一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法

摘要

本发明公开了一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法，将蜂蜜样品，过滤后用重水配置成0.03‑0.5g/L的溶液；加入浓度为0.5‑2.0 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，其中，磷酸盐缓冲溶液中含体积分数为0.05‑0.3%的3‑三甲基硅烷基‑1‑丙基磺酸钠内标溶液和0.1‑3.0 mM的叠氮化钠，混合，调整pH为2.5‑4.0，经核磁共振谱仪测定得到核磁共振谱；分析蜂蜜样品标记物化学位移，1H化学位移δ为7.0ppm～7.5ppm的偏差△δ在0.02‑0.05ppm范围以内为荆条蜜，否则为油菜蜜或者洋槐蜜。本方法可短时间内分析大量样品，快速鉴别出分荆条蜜与油菜蜜和洋槐蜜。

权利要求

1.一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤，

1）将搅拌均匀的蜂蜜样品，滤布过滤，除去蜂蜜中固体杂质后，用重水配置成0.03-

0.5g/L的溶液；所述的蜂蜜样品为荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜；

2）取一定体积的上述溶液，加入浓度为0.5-2.0 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，两者的体积比为 800-1500：100-300，其中，磷酸盐缓冲溶液中含体积分数为0.05-0.3%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液和0.1-3.0 mM的叠氮化钠，涡旋振荡至均匀混合，调整最终溶液的pH值为2.5-4.0，置于核磁管中；

3）将核磁管放置于核磁共振谱仪中，检测得到核磁共振谱；核磁共振波谱的分析条件为：采用BBI探头；测定温度: 室温20-35 ℃；环境湿度: 20-35%; 观察频率400 MHz；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d或者zg30或者zgpr；谱宽: 6410 Hz；90°脉冲宽度: pl= 6. 45μs; 脉冲延迟时间: dl= 15 s；发射中心: O1=4.7；累加次数: 16或者

64；

4）分析蜂蜜样品标记物化学位移，1H 化学位移δ为7.0ppm ～7.5ppm±0.02-0.05ppm范围以内有多重峰的为荆条蜜，否则为油菜蜜或者洋槐蜜。

2.根据权利要求1 所述的一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法，其特征在于，对于结晶的蜂蜜样品，搅拌均匀前，在密闭情况下，置于不超过40-60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化，搅拌均匀后，再迅速冷却至室温。

3.根据权利要求1 所述的一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法，其特征在于，蜂蜜样品过滤采用孔径为0.10mm-0.14mm的尼龙滤布。

4.根据权利要求1 所述的一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法，其特征在于，步骤2）调整最终溶液的pH值所采用的浓度为1.0 mol/L盐酸或强氧化钠。

5.根据权利要求1 所述的一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法，其特征在于，蜂蜜样品产地来源于江苏、河南、新疆、四川、内蒙、湖北、辽宁、吉林、陕西或山东。

说明书

一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及本涉及属于食品检测，更具体涉及一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法。

背景技术

[0002] 蜂蜜国家标准GB14963-2011GB中规定，蜂蜜是一种蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或者蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质，是一种营养丰富的天然滋养食物。花源有差异，即植物的代谢有差异，因而蜜蜂采得的花蜜成分就会不同，蜂蜜通常根据蜜源植物进行分类，可分为油菜蜜、洋槐蜜、荆条蜜、枣花蜜、椴树蜜等。近年来，国内和国际市场对蜂蜜的需求量不断扩大，然而蜂蜜的产量却难以满足市场需求。由于我国地域辽阔、地形复杂、气候多样，蜂蜜蜜种和产地具有多样化的特性，其产品附加值也产生差异。在巨大经济利益的驱使下，很多不法分子在高品质蜂蜜中加入其它低品质的蜂蜜以次充好，达到以假乱真的效果。严重干扰了蜂蜜产品的市场秩序和我国蜂蜜产品的出口贸易。因此需要开发有效的、可靠的方法来鉴别不同植物源的蜂蜜。

[0003] 对于蜂蜜蜜种的鉴别，最有效的手段是去发现能够显著区分特定蜜种参数的灵敏、可靠的化学标志物。传统方法主要靠感观鉴别和花粉分析。感官鉴别是通过看、闻、品，发现不同种类蜂蜜在色泽、气味、口感方面存在的一些差异，进而区分鉴别。该方法有很大局限性，主要依赖于检测人员个人的经验；花粉分析是在显微镜下观察蜂蜜中花粉细胞的形态，由于每种蜜源植物的花粉都有自己的特征，因此可鉴别蜂蜜的蜜种。但有些蜜种的蜂蜜花粉相似，该方法很难区分。然而，有关特定标志物的国际标准还未颁布。欧洲理事会发布了确定蜂蜜蜜种鉴别的方法，还包括测定总黄酮、挥发性组分、氨基酸、金属和非金属痕量元素。然而这些方法缺乏灵敏可靠的标志物，对于蜂蜜蜜种的鉴别，其准确性、灵敏度和可靠性都将大大降低。

[0004] 核磁共振( NMR )是一种非常重要的研究和分析测试工具，在化学、生物、医学等领域中得到广泛应用，具有很多优势：能保持测试对象的完整性，不破坏样本的性质；对样本要求不严苛，可快速处理，重复实验，大大减少了实验的消耗；可同时完成对物质的鉴别和物质含量的测定，高效快速；具有极好的分辨率。本发明运用核磁共振技术筛选出荆条蜜的特征标志物，从而建立了快速区分荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的方法。

发明内容

[0005] 本发明提供了：一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法，技术可靠，可短时间内分析大量样品，快速鉴别出分荆条蜜与油菜蜜和洋槐蜜，避免了主观因素、人为误差的影响，准确性高、结论科学可靠。

[0006] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是这样的，一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别方法，包括如下步骤，

[0007] 1）将搅拌均匀的蜂蜜样品，滤布过滤，除去蜂蜜中固体杂质后，用重水配置成0.03-0.5g/L的溶液；所述的蜂蜜样品为荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜；

[0008] 2）取一定体积的上述溶液，加入浓度为0.5-2.0 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，两者的体积比为800-1500：100-300，其中，磷酸盐缓冲溶液中含体积分数为0.05-0.3%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液和0.1-3.0 mM的叠氮化钠，涡旋振荡至均匀混合，调整最终溶液的pH值为2.5-4.0，置于核磁管中；

[0009] 3）将核磁管放置于核磁共振谱仪中，检测得到核磁共振谱；核磁共振波谱的分析条件为：采用BBI探头；测定温度: 室温20-35 ℃；环境湿度: 20-35%; 观察频率400 MHz；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d或者zg30或者zgpr；谱宽: 6410 Hz；
90°脉冲宽度: pl= 6. 45μs; 脉冲延迟时间: dl= 15 s；发射中心: O1=4.7；累加次数: 
16或者64；

[0010] 4）分析蜂蜜样品标记物化学位移，1H 化学位移δ 为7.0ppm ～7.5ppm±0.02-0.05ppm范围以内有多重峰的为荆条蜜，否则为油菜蜜或者洋槐蜜。

[0011] 上述的蜂蜜样品分为无结晶和结晶的，对无结晶的蜂蜜样品，过滤前即搅拌均匀即可；对有结晶的蜂蜜样品，在密闭情况下，置于不超过40℃-60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温；

[0012] 优选地，蜂蜜样品过滤采用孔径为0.10mm-0.14mm的尼龙滤布。

[0013] 优选地步骤2）调整最终溶液的pH值所采用的浓度为1.0 mol/L盐酸或强氧化钠。

[0014] 为了确保所找标记物的准确性，我们考察了不同产地的蜂蜜样品的情况，蜂蜜样品产地来源于江苏、河南、新疆、四川、内蒙、湖北、辽宁、吉林、陕西或山东。

[0015] 通过比较研究不同产地的荆条蜜的核磁共振谱图，发现所有荆条蜜在此化学位移出都存在较高相应的多重峰，同时，通过比较研究不同产地油菜蜜和洋槐蜜在1H 化学位移δ 为7.0ppm ～7.5ppm 的是否有干扰，结果表明所有油菜蜜和洋槐蜜在此都无干扰。因此最终确定1H 化学位移δ 为7.0ppm ～7.5ppm的多重峰为荆条蜜特有的特征标志物，可以作为区分荆条蜜与油菜蜜和洋槐蜜的特征差异物质。

[0016] 有益效果：本发明技术可靠，可短时间内分析大量样品，快速鉴别出分荆条蜜与油菜蜜和洋槐蜜，避免了主观因素、人为误差的影响，准确性高、结论科学可靠。

附图说明

[0017] 图1为河南荆条蜜的核磁谱图；

[0018] 图2为河南油菜蜜的核磁谱图；

[0019] 图3为为河南洋槐蜜的核磁谱图。

具体实施方式

[0020] 通过以下具体实施方式对本发明进一步的解释，并对本发明优点进行证明。

[0021] 实验设备包括： Advance 400型核磁共振仪（瑞士布鲁克公司），14.1 T超导磁体，5 mm双核z-梯度探头及Topspin 2.3 试验控制及数据处理软件；5mm核磁共振样品管；高速离心机（Sigma，德国公司）；涡旋混合器（XW-80A型，上海医科大学仪器厂）；LP403分析天平（赛多利斯，德国公司）；

[0022] 实验溶剂包括：氘代水（氘带度为99.8%，又名重水）购于Cambrideg Isotope Laboratories公司； 3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠（TSPSA）购于Aldich-Sigma公司；磷酸氢二钾和磷酸二氢钠（优级纯）购于Aldich-Sigma公司。

[0023] 1、荆条蜜标志物的确证

[0024] 1.1蜂蜜样品的采集

[0025] 自行采集蜂蜜样品共计60个包括荆条蜜20个、油菜蜜20个和洋槐蜜20个；涉及的产地包括：江苏、河南、新疆、四川、内蒙、湖北、辽宁、吉林、陕西、山东；

[0026] 1.2. 蜂蜜样品的前处理

[0027] 对蜂蜜样品中无结晶的，过滤前将其搅拌均匀即可；而对有结晶的，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温；经上述处理后的已知蜂蜜样品，经0.10mm-0.14mm孔径尼龙滤布过滤，除去蜂蜜中固体杂质，取0.1 g样品于离心管中，加入1 mL 重水，溶解完全；

[0028] 取上述溶液800μl，加入100μl浓度为0.5 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=2.0），其中缓冲溶液中含体积分数为0.05%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液和0.1 mM的叠氮化钠，涡旋振荡至均匀混合，然后用1.0 mol/L的盐酸或强氧化钠，调整最终溶液的pH值为2.5，取其中600μl于核磁管中。

[0029] 1.3.核磁共振分析方法的建立

[0030] 调整好核磁波谱仪并把核磁管放置于核磁共振波谱仪中，旋转核磁管以备NMR检测，得到蜂蜜样品的核磁信号；核磁共振波谱的分析条件为：采用BBI探头；测定温度（探头温度）: 室温20-35 ℃；环境湿度: 20-35%; 观察频率400 MHz；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d或者zg30或者zgpr；谱宽: 6410 Hz； 90°脉冲宽度: pl= 6. 45μs; 脉冲延迟时间: dl= 15 s；发射中心: O1=4.7；累加次数: 16或者64。

[0031] 1.4. 谱图预处理

[0032] 用核磁共振谱仪自带的数据处理软件对所得的核磁共振信号进行傅立叶变得换，变换点数为131072，指数线宽因子为1Hz，得到样品的核磁图谱。

[0033] 用topspin软件（Topspin软件中各参数设置如下：PULPROG= Jresgpprqf, AQ_mod=DQD, TD=32K, NS=8*N, DS=4, TD0=1, SW=6000 Hz, D1=3 s, DE=4 μs, D8=0.1s, 信号累加16次））将获得的原始指纹图谱进行预处理，包括谱峰对齐、基线校正和相位校正。以3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠做内标物，化学位移设为0.00进行谱峰对齐；基线校正选择polynomial fit拟合方式；相校正选择global和metabonomics算法先自动优化，后针对特定区域进行手动校正，使尽可能多的积分值为正值。

[0034] 1.5. 核磁共振谱图的比较

[0035] 通过比较研究荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的核磁共振谱图，发现荆条蜜在1H 化学位移δ 为7.0ppm ～7.5ppm之间存在响应值较高的多重峰。

[0036] 通过比较研究不同产地的荆条蜜的核磁共振谱图，发现所有荆条蜜在此化学位移出都存在较高相应的多重峰，

[0037] 同时，通过比较研究不同产地油菜蜜和洋槐蜜在1H 化学位移δ 为7.0ppm ～7.5ppm 的是否有干扰，结果表明所有油菜蜜和洋槐蜜在此都无干扰。

[0038] 因此，最终确定1H 化学位移δ 为7.0ppm ～7.5ppm的多重峰为荆条蜜特有的特征标志物，可以作为区分荆条蜜与油菜蜜和洋槐蜜的特征差异物质。如图1为河南荆条蜜的核磁谱图；图2为河南油菜蜜的核磁谱图；图3为河南洋槐蜜的核磁谱图。

[0039] 2、 实际样品的检测

[0040] 运用建立的鉴别荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的快速鉴别方法用于对未知蜂蜜样品进行检测。将20份未知蜂蜜样品按上述步骤1、2  1.4的方法进行操作，获得所有样品的核磁~共振谱图，依据步骤5中找到的荆条蜜的标记物对未知样品进行判断。在相同的实验条件下检测的样品与荆条蜜标志物1H 化学位移δ 为7.0ppm ～7.5ppm的偏差△δ在0.02-0.05ppm范围以内，则认为是荆条蜜，否则为油菜蜜或者洋槐蜜，依据此可以快速从油菜蜜和洋槐蜜中辨别出荆条蜜，具体结果如表1所示，20个样品中10个荆条蜜都得到了很好的识别，鉴别正确率为100％。

[0041] 表1

[0042]样品类型 真实结果 检出结果
荆条蜜（10个） 荆条 荆条
油菜蜜和洋槐蜜（10个） 油菜或洋槐 油菜或洋槐

[0043] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。