一种山银花多糖的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种山银花多糖的制备方法，将山银花进行乙醇脱脂、晾干后，用沸水提取，提取液加热浓缩后进行透析，得到的透析内液加热浓缩后，在冰浴条件下加入15v％的三氯乙酸搅拌均匀，用氢氧化钠中和后离心，去除沉淀，取上清液透析，然后往得到的透析内液中加入80％乙醇，静置过夜后离心，收集沉淀，干燥后得水提山银花粗多糖，将其进一步用DEAE纤维素阴离子柱、Sephacryl S‑200HR柱纯化，即得。本发明的制备方法工艺简单，操作方便，制得的山银花多糖山银花多糖可显著抑制HMEC‑1细胞管腔的形成，尤其当该多糖浓度为13.5μM时，对HMEC‑1细胞管腔形成具有较强的抑制作用，可开发为抗血管生成的药物。

权利要求

1.山银花多糖在制备抗血管生成的药物中的应用，所述山银花多糖的制备方法包括如下步骤：(1)多糖提取：将山银花进行乙醇脱脂后，晾干，然后用沸水提取2-6次，每次提取3-5h，合并提取液，加热浓缩后得浓缩液，进行透析，将得到的透析内液加热浓缩后，在冰浴条件下加入三氯乙酸搅拌均匀，使透析内液中三氯乙酸的浓度为15g/100mL，然后用氢氧化钠中和后离心，去除沉淀，取上清液透析两天，然后往得到的透析内液中加入80％乙醇，静置过夜后离心，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，最后置于真空干燥箱中干燥，得水提山银花粗多糖；

(2)多糖纯化：将水提山银花粗多糖用DEAE纤维素阴离子柱进行分步纯化，依次用H2O、

0.1M NaCl和0.2M NaCl洗脱，收集0.2M NaCl洗脱组分进行透析，将透析内液冷冻干燥得中间产物，将中间产物经Sephacryl S-200HR柱纯化，用0.2M NaCl洗脱，收集洗脱液进行透析，取透析内液冷冻干燥，即得山银花多糖。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇脱脂的方法是：将山银花置于浓度为95％的乙醇中浸泡7天。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述透析是将浓缩液装入透析袋中，用流动水透析两天。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述离心操作的转速为8000-

10000rpm，时间为10-25min。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中,透析内液和80％乙醇的体积比为

1:4。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述真空干燥的温度为45-55℃。

7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述透析采用的是MW＝3500Da的透析袋，用纯净水进行透析。

说明书

一种山银花多糖的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种山银花多糖的制备方法，属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 血管生成是指在已存在的毛细血管网络中生长出新血管的过程，在伤口愈合、风湿性关节炎、肿瘤生长和多种皮肤疾病中均有新的血管生成。血管生成在多种疾病发生中的重要作用提示我们抑制血管生成也许在这些疾病的治疗中有积极地意义。

[0003] 自20世纪70年代，Folkman提出血管生成对肿瘤的发生发展转移有重要作用，并提出通过抑制血管形成，从而限制肿瘤获得氧供和营养物质而饿死肿瘤来治疗肿瘤的思路。

[0004] 多糖为大分子物质，广泛分布在各种生物体中，具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，调节免疫力，降血压，降血脂，降胆固醇，降血糖等作用。作用机制具有多效应，多靶点，多层面，多途径等特点。多糖具有毒副作用低，来源广泛，安全性高等优点，研究已经引起广泛的关注。

[0005] 现有技术研究报道，很多多糖、寡糖或其衍生物都具有抗血管生成的活性，其中糖胺聚糖类(如肝素)和岩藻聚糖类占有大部分，其它类多糖的抗血管生成活性报道较少。对于山银花多糖目前鲜有研究。现有研究报导了山银花多糖(灰毡毛忍冬)具有的抗氧化活性，但其制备方法及其在抗管腔形成方面的作用，未见报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种山银花多糖的制备方法，工艺简单，操作方便，制得的山银花多糖能抑制HMEC-1细胞管腔形成，可开发为抗血管生成的药物。

[0007] 技术方案

[0008] 一种山银花多糖的制备方法，包括如下步骤：

[0009] (1)多糖提取：将山银花进行乙醇脱脂后，晾干，然后用沸水提取2-6次，每次提取3-5h，合并提取液，加热浓缩后得浓缩液，进行透析，将得到的透析内液加热浓缩后，在冰浴条件下加入三氯乙酸搅拌均匀，使透析内液中三氯乙酸的浓度为15g/100ml，然后用氢氧化钠中和后离心，去除沉淀，取上清液透析两天，然后往得到的透析内液中加入80％乙醇，静置过夜后离心，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，最后置于真空干燥箱中干燥，得水提山银花粗多糖；

[0010] (2)多糖纯化：将水提山银花粗多糖用DEAE纤维素阴离子柱进行分步纯化，依次用H2O、0.1M NaCl和0.2M NaCl洗脱，收集0.2M NaCl洗脱组分进行透析，将透析内液冷冻干燥得中间产物(初步纯化的多糖LF-02)，将中间产物经Sephacryl S-200HR柱纯化，用0.2M NaCl洗脱，收集洗脱液进行透析，取透析内液冷冻干燥，即得山银花多糖(LF-02-2)。

[0011] 进一步，步骤(1)中，所述乙醇脱脂的方法是：将山银花置于浓度为95％的乙醇中浸泡7天。

[0012] 进一步，步骤(1)中，所述透析是将浓缩液装入透析袋中，用流动水透析两天。步骤(1)中两次透析的方法相同。

[0013] 进一步，步骤(1)中，所述离心操作的转速为8000-10000rpm，时间为10-25min。步骤(1)中两次离心的转速和时间相同。

[0014] 进一步，步骤(1)中，透析内液和80％乙醇的体积比为1:4。

[0015] 进一步，步骤(1)中，所述真空干燥的温度为45-55℃。

[0016] 进一步，步骤(2)中，所述透析采用的是MW＝3500Da的透析袋，用纯净水进行透析。步骤(2)中两次透析的方法相同。

[0017] 进一步，步骤(2)中，所述冷冻干燥在真空冷冻干燥器内进行。

[0018] 上述制备方法制得的山银花多糖在抗血管生成的药物中的应用，当该多糖浓度为13.5μM时，对HMEC-1细胞管腔形成具有较强的抑制作用，可用于制备抗血管生成的药物。

[0019] 有益效果：经高效凝胶过滤色谱法(HPGPC)测定，得出该山银花多糖的重均分子量为74.1kDa，含有的鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖的比例为10.4:14.9:6.7:68.0。用碘甲烷进行反应至多糖完全甲基化，后完全酸水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后进行GC分析。结合甲基化结果、核磁、文献确定该糖由1,2-Rhap和1,4-GalpA交替连接构成主链，并部分鼠李糖在C4位被分支取代。药理实验表明，山银花多糖可显著抑制HMEC-1细胞管腔的形成，尤其当该多糖浓度为13.5μM时，对HMEC-1细胞管腔形成具有较强的抑制作用，可开发为抗血管生成的药物。

附图说明

[0020] 图1为实施例1制得的山银花多糖的13C NMR谱图；

[0021] 图2为实施例1制得的山银花多糖的降解产物的13C NMR谱图；

[0022] 图3为实施例1制得的山银花多糖抑制HMEC-1细胞管腔形成的电镜图。

具体实施方式

[0023] 本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但不限制本发明的内容。需要说明的是：下述实施例中，山银花原料购于贵州遵义。透析所用膜为普通级实验用透析膜。DEAE-纤维素填料购自Whatman公司，Sephacryl S-200HR填料购于GE Healthcare公司。

[0024] 实施例1

[0025] (1)多糖提取：将山银花置于浓度为95％的乙醇中浸泡7天，倾去乙醇后置于通风处晾干。用沸水提取，每次提取4h，苯酚硫酸法检测提取液的糖含量，至糖反应不明显为止，共计提取6次。合并提取液，加热浓缩后得浓缩液，装于透析袋中，对流动水透析2天，将得到的透析内液加热浓缩后，在冰浴条件下加入三氯乙酸搅拌均匀，使透析内液中三氯乙酸的浓度为15g/100ml，然后用氢氧化钠中和后离心(转速为9000rpm，时间为20min)，去除沉淀，取上清液透析两天，然后往得到的透析内液中加入80％乙醇，静置后离心(转速为9000rpm，时间为20min)，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，最后置于45℃真空干燥箱中干燥，得水提山银花粗多糖。

[0026] (2)多糖纯化：将上述水提山银花粗多糖用DEAE纤维素阴离子柱进行分步纯化，依次用H2O、0.1M NaCl和0.2M NaCl洗脱，收集0.2M NaCl洗脱组分，用透析袋(MW＝3500Da)和纯水进行透析，透析内液冷冻干燥(在真空冷冻干燥器内进行)得多糖LF-02，LF-02再经Sephacryl S-200HR柱纯化，用0.2M NaCl洗脱，收集洗脱液进行透析，取透析内液冷冻干燥，即得山银花多糖(LF-02-2)。

[0027] 经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测得山银花多糖(LF-02-2)重均分子量为74.1kDa。将其进行单糖组成分析，结果显示，含有的鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖的比例为10.4:14.9:6.7:68.0。

[0028] 将制得的山银花多糖进行甲基化和核磁分析：

[0029] 甲基化分析结果显示：该山银花多糖LF-02-2由T-Araf(19.6％),1,5-Araf(20.3％),T-Galp(13.7％),1,4,6-Galp(23.7％),1,2-Rhap(9.9％),1,2,4-Rhap(12.8％)组成。该多糖被还原为LF-02-2-R后，由T-Araf(19.7％),1,5-Araf(16.8％),T-Galp(8.2％),1,4,6-Galp(21.3％),1,2-Rhap(7.2％),1,2,4-Rhap(10.7％),1,4-Galp(15.3％)组成。对比还原前后连接方式，得出半乳糖醛酸的连接方式为1,4-GalpA。由于在甲基化过程中阿拉伯糖易发生降解，所以使得阿拉伯糖的含量和原糖相比降低。

[0030] LF-02-2-1由T-Galp(40.2％),1,2-Rhap(12.1％),1,2,4-Rhap(47.8％)组成。LF-02-2-1被还原后由T-Galp(25.8％),1,4,6-Galp(3.2％),1,2-Rhap(22.3％),1,2,4-Rhap(32.5％),1,4-Galp(16.2％)组成。对比还原前后连接方式，再次验证半乳糖醛酸的连接方式为1,4-GalpA。

[0031] 图1为实施例1制得的山银花多糖(LF-02-2)的13C NMR谱图，由图1可以看出，异头碳区域内，δ108.67、δ108.41、δ104.64、δ105.62、δ98.77、δ99.02、δ99.91信号分别归属于T-α-Araf、1,5-α-Araf、T-β-Galp、1,4,6-β-Galp、1,4-α-GalpA、1,2-α-Rhap、1,2,4-α-Rhap。δ175.42信号归属于1,4-α-GalpA羧基碳的信号峰。

[0032] 图2为实施例1制得的山银花多糖的降解产物(LF-02-2-1)的13C NMR谱图，可以看出，异头碳区域内，δ99.06,δ99.67,δ104.67,δ98.74信号分别归属于1,2-α-Rhap,1,2,4-α-Rhap,T-β-Galp，1,4-α-GalpA，δ105.59信号可能是1,4,6-β-Galp C1,δ175.92信号归属于1,4-α-GalpA羧基碳的信号峰。

[0033] 实施例1制得的山银花多糖LF-02-2对HMEC-1细胞管腔形成的影响测试，方法如下：

[0034] a.HMEC-1细胞培养

[0035] HMEC-1细胞培养于MCDB131培养基中，培养基中添加15％FBS(V/V)，2mM L-谷氨酰胺，10ng/mL EGF和100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。HMEC-1细胞在5％CO2的培养箱中37℃恒温培养。

[0036] b.HMEC-1细胞管腔形成实验

[0037] 将基质胶(50μL)在4℃下解冻，之后加入到4℃预冷的96孔板中，37℃固化30min。将含有不同浓度(0μM,0.5μM,1.5μM,4.5μM,13.5μM)的LF-02-2多糖和HMEC-1细胞(4×104个)的MCDB131培养液(100μL)加入基质胶中。细胞在5％CO2培养箱中37℃培养过夜。用倒置显微镜拍摄记录，放大倍数为4×。

[0038] 图3为实施例1制得的山银花多糖抑制HMEC-1细胞管腔形成的电镜图，从图3中可以看出，随着多糖浓度的增加，血管生成的抑制作用越明显。当多糖浓度为13.5μM时，多糖对血管生成有明显的抑制作用。