里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S、编码基因及其在培育抗重金属植物中的应用

摘要

本发明提供了里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S、编码基因以其在抗重金属上的应用，属于生态环境保护领域。本发明将里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2编码基因，经过人工化学合成得到TrCRD2S基因，将所述基因转入植物中得到这种转基因植物，其抗金属能力有较大的提高。所述TrCRD2编码基因按植物偏爱密码合成含357个碱基，编码的氨基酸114个；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明中所述种里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因在培育抗重金属植物中的应用。

权利要求

1.里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因或植物双元载体在培育抗重金属植物中的应用；

所述里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述植物双元载体包括所述的里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因和连接在所述里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因两端的烟草的染色质附着SAR序列；

所述重金属为铜离子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述培育的方法采用农杆菌介导法将所述种里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因或所述植物双元载体转化入宿主植物中。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铜离子的摩尔浓度不高于50μmol/L。

说明书

里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S、编码基因及其在培育抗重金属

植物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生态环境保护领域，具体涉及里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S、编码基因及其在培育抗重金属植物中的应用。

背景技术

[0002] 世界范围内，由于人类活动，比如矿业、工业等引起土壤中重金属污染。当植物遭遇重金属胁迫时，不同的物种使用不同的策略来应对重金属诱导的胁迫压力。根据物种使用策略的不同，可以将其分为四类：1)、重金属敏感型物种；2)、排除重金属的抗逆物种；3)、对重金属忍耐而不富集物种；4)、对重金属耐受又超富集物种。每个物种都有不同的分子机制来应对重金属胁迫压力或者降低重金属对其的毒性。植物应对重金属胁迫时，进行分子水平上的调控过程被称为体内金属平衡，包含ROS调控的信号途径。ROS信号的产生对重金属的解毒和忍耐非常重要。在过量重金属的环境中，植物的生物量降低、叶枯黄、根的生长受到抑制，其形态也发生改变，过度的重金属，还会造成植物的死亡。由于重金属元素具有难降解、易积累、毒性大等缺点，还能被植物富集吸收、进入食物链，从而危害人、畜、鸟等各种生命的健康。铜污染土壤环境铜污染日益严重,植物的铜毒害问题逐渐显现，亟需开发一种经济可行环保的方法对其进行研究修复，恢复土壤生态环境。

发明内容

[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种葡里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S及其编码基因，所述里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S及其编码基因具有提高植物的抗重金属的功能。

[0004] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0005] 本发明提供了一种里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S，具有序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

[0006] 本发明提供了一种里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因，具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

[0007] 本发明提供了一种植物双元载体，包括所述的里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因和连接在所述里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因两端的烟草的染色质附着SAR序列。

[0008] 本发明还提供了所述的里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因在培育抗重金属植物中的应用。

[0009] 优选的，所述植物包括拟南芥。

[0010] 优选的，所述重金属为离子态重金属，所述离子态重金属包括铜离子。

[0011] 优选的，所述培育的方法采用农杆菌介导法将所述葡里氏木霉金属硫蛋白编码基因TrCRD2S转化入宿主植物中。

[0012] 优选的，所述铜离子的摩尔浓度不高于50μmol/L。

[0013] 本发明了里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S及其编码基因，并将所述编码基因用于抗重金属植物的培育，得到了具有较高抗金属能力的转基因植物。为了进一步分析所述基因在重金属逆境中的作用与功能，比较转TrCRD2S编码基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。结果表明，转TrCRD2S编码基因拟南芥植株和野生型在表型上有很大的差异；同时在50μM浓度的Cu2+浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制，根系变短，叶片稀少，而转基因株系抑制较小，这说明TrCRD2S编码基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力。

附图说明

[0014] 图1为本发明中拟南芥转化的植物表达载体示意图；

[0015] 图2为实施例5转TrCRD2S基因拟南芥的GUS染色图；

[0016] 图3为实施例6拟南芥对铜离子处理的表型图；图3-A是转TrCRD2S基因拟南芥经铜离子处理后的表型图；图3-B是野生型拟南芥经铜离子处理后的表型图。

具体实施方式

[0017] 本发明提供了一种里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S，具有序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

[0018] 本发明中，所述里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S的合成方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的合成方法即可。

[0019] 本发明提供了一种里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因，具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

[0020] 本发明中，所述里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因的合成方法优选采用人工方法合成。所述人工方法包括以下步骤：

[0021] 依照PTDS(PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS)方法进行源自里氏木霉金属硫蛋白编码基因TrCRD2S的化学合成，在保持TrCRD2S基因的氨基酸序列不变的基础上，合成基因编码区，根据得到的基因编码区核苷酸序列设计引物扩增得到TrCRD2S基因。

[0022] 本发明中，所述合成基因编码区的设计原则包括以下部分：

[0023] (一)优化基因密码子，提高基因翻译效率；

[0024] (二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；

[0025] (三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；

[0026] (四)使基因编码蛋白符合N端原则(Tobias 1991)，以提高翻译蛋白的稳定性；

[0027] (五)设计提高基因5’端的自由能，以提高基因翻译起始效率。

[0028] 本发明还提供了一种植物双元载体，pcAMBIA-1301载体中包含所述的里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因和连接在所述里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因两端的烟草的染色质附着SAR序列。

[0029] 本发明中，所述植物双元载体的构建方法，包括以下步骤：

[0030] ①将pcAMBIA-1301载体在BamHI和Sacl酶的作用下进行酶切，得到酶切后的线性pcAMBIA-1301载体；

[0031] ②里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因的两端添加BamHI和Sacl酶切位点；

[0032] ③在所述步骤②中得到的具有BamHI和Sacl酶切位点的里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因的两端添加上烟草的染色质附着SAR序列，以保证转基因的稳定遗传，得到两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元；

[0033] ④将所述步骤①得到的线性pcAMBIA-1301载体和所述步骤③得到的两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元连接，得到植物双元载体。

[0034] 本发明中，所述植物双元载体中外源基因的表达由双CAMV355启动子和TMV omega leader序列控制。所述双CAMV355启动子和TMV omega leader序列同SAR序列一同连接到外源基因中。

[0035] 在本发明中，通过将扩增里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因的引物中添加BamHI和Sacl酶切位点，使扩增得到的里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因连接上BamHI和Sacl酶切位点。扩增TrCRD2S基因的引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列为GGATCCATGACTACTGC AAAGGCATCCACT(SEQ ID No.3)。所述反向引物的的核苷酸序列为GAGC TCTTAGAATTCTTTGGAGTAGTTGGTGAA(SEQ ID No.4)。所述扩增程序为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，50s，72℃，2min，共25个循环。

[0036] 本发明对所述酶切的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酶切方法即可。

[0037] 本发明对所述载体和表达单元连接没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接方案即可。

[0038] 本发明还提供了所述的里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因或所述的植物双元载体在培育抗重金属植物中的应用。

[0039] 本发明中，所述植物优选包括拟南芥。

[0040] 本发明中，所述重金属优优选为离子状态重金属，所述离子状态重金属包括铜离子。所述铜离子的摩尔浓度不高于50μmol/L，更优选为5～40μmol/L。

[0041] 本发明中，所述培育的方法优选采用农杆菌介导法将所述里氏木霉金属硫蛋白及其编码基因TrCRD2S或所述植物双元载体转化入宿主植物中。

[0042] 本发明中，所述农杆菌介导法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培育方法即可。

[0043] 本发明中，培育后的抗重金属植物优选进行抗重金属功能验证。所述验证方法为将培育后的抗重金属植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子；将所述种子播种后，在22℃条件下生长两周，得到转基因培养皿小苗；将野生型和转基因培养皿小苗进行抗重金属实验。本发明对所述抗重金属实验的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的抗重金属实验即可。

[0044] 转TrCRD2S基因拟南芥和野生型植株在表型上有很大的差异。结果显示在50μM浓度的Cu2+浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制，根系平均长度为0.5cm，叶片稀少，而转基因株系平均根长1.1cm，抑制较小。说明TrCRD2S基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力。

[0045] 下面结合实施例对本发明提供的里氏木霉金属硫蛋白及其编码基因其TrCRD2S、植物双元载体和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0046] 本发明所用的试验材料及其来源如下：

[0047] 野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)和生态型拟南芥Columbia在23℃人工气候室培养，16h光照培养，光照强度为130μmol/(㎡·s)。

[0048] 克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。

[0049] 所有的化学试剂购买自美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂。

[0050] 测序试剂盒购自美国应用系统公司的ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒。

[0051] 本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛－奥德里奇(Sigma－Aldrich)。

[0052] 实施例1

[0053] 里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S基因的人工合成

[0054] 根据Genbank登录的里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S基因序列，用以基因合成方法【Nucleic Acids Research,2004,32,e98】，在不改变基因编码的氨基酸序列的前提下，按以下原则进行合成基因编码区的设计：(一)优化基因密码子，提高基因翻译效率。(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。(四)使基因编码蛋白符合N端原则(Tobias 1991)，以提高翻译蛋白的稳定性。(五)设计提高基因5’端的自由能，以提高基因翻译起始效率。

[0055] 所述基因的扩增引物为(所述正向引物的的核苷酸序列为

[0056] GGATCCATGACTACTGCAAAGGCATCCACT(SEQ ID No.3)。

[0057] 所述反向引物的的核苷酸序列为(SEQ ID No.4)

[0058] GAGCTCTTAGAATTCTTTGGAGTAGTTGGTGAA。

[0059] 扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，50s，72℃，2min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。

[0060] PCR结束后，1％琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆。

[0061] 实施例2

[0062] 里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S农杆菌双元载体的构建

[0063] 上述人工合成的TrCRD2S基因的阳性克隆用引物经PCR扩增后头尾分别加入Bam HI和Sac I切点，经Bam HI+Sac I双酶切，回收DNA片段与经上述限制酶双酶切后的pcAMBIA-1301载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体(见图1)。

[0064] 实施例3

[0065] 电击法转化农杆菌

[0066] 1)制备农杆菌GV3101感受态，方法参照MicroPulserTM Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)((Raineri et al.,Bio.Tech.,1990,8:33-38)。

[0067] 2)取50μL GV3101感受态细胞，加入1μL DNA，转入0.2cm电击杯转化(400Ω，2.5KV，25μf)。加入1mL含有1％甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28℃，250rpm)。分别取10μL、100μL涂LB平板(利福平50μg/mL，庆大霉素50μg/mL，氯霉素100μg/mL)。

[0068] 3)挑取几个克隆，碱法抽提农杆菌质粒，经农杆菌质粒经过酶切鉴定和PCR检测，得到阳性转化子。

[0069] 实施例4

[0070] 农杆菌介导转化拟南芥

[0071] A拟南芥的培养

[0072] 1)拟南芥种子在4℃进行2～3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期的提前。

[0073] 2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9：3：0.5的比例拌匀，经高温灭菌后装于10cm的塑料小盆，以营养液PNS浸湿待用。

[0074] 3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22℃暗培养2－3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22℃培养室中进行16小时光照培养。

[0075] 4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2－10cm(少数已经开花)可用于转化(参见文献：何玉科，巩振辉，细跑生物学杂志,1991,13(3):97-101)。

[0076] B农杆菌的准备

[0077] 1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养20小时。(Rashid et al.,1996)

[0078] 2)取1mL菌液转接入20－30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养约12小时，测OD600≈1.5。

[0079] 3)在8000rpm，4℃的条件离心10min，收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD600≈0.8。

[0080] C拟南芥蘸花法转化

[0081] 1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3～5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22℃培养室低光强度下生长24小时，即可正常培养。

[0082] 2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花发育的不同时期进行转化，提高转化效率。

[0083] 3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。

[0084] 实施例5

[0085] 拟南芥转化植株种子的筛选

[0086] 1)称25－30mg种子放入1.5mL离心管。

[0087] 2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒，去上清。

[0088] 3)加入1mL过滤后的漂白粉消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5秒，去上清。

[0089] 4)无菌水洗涤3～4次。

[0090] 5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(Hyg 50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16小时光照培养6天。

[0091] 6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T1)继续培养，并收集种子进行T2代和T3代筛选。

[0092] 实施例6

[0093] 转基因阳性植株的检测

[0094] 按Jefferson(1978)的方法，将待测拟南芥叶片样品与X-Gluc染色反应液(50m mol/L NaH2PO4，pH 7.0；0.5m mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1％Triton X-100，20％甲醇，0.5mg/mL X-Gluc[X-glucuronide])于37℃保温2～4小时后，用75％乙醇脱色观察。

[0095] 由图2可以看出，离心管里叶片部分为蓝色，说明拟南芥叶片样品为转基因阳性植株。

[0096] 实施例7

[0097] 里氏木霉金属硫蛋白TrCRD2S编码基因转化植物后的抗重金属分析

[0098] 将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22℃生长两个星期。然后将转基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株在含有50μM浓度的Cu2+浓度的溶液环境中生长，比较了转TrCRD2S基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。由于重金属首先抑制的根的生长，因此将根长作为比较指标。

[0099] 结果如图3所示，结果表明，转TrCRD2S基因拟南芥和野生型植株在表型上有很大的差异。结果显示在50μM浓度的Cu2+浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制，根系平均长度0.5cm，叶片稀少，而转基因株系平均根长1.1cm，抑制较小。说明TrCRD2S基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力。

[0100] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。