一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统

摘要

本发明涉及一种专为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9安全高效基因编辑系统，属于生物技术领域。现有技术中，酿酒酵母中使用的pCAS质粒上同时具有Cas9基因序列及gRNA元件，能够通过一次转化实现在酿酒酵母中的高效基因组改造，但是在克鲁维酵母中不能稳定复制和表达。本发明向克鲁维酵母细胞中转化Cas9/gRNA融合质粒，质粒靶向克鲁维细胞的内源性DNA序列，并产生双链切口；向克鲁维酵母细胞中转化供体DNA序列，该序列在双链切口处与靶位点产生同源重组，将Tag序列插入目标位点。本发明通过改造，构建了一种克鲁维酵母专用的，可以在克鲁维酵母中稳定复制、表达、并进行基因改造的新的安全、高效CRISPR/Cas9基因编辑系统。

权利要求

1.一种利用优化的CRISPR/Cas9系统对克鲁维酵母基因组进行改造的方法，包括下述步骤：a)向所述克鲁维酵母细胞中转化Cas9/gRNA融合质粒，该质粒靶向所述克鲁维酵母细胞的内源性DNA序列，并产生双链切口；

b)向所述克鲁维酵母细胞中转化供体DNA序列，该序列在双链切口处与靶位点产生同源重组，将Tag序列插入目标位点，其中，所述Cas9/gRNA融合质粒中，gRNA启动子为KlSNR52基因启动子，所述Cas9/gRNA融合质粒序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克鲁维酵母是一种乳酸克鲁维酵母。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，改造的基因为乳酸克鲁维酵母的细胞质苏氨酸氨酰tRNA合成酶Kl-TRS基因。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，对Kl-TRS基因的改造为在基因末端插入一段长1302bp的标记Tag序列。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对原始CRISPR/Cas9质粒进行的一系列序列改造和系统优化，最终使标记Tag可以高效插入克鲁维酵母基因组中，并在克鲁维酵母中稳定遗传和表达，包括下述步骤：a)在pCAS质粒中插入pKD1 stabilizing element序列，构建成质粒pKM-Cas9-SE；

b)将pKM-Cas9-SE质粒中gRNA启动子置换为KlSNR52基因启动子，构建成质粒pKM-Cas9-SE-pKlSNR2；

c)将pKM-Cas9-SE-pKlSNR2质粒中Cas9序列替换为适合克鲁维酵母表达的KLCas9，构建成质粒pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52；

d)将pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52质粒中抗性基因Kan置换为Amp，完成质粒的最终改造，命名为pKM-CAS1.0；

e)将靶向Kl-TRS基因的gRNA插入pKM-CAS1.0中，构建成质粒pKM-CAS1.0-TRS1。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，转化的供体DNA序列为线性双链DNA，该序列包括插入靶位点的Tag序列以及与靶位点两侧序列同源的序列，包括下述步骤：a)以乳酸克鲁维酵母菌液为模板扩增同源臂序列，将同源臂序列插入pMD18质粒中，构建成中间质粒pKM-TRS-DD1；

b)将Tag序列插入pKM-T-DD1质粒两同源臂中间位置，构建成最终质粒pKM-TRS-DD2；

c)以pKM-TRS-DD2为模板进行PCR扩增，得到线性双链供体DNA。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过LiAc/SS carrier DNA/PEG方法将质粒转化进入克鲁维酵母细胞中，包括下述步骤：a)将pKM-CAS1.0-TRS1质粒和线性供体DNA同时转化进入克鲁维酵母细胞中；

b)涂板后挑取单克隆于1mL液体YPD培养基中振荡培养。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR扩增检测Tag序列插入靶位点效率，包括下述步骤：在Tag序列内设计一条引物，在靶基因上位于同源臂外侧的序列设计一条引物，以单克隆菌液为模板进行PCR扩增，电泳检测阳性的为插入成功。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，线性双链供体DNA为SEQ ID NO.2序列所示的核苷酸。

10.一种CRISPR/Cas9质粒，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且，所述CRISPR/Cas9质粒中，gRNA启动子为KlSNR52基因启动子。

说明书

一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统

技术领域

[0001] 本发明涉及一种专为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 微生物基因组改造主要依赖于内源性同源重组修复（endogenous homology-directed repair, HDR）和非同源性末端连接（non- homologous end joining, NHEJ) 两种生物学机制[1]。HDR的基本过程为，基因组发生双链断裂（double-strand breaks, DSBs）后，供体DNA（序列与断裂位点两侧序列同源）在断裂位点处与受损基因组序列发生同源重组，实现修复，这一过程不易引入插入或缺失突变[2]。NHEJ的基本过程为，断裂DNA两端直接连接，不借助供体DNA介导的同源重组，这一过程容易产生插入或缺失突变，引起密码子位移[3]。在正常条件下，HDR引起同源重组的概率很低，但是通过内切酶在基因组上产生切口，并向细胞内转化线性的同源DNA片段，可以极大地增加重组效率。而且将内切酶与具有位点识别功能的元件相结合，能实现高效的、特异性的基因组改造。

[0003] CRISPR/Cas  (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated)是广泛存在于细菌和古细菌中的一种生物防御系统[4]。其中经过改造的Ⅱ型系统，CRISPR/Cas9，成为现在广泛使用的基因组改造工具[5]。在guide RNA (gRNA)的介导下，Cas9蛋白识别基因组上protospacer adjacent motif (PAM)及其上游20 bp序列，并在PAM上游3 bp位置产生双链切口。在同时提供供体DNA（donor DNA) 的情况下，被CRISPR/Cas9双链切开的基因可以HDR的方式重组入新的序列，以达到基因改造的目的[6]。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，利用CRISPR/Cas9系统进行基因组改造的实例很多，包括基因点突变、基因敲除和基因插入等[7-9]。比如，在现有技术中流行的pCAS质粒上同时具有Cas9基因序列及gRNA元件[10]，能够通过一次转化实现在酿酒酵母中的高效基因组改造。克鲁维酵母（Kluyveromyces）是一种子囊孢子酵母，其中的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）和乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）是工业上广泛使用的酵母。例如乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母。与其他酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点，如超强的分泌能力，良好的大规模发酵特性、食品安全的级别及同时具有蛋白翻译后修饰的能力等，其作为宿主系统表达药用蛋白也已显示出巨大的潜力。但通常酿酒酵母的质粒作为一种2µ质粒（包括pCAS)，在克鲁维酵母中不能稳定复制和表达[11]。在目前报道的克鲁维酵母CRISPR/Cas9改造系统中，Cas9基因被直接插入到酵母基因组中，造成Cas9蛋白的持续表达，对克鲁维酵母的工业生产存在一定安全隐患[12]，所以构建一个能够在克鲁维酵母中稳定复制和表达的高效安全CRISPR/Cas9系统是生物技术发展必需的，也将是生物医药领域上的一大进步。

发明内容

[0004] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种专为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统，使得CRISPR/Cas9能在克鲁维酵母中稳定复制，安全高效表达，并完成克鲁维酵母基因组的高效编辑。

[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一方面，本发明提供了一种利用优化的CRISPR/Cas9系统对克鲁维酵母基因组进行改造的方法，包括下述步骤：

[0006] a)向所述克鲁维酵母细胞中转化Cas9/gRNA融合质粒，该质粒靶向所述细胞的内源性DNA序列，并产生双链切口；

[0007] b)向所述克鲁维酵母细胞中转化供体DNA序列，该序列在双链切口处与靶位点产生同源重组，将Tag序列插入目标位点。

[0008] 在本发明中，所述的克鲁维酵母为乳酸克鲁维酵母，改造的基因为乳酸克鲁维酵母的细胞质苏氨酸氨酰tRNA合成酶Threonyl-tRNAsynthetase (Kl-TRS)基因。先检索Kl-TRS基因序列（http://www.uniprot.org/），确定gRNA序列。

[0009] 在本发明中，对Kl-TRS基因的改造为在基因末端插入一段长1302 碱基对（bp）的标记Tag序列。

[0010] 在本发明中，对原始pCAS质粒进行一系列改造，最终使标记Tag可以高效插入克鲁维酵母基因组中，并在克鲁维酵母中稳定遗传和表达。具体改造包括下述步骤：

[0011] a)在pCAS质粒中插入pKD1 stabilizing element (SE)序列，构建成质粒pKM-Cas9-SE；

[0012] b)将pKM-Cas9-SE质粒中gRNA启动子置换为KlSNR52基因启动子，构建成质粒pKM-Cas9-SE-pKlSNR52；

[0013] c)将pKM-Cas9-SE-pKlSNR52质粒中Cas9序列替换为适合克鲁维酵母表达的KLCas9，构建成质粒pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52；

[0014] d)将pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52质粒中抗性基因Kan置换为Amp，完成质粒的最终改造，命名为pKM-CAS1.0；

[0015] e)将靶向Kl-TRS基因的gRNA插入pKM-Cas9中，构建成质粒pKM-CAS1.0-TRS1（SEQ ID NO.1）。

[0016] 在本发明中，转化的供体DNA序列为线性双链DNA，该线性双链供体DNA序列包括插入靶位点的Tag序列以及与靶位点两侧序列同源的序列，具体构建与扩增步骤包括下述步骤：

[0017] a)以乳酸克鲁维酵母菌液为模板扩增同源臂序列，将同源臂序列插入pMD18质粒中，构建成中间质粒pKM-TRS-DD1；

[0018] b)将Tag序列插入pKM-TRS-DD1质粒两同源臂中间位置，构建成最终质粒pKM-T-DD2；

[0019] c)以pKM-TRS-DD2为模板进行PCR扩增，得到线性双链供体DNA（SEQ ID NO.2）。

[0020] 在本发明中，接着通过LiAc/SS carrier DNA/PEG方法将质粒转化进入克鲁维酵母细胞中，包括下述步骤：

[0021] a)将pKM-CAS1.0-TRS1质粒和线性供体DNA 同时转化进入克鲁维酵母细胞中；

[0022] b)涂板后挑取单克隆于1 mL液体YPD培养基中振荡培养。

[0023] 在本发明中，通过PCR扩增检测Tag序列插入靶位点效率，在Tag序列内设计一条引物，在靶基因上位于同源臂外侧的序列设计一条引物，以单克隆菌液为模板进行PCR扩增，电泳检测阳性的为插入成功。

[0024] 在另一方面，本发明涉及一种CRISPR/Cas9质粒，包含与SEQ ID NO. 1至少80%序列相同的核苷酸。

[0025] 在另一方面，本发明涉及一种线性双链DNA，包含与SEQ ID NO.2至少80%序列相同的核苷酸。

[0026] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。本文中述及的所有出版物和其他参考文献都通过引用纳入本文。

[0027] 本发明的有益效果是: 本发明通过改造，构建了一种在克鲁维酵母中稳定复制和表达的质粒，使得CRISPR/Cas9能在克鲁维酵母中完成稳定、高效、安全的基因编辑的系统。

附图说明

[0028] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

[0029] 图1是pKM-CAS1.0-TRS1与pCAS质粒转化克鲁维酵母效率对比图，pKM-CAS1.0-TRS1转化克鲁维酵母效率明显高于pCAS质粒的转化效率。

[0030] 图2是Kl-TRS基因gRNA位置示意图，其中方框中为PAM序列，下划线表示gRNA序列，箭头指示Cas9酶切位点。其中Kl-TRS为乳酸克鲁维酵母细胞质色氨酸氨酰tRNA合成酶（Threonyl-tRNAsynthetase)基因，位于染色体F的567803..570037位点。

[0031] 图3是pKM-CAS1.0-TRS1质粒图谱。

[0032] 图4是pKM-TRS-DD2质粒图谱。

[0033] 图5包括图5a和5b，是基因组插入Tag序列的PCR验证结果图，图5a为琼脂糖凝胶电泳图，其电泳条带大小为1274bp，阳性率达80%以上，图5b为三次重复试验的误差条形图，三次实验结果误差不明显，表明实验结果相对稳定。

具体实施方式

[0034] 以下结合具体实施例和附图说明对本发明做进一步的说明，但下述的实施例并非用于限定本发明的保护范围。

[0035] 实施例1—KL-CAS1.0系统改造

[0036] pKM-Cas9/gRNA质粒构建

[0037] 现有技术中，酿酒酵母中使用的pCAS质粒上同时具有Cas9基因序列及gRNA元件，能够通过一次转化实现在酿酒酵母中的高效基因组改造，但是在克鲁维酵母中不能稳定复制和表达，如图1所示。本发明通过改造，构建了一种克鲁维酵母专用的，可以在克鲁维酵母中稳定复制、表达、并进行基因改造的新的安全高效CRISPR/Cas9基因编辑系统，将该基因编辑系统命名为KL-CAS1.0。本发明的克鲁维酵母以乳酸克鲁维酵母为实施例作说明，但不以此为限。

[0038]  KL-CAS1.0高效pKD1 stabilizing element (SE)元件插入

[0039] pKD1是克鲁维酵母转化的常用质粒[13]，为了构建一种能在克鲁维酵母中稳定复制并表达的质粒，本发明在pCAS质粒中首先插入pKD1中的SE元件[14]。

[0040] pKD1SE元件（SEQ ID NO.3）由上海生工合成（上海，中国），并以引物pKD1SE-F1: GGACGCTCGAAGCCGCGGTGAGCAAAAG和pKD1SE-R1: CCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCC进行扩增。以pCAS质粒为模板，以引物pCAS-F1:  AGGAACCGTAAAAAGGCCG和pCAS-R1: GGCCTTTTGCTGGCCTTT进行扩增。将pCAS扩增产物8.5 µL与pKD1SE扩增产物8.5 µL混合，加入1 µLDpn I，2 µL10×digestion buffer，37oC温浴3 h。将Dpn I处理后产物10 µL加入100µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37oC振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37oC倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-Cas9-SE。

[0041] KL-CAS1.0高效gRNA启动子置换

[0042] SNR52基因启动子是一种RNA polymerase III (Pol III)启动子，曾用于酿酒酵母CRISPR系统gRNA转录[7，15]。为了保证pKM-Cas9-SE质粒中gRNA在克鲁维酵母中高效转录，本发明第二步将pKM-Cas9-SE质粒中gRNA启动子置换为乳酸克鲁维酵母中SNR52基因的启动子。

[0043] 以 乳 酸 克 鲁 维 酵 母 菌 液 为 模 板 ，以 引 物 p K l S N R 5 2 - F 1 :TTATGCTTAAATGCGTATATGTGTTATGTATTGGTGAACCCAATGGGAAA和引物pKlSNR52-R1: AGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCATCGTTACTTTCTCGGCAGTTCG进行扩增，得到KlSNR52启动子序列（位于染色体F的1157521...1157897位点）。以pKM-Cas9-SE质粒为模板，以引物pKM-Ca s 9 -F 1 :  G A T GG C C GG C A TG G T C CC 和 引 物p K M -C a s 9- R 1 : TACATAACACATATACGCATTTAAGCATAAACACGCAC进行扩增。将两次扩增产物各8.5 µL，1 µLDpn I，2 µL10×digestion buffer混合，37oC温浴3 h。将Dpn I处理后产物10 µL加入100µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37oC振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37oC倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-Cas9-SE-pKlSNR52。

[0044] KL-CAS1.0中乳酸克鲁维酵母专用Cas9的序列置换

[0045] 为提高Cas9蛋白在乳酸克鲁维酵母中的活性，本发明将原质粒中Streptococcus pyogenes Cas9基因序列置换为优化过的，适合乳酸克鲁维酵母表达的KLCas9。

[0046] KLCas9序列由上海生工合成，并插入在pUC57质粒中。以pUC57-KLCas9质粒为模板，以pKM-Cas9-F1:TTAATACACGTATTTATTTGTCCAATTACCATGGATAAGAAATACTCTATCGGTTTG和引物pKM-Cas9-R1: AACTTTTCTTTTCTTTTTTGGCCCTCCACCATCACCACCTAATTGAGACAAAT进行扩增，得到KLCas9基因产物。以pKM-Cas9-SE-pKlSNR52质粒为模板，以pKM-Cas9-F2: GGTGGAGGGCCAAAAAAGAAAAG和pKL-Cas9-R2: GGTAATTGGACAAATAAATACGTGT进行扩增。将两o次扩增产物各8.5 µL，1 µL Dpn I，2 µL10×digestion buffer混合，37 C温浴3 h。将Dpn I处理后产物10 µL加入100µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42oC热激45 s后，加入
1 mL LB液体培养基37oC振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37oC倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52。

[0047] KM-CAS1.0质粒抗性基因置换

[0048] 因为原质粒与供体DNA中的抗性基因都是Kan，为了便于最终阳性克隆的筛选，本发明将原质粒中Kan基因置换为Amp基因。以pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52质粒为模板，以pKM-Cas9-F3: AGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCCTGTCGATTCGATACTAACGCC和pKM-Cas9-R3: TTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGGCTGGCCGGGTGACCCGGCG进行扩增。以pMD18质粒为模板，以Amp-F1: CGCGGAACCCCTATTTGTTT和Amp-R1: GAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGG进行扩增。将两次扩增产物各8.5 µL，1 µLDpn I，2 µL10×digestion buffer混合，37oC温浴3 h。将Dpn I处理后产物10 µL加入100µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37oC倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，得到最终改造完成质粒，命名为pKM-CAS1.0。

[0049] 2.实施例2—靶基因及gRNA序列确定

[0050] 2A.乳酸克鲁维酵母靶标基因鉴定

[0051] 在网站http://www.uniprot.org/ 进行序列搜索，物种“Kluyveromyceslactis”，关键词“ThreoninetRNAsynthetase” “ThrRS”“TRS”。这里以在此基因尾部插入一段标记DNA为例，其他目标基因或插入位置、序列均可采用类似方法操作。

[0052] i.在乳酸克鲁维酵母中存在两种TRS，分别存在于细胞质和线粒体中。检索到蛋白序列以后，在网站https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.htmL上进行分析，确定检索蛋白存在于细胞质（不含线粒体识别序列，真核同源）还是线粒体（存在线粒体识别序列，原核同源），挑选细胞质TRS基因(http://www.uniprot.org/uniprot/Q6CL41) 作为目标基因,并命名为Kl-TRS。

[0053] ii.下载基因序列并在网址 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE-TYPE=BlastSearch&PROG-DEF=blastn&BLAST-PROG-DEF=megaBlast&BLAST-SPEC=OGP--28985--12363上进行BLAST比对分析，确定基因的染色体定位，并获取基因两端相邻序列信息。

[0054] gRNA序列确定

[0055] 在Kl-TRS基因终止密码子附近搜索PAM序列（NGG），选择位于终止密码子上游，且最靠近终止密码子的PAM（位于染色体F的570038...570040位点），并确定Kl-TRSgRNA序列（CTGATAATGTCTTGGCTTAA，位于染色体F的570018...570037位点），如图2所示。

[0056] 3.实施例3—靶序列pKM-Cas9质粒构建

[0057] 本发明通过PCR-同源重组方法，将原质粒中的gRNA序列置换为Kl-TRSgRNA序列。具体步骤为：以pKM-CAS1.0质粒为模板，以引物pKM-Cas9-TRS-F1: 
CTTTCTGATAATGTCTTGGCTTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG和引物pKM-Cas9-TRS-R1: GCTCTAAAACTTAAGCCAAGACATTATCAGAAAGTCCCATTCGCCAC进行扩增。将扩增产物17 µL，1 µo
LDpn I，2 µL10×digestion buffer混合，37 C温浴3 h。将Dpn I处理后产物10 µL加入100µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42oC热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37oC倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-CAS1.0-TRS1，如图3所示。

[0058] 4.实施例4—供体 DNA质粒构建及线性供体DNA扩增

[0059] 为了便于线性供体DNA的保存及扩增，本发明首先将供体DNA插入到pMD18质粒中，然后通过PCR扩增得到线性供体DNA序列。具体步骤为：以pMD18质粒为模板，以引物pMD18-F1: ATCGTCGACCTGCAGGCATG和引物pMD18-R1: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG进行扩增。以乳酸克鲁 维 酵 母 菌 液 为 模 板 ，以 引 物 K L L A - T - L F 1 :GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTTAATGTTTAAGGCTCGTGAACGTT和引物KLLA-T-RR1: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTATCTATGTTTATTGGCACACAAGC进行扩增。将两次扩增产物各8.5 µL，1 µLDpn I，2 µL10×digestion buffer混合，37oC温浴3 h。将Dpn I处理后产物10 µL加入100µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42oC热激45 s后，加入1 mL LB液o o
体培养基37C振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37C倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-T-DD1。

[0060] 以 p K M - T R S - D D 1 为 模 板 ，以 引 物 T h r - F 1 : TTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAAGGAATATCCAAACCGATCA和引物Thr-R1: ATTATACCATGTTCCTGTGATACCGGCTTCAGCCAAGACATTATCAGCTC进行扩增。以Tag质粒为模板，以引物Tag-F1: GAAGCCGGTATCACAGGAAC和引物Tag-R1: TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG进行扩增。将两次扩增产物各8.5 µL，1 µLDpn I，2 µL10×digestion buffer混合，37oC温浴3 oh。将Dpn I处理后产物10 µL加入100µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42 C热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37oC振荡培养1 h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37oC倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-TRS-DD2，如图4所示。

[0061] 以 p K M - T - D D 2 质 粒 为 模 板 ，以 引 物 K L L A - T - L F 1 : GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTTAATGTTTAAGGCTCGTGAACGTT和引物KLLA-T-RR1: GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTATCTATGTTTATTGGCACACAAGC进行扩增，得到线性供体DNA。

[0062] 5.实施例5—优化的乳酸克鲁维酵母感受态制备和转化

[0063] 本发明基于文献[16]中酵母感受态制备及转化方法，经过优化，应用于乳酸克鲁维酵母。

[0064] 乳酸克鲁维酵母感受态制备

[0065] 将乳酸克鲁维酵母菌液在YPD固体培养基上划线并挑取单克隆，于25 mL 2×YPD液体培养基中振荡培养过夜，取2 mL菌液于50 mL液体2×YPD培养基中继续振荡培养2-8 h。20oC条件下3000 g离心5 min收集酵母细胞，加入500 µL无菌水重悬，同样条件下离心收集细胞。配制感受态细胞溶液（5% v/v甘油，10% v/v DMSO）并将酵母细胞溶解于500 µL该溶液中。分装50 µL至1.5 mL离心管中，-80oC保存。

[0066] 乳酸克鲁维酵母感受态转化

[0067] 将感受态细胞置于37oC融化15-30 s，13000 g离心2 min并去除上清。配制转化缓冲液：PEG 3350 (50% (w/v)) 260 µL，LiAc (1.0 M) 36 µL，carrier DNA (5.0 mg/mL) 20 µL，Cas9/gRNA质粒15µL，供体DNA 5 µL，加入无菌水至最终体积360 µL。热激后，13000 g离心30 s去除上清。加入1 mL YPD液体培养基，培养2-3 h，吸取200 µL涂布于固体YPD（200 µg/mL G418）培养基，培养2-3天至单菌落出现。

[0068] 6.实施例6—乳酸克鲁维酵母基因组插入Tag序列检测

[0069] 在乳酸克鲁维酵母转化后的平板上挑取10-20个单克隆，置于1 mL YPD（200 µg/mL G418）液体培养基中振荡培养过夜，以菌液为模板，以引物Tag-R2（Tag序列内引物）: ACATACGAGCCTTCAGCATTACCAC和引物Thr-F2（供体DNA  5’外侧引物）: CACGGTACCAGAATTTACAACACT进行PCR扩增检测，有阳性条带表明Tag序列插入靶位点成功，如图5a所示。同时图5b为三次重复试验的误差条形图，三次实验结果误差不明显，表明实验结果相对稳定。

[0070] 参考文献

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