一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂及其保存、检测方法

摘要

本发明提供了一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂及其保存、检测方法，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂由以下重量份的原料组成：填充剂75～83份，显色剂0.5～1.5份，磷酸盐15～20份，蔗糖异构酶0.5～1.2份，葡萄糖基寡糖氧化酶0.6～1.2份和辣根过氧化物酶0.5～1.2份。本发明便于携带，操作过程简单、高效，安全性高，抗干扰能力强，不需要大型仪器设备，检测结果直观可见；检测灵敏度高，使用分光光度计检测限可达1.0mg/L；检测方法回收率高、重现性好。

权利要求

1.一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，其特征在于，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂由以下重量份的原料组成：填充剂75 83份，显色剂0.5 1.5份，磷酸盐15 20份，蔗糖~ ~ ~异构酶0.5 1.2份，葡萄糖基寡糖氧化酶0.6 1.2份和辣根过氧化物酶0.5 1.2份；所述填充~ ~ ~剂为氯化钠；所述显色剂为N,N-二乙基-对苯二胺；所述磷酸盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物。

2.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，其特征在于，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂由以下重量份的原料组成：填充剂80份，显色剂1份，磷酸盐16份，蔗糖异构酶1份，葡萄糖基寡糖氧化酶1份和辣根过氧化物酶1份。

3.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，其特征在于，所述磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的摩尔比为（1:7）（17:1）。

~

4.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，其特征在于，以蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂总质量为基准，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有蔗糖异构酶的酶活力单位为0.3 1.0U/mg，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有葡萄糖~基寡糖氧化酶的酶活力单位为0.4 1.0U/mg，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有~辣根过氧化物酶的酶活力单位为0.7 2.0U/mg。

~

5.一种如权利要求1-4任一所述的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的保存方法，其特征在于，将上述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂用检测管密封包装，避光4 8oC冷藏，所述~检测管为透明螺旋盖玻璃试管或高透明度聚苯乙烯塑料瓶。

6.一种如权利要求1-4任一所述的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将蜂蜜样品稀释1000 2000倍后，取4.0mL样品溶液到含有蜂蜜中蔗糖快速检测的~预制试剂的检测管中，混合均匀，于在30 45oC下准确反应10min；

~

（2）观察步骤（1）反应后的预制试剂的颜色，与标准比色卡对照，可半定量检测蜂蜜样品中蔗糖的浓度范围；

或在540 560nm波长范围内测定步骤（1）反应后的预制试剂的吸光度值，根据吸光度值~从标准曲线查找并换算，可定量检测蜂蜜样品中蔗糖的含量。

说明书

一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂及其保存、检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及食品安全快速检测技术领域，尤其涉及一种灵敏度高、操作简单的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂及其保存、检测方法。

背景技术

[0002] 蜜蜂为采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜中含有与人体血清浓度相近的多种无机盐和维生素、铁、钙、铜、锰、钾、磷等多种有机酸及有益人体健康的微量元素，还含有糖类和多种氨基酸，具有极高的保健作用和营养价值，深受消费者的青睐。近年来，国内和国际市场对蜂蜜的需求量不断扩大，然而蜂蜜的产量难以满足市场的需求，且由于蜜源的不同，蜂蜜的种类繁多，成分复杂，使得蜂蜜品质的检测技术存在很大局限。蔗糖含量是蜂蜜质量的重要指标之一《，食品安全国家标准-蜂蜜》(GB14963-2011)规定，桉树蜂蜜、柑橘蜂蜜、紫苜蓿蜂蜜、荔枝蜂蜜和野桂花中蔗糖含量≤10％，其它蜂蜜≤5％。

[0003] 关于蔗糖的检测方法主要有高效液相色谱法、酸水解法和酶水解法。高效液相色谱法由于要使用大型仪器，不适合于现场快速检测和基层实验室检测。酸水解法是将蔗糖在70℃左右的酸性条件下水解成葡萄糖和果糖，再在沸腾条件下以斐林试剂滴定，计算出蔗糖含量；酶水解法，是用蔗糖酶将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，再利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖，换算出蔗糖含量。蜂蜜中除了蔗糖外，还含有大量的葡萄糖和果糖，要测定水解前后样品中的葡萄糖含量的差值，才能换算成蔗糖含量，但由于蜂蜜中蔗糖含量通常是葡萄糖含量的1/5到1/10，同时样品需要稀释倍数很高，测定的误差很大，不能满足检测需要。此外，酸水解法需要在沸腾条件下滴定，操作比较繁琐、条件要求较为苛刻。因此，酸水解法和酶水解法不适合蜂蜜样品中蔗糖的快速检测。

[0004] 中国专利文献上公开了“蜂蜜品质快速检测方法”，其公告号为CN101393122A，该发明利用蜂蜜的近红外各成分含量之间的数学模型对蜂蜜各成分含量进行测定，该方法原理复杂，检测效率低，不利于大规模推广使用。

发明内容

[0005] 本发明为了克服现有蜂蜜中蔗糖含量的测定效率低、误差大的问题，提供了一种灵敏度高、抗干扰能力强的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂。

[0006] 本发明又提供了一种使用方便、存储效果好的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的保存方法。

[0007] 本发明还提供了一种测定回收率高、重现性好的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的检测方法，该法适用于基层实验室检测和现场快速检测。

[0008] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0009] 一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂由以下重量份的原料组成：填充剂75～83份，显色剂0.5～1.5份，磷酸盐15～20份，蔗糖异构酶0.5～1.2份，葡萄糖基寡糖氧化酶0.6～1.2份和辣根过氧化物酶0.5～1.2份。

[0010] 本发明蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂配方体系中所选的蔗糖异构酶，葡萄糖基寡糖氧化酶和辣根过氧化物酶具有专一性，抗干扰能力强，蜂蜜中的其它糖类，特别是含量较高的葡萄糖和果糖均对测定没有影响。检测机理具体为：蜂蜜中的蔗糖在蔗糖异构酶的作用下异构生成异麦芽酮糖，后者在葡萄糖基寡糖氧化酶的作用下，氧化生成3-酮-异麦芽酮糖，同时产生过氧化氢；过氧化氢在辣根过氧化物酶作用下氧化成水，同时使底物DPD(N,N-二乙基-对苯二胺)变成阳离子型DPD，后者呈现粉红色，粉红色深浅与产生的过氧化氢量呈线性有关，继而与样品中最初的蔗糖浓度线性相关，因此，可利用粉红色深浅或吸光度值来测定蔗糖浓度。

[0011] 作为优选，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂由以下重量份的原料组成：填充剂80份，显色剂1份，磷酸盐16份，蔗糖异构酶1份，葡萄糖基寡糖氧化酶1份和辣根过氧化物酶1份。

[0012] 作为优选，所述填充剂为氯化钠。

[0013] 作为优选，所述显色剂为N,N-二乙基-对苯二胺，其为无色液体，在检测过程中抗干扰能力强。

[0014] 作为优选，所述磷酸盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物，所述磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的摩尔比为(1:7)～(17:1)。

[0015] 作为优选，以蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂总质量为基准，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有蔗糖异构酶的酶活力单位为0.3～1.0U/mg，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有葡萄糖基寡糖氧化酶的酶活力单位为0.4～1.0U/mg，所述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有辣根过氧化物酶的酶活力单位为0.7～2.0U/mg。

[0016] 本发明制备预制试剂时考虑到直接购买的酶试剂，酶活力单位是一定的，本发明采用加入量的多少来控制蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中三种酶的酶活力，优选三种酶的酶活力控制在上述范围内，预制试剂的检测准确度最佳。

[0017] 一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的保存方法，将上述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂用检测管密封包装，避光4～8℃冷藏，所述检测管为透明螺旋盖玻璃试管或高透明度聚苯乙烯塑料瓶。

[0018] 本发明采用分装的方法，将每批制备的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂以每份50mg小剂量单独包装，简化传统大剂量包装检测前需称量的繁琐步骤，同时避免多次称取造成试剂污染。本发明使用方便，即拿即测，试剂安全，检测准确度高。密封包装，避光冷藏则有效保障了蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中酶的活性。

[0019] 一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的检测方法，包括以下步骤：

[0020] (1)将蜂蜜样品稀释1000～2000倍后，取4.0mL样品溶液到含有蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂检测管中，混合均匀，于在30～45℃下准确反应10min，；

[0021] (2)观察步骤(1)反应后的预制试剂的颜色，与标准比色卡对照，可半定量检测蜂蜜样品中蔗糖的浓度范围；

[0022] 或在540～560nm波长范围内测定步骤(1)反应后的预制试剂的吸光度值，根据吸光度值从标准曲线查找并换算，可定量检测蜂蜜样品中蔗糖的含量。

[0023] 本发明的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的检测方法中，反应温度优选37℃，测定吸光度的波长优选553nm，蜂蜜样品与预制试剂处分反应后的显色是在可见光区，肉眼可见颜色变化，直观、方便；也可用分光光度法进行定量检测，检测限可达1.0mg/L。

[0024] 既可用标准比色卡半定量，也可用便携式分光光度计或普通分光光度计准确定量样品中蔗糖含量，适用于基层实验室检测和现场快速检测。本发明具有操作简单、检测快速灵敏、试剂安全、无需大型仪器、携带方便、不受样品中葡萄糖和果糖等还原糖的影响等特点。

[0025] 因此，本发明具有如下有益效果：

[0026] (1)试剂安全，抗干扰能力强，组分中所选用的酶具有专一性，蜂蜜中的其它糖类，特别是含量较高的葡萄糖和果糖均对测定没有影响；

[0027] (2)便于携带，操作过程简单、高效，不需要大型仪器设备，检测结果直观可见，显色在可见光区，肉眼可见颜色变化；

[0028] (3)检测灵敏度高，使用分光光度计检测限可达1.0mg/L；

[0029] (4)检测方法回收率高、重现性好，检测结果与国家标准高效液相色谱法相符性高，平均回收率达97.6％，平均相对标准偏差(n＝10)为3.4％。

具体实施方式

[0030] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

[0031] 在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

[0032] 实施例1

[0033] 一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，由以下原料组成：氯化钠8g，N,N-二乙基-对苯二胺0.1g，磷酸盐1.6g(磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的摩尔比为1:5)，蔗糖异构酶0.1g，葡萄糖基寡糖氧化酶0.1g和辣根过氧化物酶0.1g；以蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂总质量10g为基准，蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有蔗糖异构酶的酶活力单位为0.3U/mg，含有葡萄糖基寡糖氧化酶的酶活力单位为0.7U/mg，含有辣根过氧化物酶的酶活力单位为1.5U/mg；将上述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂分为50mg每份，每份用10mL透明螺旋盖玻璃试管密封包装，避光4℃冷藏。

[0034] 实施例2

[0035] 一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，由以下原料组成：氯化钠8.29g，N,N-二乙基-对苯二胺0.05g，磷酸盐1.5g(磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的摩尔比为17:1)，蔗糖异构酶0.05g，葡萄糖基寡糖氧化酶0.06g和辣根过氧化物酶0.05g；以蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂总质量10g为基准，蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有蔗糖异构酶的酶活力单位为0.65U/mg，含有葡萄糖基寡糖氧化酶的酶活力单位为0.4U/mg，含有辣根过氧化物酶的酶活力单位为0.7U/mg；将上述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂分为50mg每份，每份用10mL高透明度聚苯乙烯塑料瓶密封包装，避光8℃冷藏。

[0036] 实施例3

[0037] 一种蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，由以下原料组成：氯化钠7.49g，N,N-二乙基-对苯二胺0.15g，磷酸盐2g(磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的摩尔比为1:7)，蔗糖异构酶0.12g，葡萄糖基寡糖氧化酶0.12g和辣根过氧化物酶0.12g；以蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂总质量10g为基准，蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂中含有蔗糖异构酶的酶活力单位为1.0U/mg，含有葡萄糖基寡糖氧化酶的酶活力单位为1.0U/mg，含有辣根过氧化物酶的酶活力单位为2.0U/mg；将上述蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂分为50mg每份，每份用10mL透明螺旋盖玻璃试管密封包装，避光6℃冷藏。

[0038] 对实施例1-3的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，制作蜂蜜样品中蔗糖含量的标准曲线，包括以下步骤：

[0039] (1)标准工作曲线绘制：分别移取0、100、200、400、600、1200和2000μL蔗糖标准溶液(100mg/L)于七支试管中，并加水补足到5.0mL；再分别取这七支试管中的液体4.0mL到装有实施例1-3的预制试剂的检测管中，混匀，于37℃水浴下准确保温10min，在553nm下以加入0mL标准溶液的为参比，用1cm比色皿依次测定吸光度值。得到标准工作曲线信息，并记录在表1；

[0040] (2)检测限和定量限的确定：对标准工作曲线中的最低浓度工作标准溶液，做六次重复测定试验，计算标准偏差，以3倍标准偏差为检出限、10倍标准偏差为定量检测限，结果记录在表1。

[0041] 表1检测结果

[0042]

[0043] 注：A为吸光度值；C为蔗糖浓度(mg/L)

[0044] 由表1可以看出，本发明蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的检测灵敏度高，使用分光光度计检测限可达1.0mg/L。

[0045] 对本发明检测方法的重现性和样品加标回收率及与标准方法比对分析：

[0046] 选取本发明实施例1的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂，对某蜂蜜样品进行平行测定10次，得到本发明测定的重现性结果如表2所示。另外，分别在该蜂蜜样品中加入3个梯度的标准蔗糖溶液，得到3种不同浓度的加标样，测定结果如表3所示。同时，相同加标样品用国家标准方法《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测法》(GB/T 18932.22-2003)测定，结果如表3所示。

[0047] 样品溶液的制备方法：准确称取蜂蜜1.0g到烧杯中，加入蒸馏水溶液，并全部移到100mL容量瓶中，并用蒸馏水清洗烧杯3～4次，清洗液倒入容量瓶中，定容，取该溶液5.0mL到另一个100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容，此即为待测定样品溶液，备用。

[0048] 测定：准确移取样品溶液4.0mL到装有实施例1预制试剂的透明螺旋盖玻璃试管中，混匀，于37℃水浴下准确保温10分钟，倒入1cm比色皿中，以加入蒸馏水代替样品其它步骤相同的为参比，在553nm下测定吸光度值。以吸光度值从实施例2的标准工作曲线中得到对应的浓度值，并按本实施例的稀释倍数，得到样品中蔗糖的浓度，结果如表3所示。

[0049] 表2重现性结果

[0050]蜂蜜样品测定编号 蔗糖的含量(g/100g)
1 2.78
2 2.84
3 2.87
4 3.03
5 3.01
6 2.76
7 2.75
8 2.83
9 2.79
10 2.91
平均值 2.86
平均相对标准偏差 3.4％

[0051] 由表2可以看出，本发明蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的检测方法重现性良好。

[0052] 表3.加标回收率及与国标方法比对结果

[0053]

[0054] 由表3可以看出，本发明检测方法的平均相对标准偏差为3.4％，加标回收率为92.0～102％，平均加标回收率为97.6％，与国家标准高效液相色谱法相比，相对误差在-
0.79～2.51％，具有很好的相符性。说明本发明蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂的检测方法精密度好、回收率高。

[0055] 分别选取本发明实施例2、3的蜂蜜中蔗糖快速检测的预制试剂检测方法的重现性和样品加标回收率及与标准方法比对分析，其步骤与实施例1完全相同，不再赘述。

[0056] 本发明安全性高，抗干扰能力强，组分中所选用的酶具有专一性，蜂蜜中的其它糖类，特别是含量较高的葡萄糖和果糖均对测定没有影响；便于携带，操作过程简单、高效，不需要大型仪器设备，检测结果直观可见，显色在可见光区，肉眼可见颜色变化；检测灵敏度高，使用分光光度计检测限可达1.0mg/L；测定回收率高、重现性好，检测结果与国家标准高效液相色谱法相符性高，平均回收率达97.6％，平均相对标准偏差(n＝10)为3.4％。

[0057] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。