)、对羟基苯甲酸(12号峰)、没食子酸甲酯和岩白菜素(13号峰，共流出峰)、6″-O-galloylsalidroside(6″-氧-没食子酰基红景天甙)(15号峰)、草质素(19号峰)、草质素苷和红景天素(21号峰，共流出峰)。
1.59、1.78、1.95、2.31、2.34、2.64、2.70、2.82。其中，得到的已知化合物为没食子酸(3号峰)、5-羟甲基糠醛(5号峰)、3，4-二羟基苯甲酸(7号峰)、没食子酸-3-甲基醚(8号峰)、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷(9号峰)、红景天苷(10号峰)、酪醇(11号峰)、对羟基苯甲酸(12号峰)、没食子酸甲酯和岩白菜素(13号峰，共流出峰)、6″-O-galloylsalidroside(6″-氧-没食子酰基红景天甙)(15号峰)、草质素(19号峰)、草质素苷和红景天素(21号峰，共流出峰)。
[0034] 本发明提供的大株红景天胶囊指纹图谱的构建方法，通过在高效液相检测时采用流动相为甲醇和0.1vol％甲酸水溶液，并且以得到的液相色谱中的10号峰红景天苷作为内参物，使得到的大株红景天胶囊指纹图谱能够真实的反应大株红景天中的组成成分，能够全面有效的评价大株红景天以及大株红景天胶囊的质量。此外，本发明综合应用HPLC-DAD结合HPLC/Q-TOF MS得到指纹图谱，可以有效的实现对药物的定性和定量分析，对评价中药质量，确保药品疗效具有深远的意义。
[0035] 下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036] 实施例
[0037] 1材料
[0038] 1.1仪器
[0039] Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent 1290-6538超高效液相色谱-质谱联用仪(Agilent Technologies,Germany)；ST-16R型高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；AL104型万分之一天平，MettlerXS205型十万分之一天平(梅特勒-托利多上海仪器有限公司)；KH2200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；HSC-24A型氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；Mill-Q纯水系统(Millipore，USA)
[0040] 1.2试剂
[0041] 甲醇(色谱纯，Merck，USA)，乙腈(色谱纯，Merck，USA)，甲酸(Merck，德国)，其它试剂均为分析纯，购于南京化学试剂有限公司；超纯水。
[0042] 1.3对照品
[0043] 对照品没食子酸、5-羟甲基糠醛、rhodiocyanoside A、3，4-二羟基苯甲酸、云杉苷、红景天苷、对羟基苯丙烯酸4-O-β-D-葡萄糖苷、酪醇、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯、岩白菜素、对羟基苯乙酸、丁香酸、6″-O-galloylsalidroside、草质素、草质素苷、红景天素、山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，对照品均由江苏康缘药业股份有限公司分离纯化得到，批号20150820，各个对照品采用LC-MS测定纯度均大于98％。
[0044] 1.4样品
[0045] 大株红景天胶囊共10批，均由江苏康缘药业股份有限公司生产，批号分别为：150301、150302、150303、150304、150305、150306、150307、150308、150309、150310。
[0046] 2方法与结果
[0047] 2.1检测条件
[0048] 2.1.1色谱条件
[0049] 2.1.1.1检测波长选择
[0050] 本发明采用DAD检测器分别考察了样品在220nm、254nm、276nm、320nm、365nm下的HPLC图，其中220nm和276nm下体现的色谱峰数目最多，所表征的大株红景天胶囊中化学成分种类最全，但考虑到276nm下基线较平稳且各指纹峰均有较大的吸收。因此，本研究采用276nm作为大株红景天胶囊指纹图谱研究的检测波长。
[0051] 2.1.1.2具体测试条件
[0052] 色谱柱为Agilent Eclipse Plus-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，按以下程序梯度洗脱：0～10min，10～15％A；10～20min，15～25％A；20～30min，25～40％A；30～60min，40～60％A。柱温：35℃；流速：1.0mL/min；检测波长：276nm。
[0053] 2.1.2质谱条件
[0054] ESI离子源，正、负离子模式检测。干燥气流速，10.0L/min；干燥气温度，350℃；雾化压力，60psig；skimmer，65V；OCT1RF Vpp，750V；毛细管电压，正离子模式4000V、负离子模式3500V；裂解电压，135V；离子扫描范围设置为m/z 100～1000；进样量：2μL。数据采集及处理分别采用Agilent MassHunter Acquisition Software Version A.01.00及Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.04.00分析软件。
[0055] 2.2溶液的配制
[0056] 2.2.1供试品溶液的配制
[0057] 本研究考察了样品的提取方式(回流和超声)、提取溶剂(纯水、25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、100％甲醇)、提取时间(20min、40min、60min和80min)以及溶剂用量(10mL、25mL和50mL)，综合不同条件下提取溶液的色谱峰种类和峰面积等信息，确定样品的最佳前处理方法，具体为：
[0058] 取本品内容物，混匀，研细，取约l g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入75％的甲醇25mL，称定重量，超声处理1h，放冷，用75％的甲醇补足失重，14 000rpm/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。
[0059] 2.2.2对照品溶液的配制
[0060] 分别精密称量各对照品适量，配制成终浓度为0.5～1mg/mL的混合对照品溶液。根据质谱响应值稀释到合适的浓度进样分析。
[0061] 2.3 HPLC-UV指纹图谱分析
[0062] 2.3.1精密度考察
[0063] 按2.2.1项下制备供试品溶液一份，按2.1.1.2项下条件连续测定6次，考察各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD。结果表明各共有峰相对保留时间的RSD<0.06％，相对峰面积的RSD<1.8％，色谱图相似度>0.99，说明仪器精密度良好。
[0064] 2.3.2稳定性考察
[0065] 按2.2.1项下制备供试品溶液一份，按2.1.1.2项下条件，分别在0、2、4、8、12、16、24h测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明各共有峰相对保留时间的RSD<0.06％，除峰19外，相对峰面积的RSD<2.0％，色谱图相似度>0.99，而色谱峰19随着放置时间延长含量有明显下降趋势，24h内下降超过了一半，但在8h内基本稳定，相对峰面积RSD为1.9％。为保证数据的准确性，所有样品检测均应在供试品溶液制备后8h内完成。
[0066] 2.3.3重复性考察
[0067] 按照2.2.1项下平行处理同一批次样品6份。按2.1.1.2项下条件分别测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明各共有峰相对保留时间的RSD<0.05％，相对峰面积的RSD<2.0，色谱图相似度>0.99，说明该方法重复性良好。
[0068] 2.3.4样品检测及分析
[0069] 分别取10批大株红景天胶囊样品，按2.2.1项下方法制备，按2.1.1.2项下色谱条件分别测定，进样量：5μL。记录其HPLC-UV图，如图1所示，图1为本发明提供的10批大株红景天胶囊供试样品的HPLC-UV图；根据10批样品色谱图中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，选取其中21个共有峰作为特征指纹峰(标记为1-21)，并选择红景天苷(10号峰)作为参照峰(s)。将10批样品色谱图导入由国家药典委员会主持开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004A”中，采用中位数法生成标准指纹图谱，如图2所示，图2为大株红景天胶囊标准指纹图谱。以大株红景天胶囊标准指纹图谱为参照，计算每批成品指纹图谱的相似度，由于3号指纹峰峰面积过大，可能会影响相似度结果，本研究分别评价了扣除3号指纹峰前后10批样品相似度，结果如表1所示，表1为10批样品的相似度结果；
[0070] 表1 10批样品相似度
[0071]
[0072]
[0073] 2.4特征指纹峰的定性分析
[0074] 按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1.1.2项下色谱条件，2.1.3项下质谱条件对大株红景天胶囊的21个特征指纹峰进行指认，进样量：2μL，色谱图如图3所示。图3为大株红景天胶囊正负离子模式下的TIC，其中，(A)负离子模式下的TIC图；(B)正离子模式下的TIC图；通过与对照品的质谱信息和保留时间等比对，最终确定了21个指纹峰中13个化合物的化学结构，其中13号色谱峰为没食子酸甲酯和岩白菜素的共流出峰，21号峰为草质素苷和红景天素的共流出峰，色谱图如所示图4，图4供试品溶液和混合标准品溶液色谱图。其中，A：供试品；B：混合对照品；各色谱峰指认结果如表2所示，表2大株红景天胶囊色谱峰指认结果；色谱条件优化时采用不同柱温、流速和不同梯度等，两组色谱峰均包埋较好，且方法学考察符合要求。
[0075] 表2大株红景天胶囊色谱峰指认结果
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080] 注：“a”经对照品验证；“-”未鉴别出。
[0081] 3讨论
[0082] 由于3号指纹峰没食子酸峰面积过大、占总峰面积的54％，考虑到可能会对整体相似度评价结果产生一定影响，因此在第一次相似度评价结果的基础上扣除3号峰后又对10批样品进行了评价，结果表明，10批样品的相似度均发生了一定变化，但各批号样品相似度均大于0.940，这表明进行相似度评价时应先扣除峰面积较大的色谱峰，以降低评价结果的偏差；同时从10批样品的检测结果可以看出，本产品不同批次间差异较小，生产工艺较为稳定。
[0083] 4、大株红景天胶囊供试品指纹图谱
[0084] 以图4所示的色谱图中的10号峰红景天苷作为内参物，其相对保留时间为1.00，相对峰面积值为1.00，采用中位数法处理每一个对应共有峰的相对保留时间值(RRT)和相对峰面积值(RA)，得到大株红景天胶囊供试品指纹图谱，结果见表3，表3为大株红景天胶囊供试品指纹图谱；
[0085] 表3
[0086]
[0087] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。