CBX4作为HIV-1潜伏感染激活靶点的应用

摘要

本发明公开了CBX4作为HIV‑1潜伏感染激活靶点的应用。本发明通过研究发现抑制CBX4具有良好的HIV‑1潜伏激活能力，敲低CBX4能够有效促进HIV‑1 LTR的转录；本发明继而在J‑lat 10.6 HIV‑1潜伏感染细胞模型中发现敲低CBX4，GFP基因表达上调，HIV‑1能够被有效激活。在TZM‑bl细胞中过表达CBX4蛋白能够有效降低HIV‑1的LTR的转录活性。进一步检测发现CBX4蛋白表达降低会降低HIV‑1 LTR的H3K9三甲基化，H3K27三甲基化的富集程度，从而激活HIV‑1潜伏感染。CBX4作为全新HIV‑1潜伏感染激活靶点在HIV‑1潜伏感染的激活方面具有重要的研发价值和开发意义。

权利要求

1.CBX4在制备激活HIV-1潜伏感染药物靶点的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体为将抑制CBX4基因的shRNA、siRNA制备成HIV-1潜伏感染激活剂。

说明书

CBX4作为HIV-1潜伏感染激活靶点的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及疾病相关功能靶点技术领域，具体地，涉及HIV-1潜伏感染激活靶点技术领域，更具体地，涉及CBX4作为HIV-1潜伏感染激活靶点的应用。

背景技术

[0002] HIV-1病毒是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，它通过攻击人体T淋巴细胞，破坏人体免疫系统，最终导致获得性免疫缺陷综合征“艾滋病”的产生。该病毒最初发现于1981年，在此之后的三十余年研究人员一直致力于对该病毒控制及清除，期望能够治愈该疾病。目前的常规治疗方法为简称cART的联合抗逆转录病毒疗法，该治疗方法能够有效的抑制病毒的复制，从而将病人外周血中的病毒载量控制到较低的水平。但是目前的通用治疗方法只能够在一定程度上控制病毒，并不能有效的清除。究其原因是因为HIV-1可潜伏在细胞内形成HIV-1储藏库，常规药物不能影响这些储藏库，并且病人一旦停止治疗，它们会因为各种原因被激活，从而导致病情反复。综上所述，HIV-1储藏库的存在已成为HIV-1治愈的巨大障碍，如何有效的清除HIV-1储藏库是目前HIV-1领域的研究热点之一。当今的主流方法“shock and kill”是采用先激活后杀灭的思路。因此，研发安全、高效的HIV-1潜伏感染激活剂是当前亟待解决的问题之一。目前已有多种HIV-1潜伏感染激活剂被开发，根据它们的作用靶点可以分为以下几种类型，包括：组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)、组蛋白甲基转移酶抑制剂（HMTi）、DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTi）、蛋白激酶C激活剂（PKC）、Bromodomain抑制剂。

[0003] CBX4属于CBX蛋白家族，是多梳蛋白复合体PRC1的重要组分。CBX蛋白家族包括：CBX2，CBX4，CBX6，CBX7，CBX8五个成员。它们的N端拥有一个CHROMO结构域，这个结构域具有H3K27三甲基化的结合能力；C端有一个保守区域叫做C-Box，它负责PRC1复合体的组装。其中CBX4不仅对H3K27三甲基化有一定的亲和性，其与H3K9三甲基化也表现出显著的亲和力。
现有技术中报道的CBX4的功能主要为参与调控个体发育、干细胞分化以及肿瘤的发生。截至目前为止尚未有研究未公开CBX4是一个全新的HIV-1潜伏感染激活作用靶点。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供CBX4作为HIV-1潜伏感染激活全新靶点的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

[0005] 本发明通过研究发现抑制CBX4具有良好的HIV-1潜伏激活能力。本发明通过敲低TZM-bl细胞中的CBX4基因的表达量，使用双荧光素酶报告基因检测HIV-1的LTR的转录水平，结果发现敲低CBX4能够有效促进HIV-1 LTR的转录。本发明继而在J-lat 10.6 HIV-1潜伏感染细胞模型中有效敲低CBX4蛋白的表达情况，发现J-lat10.6细胞能够有效被激活，GFP基因表达上调。本发明还构建CBX4表达质粒，在TZM-bl细胞中过表达CBX4蛋白，双荧光素酶报告基因检测发现，随着CBX4蛋白表达增加，HIV-1的LTR的转录活性相应降低，两者的关系存在浓度梯度效应。进一步检测发现CBX4蛋白表达降低会降低HIV-1 LTR H3K9三甲基化，H3K27三甲基化的富集程度，从而激活HIV-1潜伏感染。所以，本发明要求保护CBX4作为HIV-1潜伏感染激活靶点的应用。

[0006] 因为CBX4可以作为HIV-1潜伏感染激活靶点，所以，抑制CBX4基因或CBX家族基因的化合物或其衍生物，或降解CBX4蛋白或CBX家族蛋白的化合物或其衍生物可以制备成HIV-1潜伏感染激活剂。

[0007] 所述衍生物为化合物在药学上可接受的盐或酯。

[0008] 所述药学上可接受的盐为钠、钾、钙、铁、亚铁或锌盐。

[0009] 所述药学上可接受的酯为乙酯或丁酯。

[0010] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0011] 本发明首次发现CBX4可以作为HIV-1潜伏感染激活靶点，为进一步研发HIV-1相关药物提供了强有力的理论基础和实践基础。

附图说明

[0012] 图1为高效敲低TZM-bl细胞中的CBX4基因的表达，能够有效促进HIV-1 LTR的转录活性，其中，图A为通过q-PCR检测si-CBX4在该细胞系中的敲低效率；图B为利用双荧光素酶报告基因检测LTR转录活性并进行分析。

[0013] 图2为使用shRNA-CBX4敲低J-lat 10.6 HIV-1潜伏感染细胞中的CBX4基因能够有效激活HIV-1潜伏感染储存库，其中，图A为利用q-PCR检测shRNA-CBX4在J-lat 10.6细胞系中敲低CBX4的效率；图B为运用流式细胞术检测CBX4敲低后，该细胞模型中HIV-1潜伏感染的激活效果。

[0014] 图3为构建CBX4表达质粒，在TZM-bl细胞中过表达CBX4蛋白能够抑制HIV-1的LTR的转录，其中，图A为通过Western Blot技术检测构建的pcDNA3.1-CBX4-FLAG过表达质粒的表达效果；图B为利用双荧光素酶报告基因检测随着LTR转录活性与CBX4过表达之间的梯度效应。

[0015] 图4为CBX4蛋白表达降低会降低HIV-1 LTR的 H3K9三甲基化（图A），H3K27三甲基化（图B）的富集程度，从而激活HIV-1潜伏感染。

具体实施方式

[0016] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0017] 实施例1

[0018] 敲低CBX4基因表达能够有效促进HIV-1 LTR的转录活性，具体实验方法如下：

[0019] (1) 取生长良好的TZM-bl细胞，接种于24孔板中。使用的培养基是完全培养基：高糖DMEM，10%胎牛血清以及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37℃；

[0020] (2) 24h贴壁后，分别共同转染pcDNA3.1-Tat质粒和siRNA-CBX4或siRNA-NC，如1）的条件继续培养；

[0021] (3) 48h后，收取细胞沉淀，取一种一部分使用Trizol法提取RNA，反转获得cDNA，使用CBX4特异性Q-PCR引物检测CBX4的mRNA表达水平，确定siRNA-CBX4的敲低效率；

[0022] (4) 取剩余细胞，裂解后利用双荧光素梅报告基因检测方法，检测不同转染处理组中的HIV-1 LTR的转录活性；

[0023] (5) 对比CBX4敲低后，HIV-1 LTR的转录活性。

[0024] 实验结果如图1所示。从图中可以看出，在TZM-bl细胞中，siRNA-CBX4能够有效敲低细胞内源的CBX4基因，其敲低效率大约为80%左右。对比发现，敲低CBX4能够有效的提升HIV-1 LTR的转录水平。

[0025] 实施例2

[0026] 抑制J-lat 10.6 HIV-1潜伏感染细胞中的CBX4有效激活HIV-1潜伏感染储存库，具体实验方法如下：

[0027] (1) 合成特定碱基序列，退火构建针对CBX4的shRNA，PLKO.1-CBX4并测序确认序列正确。

[0028] (2) 取生长良好的人肾上细胞株239T细胞，接种于10cm平底板中。使用的培养基是完全培养基：高糖DMEM，10%胎牛血清以及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37℃；

[0029] (3) 24h贴壁后，转染PLKO.1-CBX4或PLKO.1-NC和psPAX2 、VSV-G至细胞中，如2）的条件继续培养；

[0030] (4) 48h后，收取上清，使用PEG-6000离心浓缩病毒颗粒，使用ELISA P24试剂盒检测病毒P24；

[0031] (5)取生长良好的J-lat10.6细胞，计数后，用4）中得到的病毒进行感染，病毒用量约为每一个10cm板中的病毒感染2-3×106 /ml细胞；（感染时使用促感染试剂polybrene）；

[0032] (6) 感染6h后换液，使用PBS清洗三次，弃上清，使用1640培养基（10%胎牛血清，1%双抗）培养，培养条件是5%二氧化碳、37℃；

[0033] (7) 第二天，在培养基中加入适量嘌呤霉素，浓度约为1-2μg/ml，5%二氧化碳、37℃培养2周，定期更换含有嘌呤霉素的1640培养基，以获得稳定感染shRNA-CBX4的J-lat 10.6细胞；

[0034] (8) 取部分细胞使用Trizol裂解提RNA,反转获得cDNA，使用CBX4特异性Q-PCR引物检测CBX4的mRNA表达水平；

[0035] (9) 使用流式细胞仪检测相应细胞的GFP表达水平，并作统计图分析结果。

[0036] 实验结果如图2所示。从图中可以看出，在J-lat 10.6 HIV-1潜伏感染细胞有效敲低CBX4后能够有效激活HIV-1潜伏感染储存库。

[0037] 实施例3

[0038] 在TZM-bl细胞中过表达CBX4蛋白能够抑制HIV-1的LTR的转录活性，具体实验方法如下：

[0039] (1) 订购CBX4 cDNA质粒模板，设计合适的引物，构建CBX4过表达质粒，pcDNA3.1-CBX4-FLAG；

[0040] (2) 取生长良好的TZM-bl细胞铺于6孔透明板中，每孔1×106细胞,使用的培养基是完全培养基：高糖DMEM，10%胎牛血清以及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37℃；

[0041] (3) 24h贴壁后，转染pcDNA3.1-CBX4-FLAG质粒，如2）的条件继续培养；

[0042] (4) 48h后，收取细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞，通过western blot检测CBX4过表达水平，确定pcDNA3.1-CBX4-FLAG过表达质粒的效果；

[0043] (5) 取生长良好的TZM-bl细胞铺于24孔透明板中，每孔1×105细胞，使用的培养基是完全培养基：高糖DMEM，10%胎牛血清以及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37℃；

[0044] (6) 24h贴壁后，分别转染不同浓度的pcDNA3.1-CBX4-FLAG质粒和pcDNA3.1-Tat质粒，pcDNA3.1-CBX4-FLAG梯度设定从0-500ng，用pcDNA3.1调节质粒的一致性，如2）的条件继续培养；

[0045] (7) 48h后，收取细胞，使用裂解液裂解利用双荧光素梅报告基因检测方法，检测不同转染处理组中的HIV-1 LTR的转录活性。

[0046] 实验结果如图3所示。从图中可以看出，随着CBX4蛋白表达量的上升，HIV-1 LTR的转录活性逐渐降低。

[0047] 实施例4

[0048] CBX4蛋白表达降低会降低HIV-1 LTR的 H3K9三甲基化，H3K27三甲基化的富集程度，具体实验方法如下：

[0049] (1)取生长良好的TZM-bl，接种于10cm平底板中。使用的培养基是完全培养基：高糖DMEM，10%胎牛血清以及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37℃；

[0050] (2) 24h贴壁后，分别共同转染pcDNA3.1-Tat质粒和siRNA-CBX4或siRNA-NC，如1）的条件继续培养；

[0051] (3) 48h后，收取细胞沉淀，利用H3K9三甲基化和H3K27三甲基化ChIP抗体，通过ChIP检测HIV-1 LTR的H3K9三甲基化和H3K27三甲基化的富集程度；

[0052] (4)取生长良好的J-lat10.6细胞，计数后用shRNA-SCR和shRNA-CBX4分别感染细胞，病毒用量约为每一个10cm板中的病毒感染2～3×106 /ml细胞；（感染时使用促感染试剂polybrene）；

[0053] (5)感染6h后换液，使用PBS清洗三次，弃上清，使用1640培养基（10%胎牛血清，1%双抗）培养，培养条件是5%二氧化碳、37℃；

[0054] (6)第二天，在培养基中加入适量嘌呤霉素，浓度约为1～2μg/ml，5%二氧化碳、37℃培养2周，定期更换含有嘌呤霉素的1640培养基，以获得稳定感染shRNA-CBX4的J-lat 10.6细胞;

[0055] (7)收取细胞沉淀，利用H3K9三甲基化和H3K27三甲基化ChIP抗体，通过ChIP检测HIV-1 LTR的H3K9三甲基化和H3K27三甲基化的富集程度；

[0056] (8)对比分析，CBX4敲低前后对HIV-1 LTR的H3K9三甲基化和H3K27三甲基化的富集程度。

[0057] CBX4是HIV-1潜伏感染激活的有效靶点，抑制CBX4（及CBX家族）基因或降解CBX4（及CBX家族）蛋白的化合物及其衍生物，特别是其为药学可接受的盐、酯，如其钠、钾、钙、铁、亚铁、锌盐、乙酯、丁酯等同样可以激活HIV-1潜伏感染，便于HIV的后续治疗。