同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸、试剂盒及方法

摘要

本发明涉及一组用于同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的核酸、试剂盒和检测方法，其中，用于多重PCR同时检测三种病原的核酸包括腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的上、下游引物；用于荧光定量PCR同时检测三种病原的核酸还包括有各病原对应的探针。本发明还建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌这三种病原的检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生，为能有效预防黄化病、溃疡病和叶斑病提供一种技术手段。

权利要求

1.一组用于多重PCR同时检测三种病原的核酸，其特征在于，包括用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的上、下游引物，其中，所述腐烂病菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

所述黄化病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；

所述丛簇病菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。

2.一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原的核酸，其特征在于，包括如权利要求1中所述的用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的上、下游引物及各病原体对应的探针，所述腐烂病菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；

所述黄化病植原体的探针序列如SEQ ID No.6所示；

所述丛簇病菌的探针序列如SEQ ID No.9所示。

3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的阳性扩增产物，其中，所述检测腐烂病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.10中第21-197bp所示的序列；

所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.11中第17-106bp所示的序列；

所述检测丛簇病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第20-219bp所示的序列。

4.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求2中所述的用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别标记TEXRED-BHQ2、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的阳性扩增产物，其中，所述检测腐烂病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.10中第21-197bp所示的序列；

所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.11中第17-106bp所示的序列；

所述检测丛簇病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第20-219bp所示的序列。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括Premix EX Taq×2。

7.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的检测方法，其特征在于，该方法用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原，具体包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用所述腐烂病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记TEXRED和BHQ2；所述黄化病植原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和TAMRA；所述丛簇病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和BHQ3；

(3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：

1×Premix EX Taq，

所述腐烂病菌上游引物、下游引物的终浓度为0.48μmol/L，探针的终浓度为0.4μmol/L；所述黄化病植原体上游引物、下游引物的终浓度为0.48μmol/L，探针的终浓度为0.4μmol/L；所述丛簇病菌上游引物、下游引物终浓度为0.64μmol/L，探针的终浓度为0.48μmol/L；

所述样品的DNA为2μL；

同时设置无核酸酶水为阴性对照；

同时分别设置包含如SEQ ID No.10所示的序列、SEQ ID No.11所示的序列、SEQ ID No.12所示的序列基因作为阳性对照。

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃，5min；扩增阶段95℃，15sec；59℃，25sec；72℃，35sec，45个循环；

72℃，7min；4℃保温。

10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为

35，当Ct值≤35时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40时，无明显扩增曲线为阴性结果。

说明书

同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸、试剂盒

及方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物检测技术，具体涉及一种用于同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

[0002] 腐烂病亦称腐朽病(decay)，又称烂皮病、臭皮病等，是果木极易产生的一种常见病，世界各地均有发生。腐烂病主要危害结果树的枝干，发病前期难以察觉，所以需要做好防治措施。发病初期从外表不易识别，如果掀开枝干的表皮，可见到暗褐色致红褐色湿润的小斑或黄褐色的干斑，有时，内部病变面积已较大了，而从外部仍不好识别。受害较重时皮层腐烂坏死，用手指按下即下陷。病皮极易剥离，烂皮层红褐色，湿腐状时有酒糟味。发病后期，病部失水干缩，变黑褐色下陷，并在上产生黑褐色小点粒，即病菌的分生孢子器，成为再发病的传染源。除侵染枝干外，有时也侵染果实。果实上病斑症状为暗红色的圆形或不规则形，有轮纹，边缘清晰。发病部位腐烂软化，略带酒糟味，病果表皮易剥离。

[0003] 丛簇病期叶片生长缓慢，有时只能长到正常的叶片的1/3大，叶片皱缩并散布有褪绿斑，随着植株生长，顶端叶片呈现丛簇状，并向下卷曲，有的叶片逐渐黄化，呈浅绿色或浅黄色，产生条斑或斑驳状。茎节间缩短，呈簇生状。

[0004] 黄化病是黄化植原体引起的病害，由过去的零星发病逐渐蔓延开来，感病初期被害叶轻度失绿变黄，但叶脉保持正常绿色，且一般由个别叶片失绿变黄，逐步蔓延到整个树冠，感病后期叶片变薄，枯萎缩小，枝条干枯，受害树逐渐枯死，造成了巨大的经济损失。植原体的检测方法有组织化学技术检测法和血清学方法，组织化学技术检测法是充分利用光学显微镜检查植物和介体昆虫体内植原体存在的有效手段，不是对植原体特异染色，只是对植原体的间接检测，容易造成假阳性。该方法与电子显微镜观察一样，在检测中都是结合症状特征，寄主范围以及抗生素实验进行的，费时费力，灵敏度低，而且只能证明待检植株是否感染植原体，无法区分不同的植原体，这些缺点限制了该类方法的应用，已经越来越不能满足现代生产的需要。

[0005] 血清学方法是利用抗原抗体反应对植原体进行检测，已建立的诊断技术有琼脂双扩散、酶联免疫吸附法(ELISA)、斑点酶联免疫法 (Dot-ELISA)、免疫荧光染色及免疫电镜技术等。虽然血清学分析技术比电镜检测技术更具特异性和灵敏性，但多数多克隆抗体却与健康植物寄主抗原存在强烈的交叉反应，导致检测结果不准确。

[0006] 苹果是世界上最重要的商品水果之一，我国是苹果的主产国，苹果产业在我国农村社会与经济中具有重要的地位和作用。近年来，苹果黄化病、腐烂病和丛簇病在我国苹果产区的发病率不断上升，三者复合侵染的情况越来越多，每年给我国苹果产业造成逾百亿元的经济损失。目前尚缺乏苹果黄化病、腐烂病和丛簇病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这四种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延此外，还要加强非疫区的管理，防止这几种病害的侵入，因此，针对导致苹果腐烂病、黄化病和丛簇病的病原菌进行检测，建立早期快速同时检测的方法就显得尤为重要。

发明内容

[0007] (一)要解决的技术问题

[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于多重PCR同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸，还提供了采用多重实时荧光定量PCR检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸、试剂盒及其检测方法。

[0009] (二)技术方案

[0010] 为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

[0011] 一组用于多重PCR同时检测三种病原的核酸，其包括用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的上、下游引物，其中，所述腐烂病菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

[0012] 所述黄化病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；

[0013] 所述丛簇病菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。

[0014] 一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原的核酸，其包括如上所述的腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原上、下游引物及各病原体对应的探针，其中，[0015] 所述腐烂病菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；

[0016] 所述黄化病植原体的探针序列如SEQ ID No.6所示；

[0017] 所述丛簇病菌的探针序列如SEQ ID No.9所示。

[0018] 如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括包含检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的阳性扩增产物，其中，

[0019] 所述检测腐烂病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.10中第21-197bp所示的序列；

[0020] 所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.11中第 17-106bp所示的序列；

[0021] 所述检测丛簇病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第20-219bp所示的序列。

[0022] 一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的试剂盒，该试剂盒包括：如权利要求2所述的腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记TEXRED-BHQ2、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。

[0023] 如上所述的试剂盒，优选地，还包括检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的阳性扩增产物，其中，

[0024] 所述检测腐烂病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.10中第21-197bp所示的序列；

[0025] 所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.11中第 17-106bp所示的序列；

[0026] 所述检测丛簇病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第20-219bp所示的序列。

[0027] 如上所述的试剂盒，优选地，还包括Premix EX Taq×2。

[0028] 一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的检测方法，该方法用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原，具体包括以下步骤：

[0029] (1)从样品中提取DNA；

[0030] (2)对提取的所述DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量 PCR扩增时，在反应体系中，采用所述腐烂病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记TEXRED和BHQ2；所述黄化病植原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和TAMRA；所述丛簇病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和 BHQ3；

[0031] (3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

[0032] (4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

[0033] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：

[0034] 1×Premix EX Taq，

[0035] 所述腐烂病菌上游引物、下游引物的终浓度为0.48μmol/L，探针的终浓度为0.4μmol/L；所述黄化病植原体上游引物、下游引物的终浓度为 0.48μmol/L，探针的终浓度为0.4μmol/L；所述丛簇病菌上游引物、下游引物终浓度为0.64μmol/L，探针的终浓度为0.48μmol/L；

[0036] 所述样品的DNA为2μL；

[0037] 同时设置无核酸酶水为阴性对照；

[0038] 同时分别设置包含如SEQ ID No.10所示的序列、SEQ ID No.11所示的序列、SEQ ID No.12所示的序列的基因作为阳性对照。

[0039] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃，5min；扩增阶段95℃，15sec； 59℃，25sec；72℃，35sec，45个循环；72℃，7min；4℃保温。

[0040] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35，当Ct值≤35时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40时，无明显扩增曲线为阴性结果。

[0041] (三)有益效果

[0042] 本发明的有益效果是：

[0043] 本发明提供了一种用于普通PCR检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌这三种病原的核酸组，该组核酸可用于单一病原体的检测，也可用于这三种病原同步检测的多重扩增使用。用于同步检测这三种病原时，经过验证，相互之间不发生交叉反应，其检测灵敏度高，特异性强。

[0044] 本发明还提供了一种用于荧光定量PCR同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌这三种病原的核酸及试剂盒，同时建立了一种比较高效、灵敏的，特异性强，并可同时检测这三种病原的检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生，为能有效预防秋海棠会发生立枯病、斑点病和白粉病提供一种技术手段。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病原体分离培养来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，成本低，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，也就减少了在操作过程的污染，避免重复操作而消耗过多的劳动力，节省时间，有效节约成本，实现了快速筛查，所用试剂盒的检测效果好，特异性强，灵敏度高。本发明提供的核酸、试剂盒及其检测方法，用以解决现有技术中没有能同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的技术问题。

[0045] 提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化来获得定量的结果，不需要普通PCR 后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的筛查检测。

附图说明

[0046] 图1为同时检测三种病原的PCR电泳结果。

[0047] 图2为本发明荧光定量PCR用于同时检测三种病原时，检测腐烂病菌的灵敏度测试结果图；

[0048] 图3为本发明荧光定量PCR用于同时检测三种病原时，检测黄化病植原体的灵敏度测试结果图；

[0049] 图4为本发明荧光定量PCR用于同时检测三种病原时，检测丛簇病菌的灵敏度测试结果图。

具体实施方式

[0050] 为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容，所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

[0051] 实施例1引物、探针的设计

[0052] 荧光定量PCR检测是在普通PCR检测的基础上，进一步通过特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。所以荧光定量PCR检测的前提是要进行PCR 扩增反应，扩增反应之间的引物及产物需尽量避免交叉反应，再进一步保证特异性探针与各个扩增产物、引物均不应有交叉反应。又由于本发明是多重荧光定量，所以探针标记的选择也比较关键，不仅要对软件设计出来的探针要经过筛选，三个基因的探针信号还不能相互干扰。

[0053] 首先分别筛选腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的病原体的特异目标基因，根据检测目的，对每种病原从GenBank下载多条病原基因序列，进行比对分析，选取保守序列，再在保守序列内设计扩增引物及适合荧光定量PCR反应体系的杂交探针。

[0054] 由于本发明是多重荧光定量，首先引物、探针的选择比较关键，其次软件设计出来的探针要经过筛选，三个基因的探针信号不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑三对引物和三条探针之间都不能相互干扰。

[0055] 分别设计出腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原特异的多条引物序列和杂交探针序列，并对拟选用的探针和引物组合进行序列同源性和适配性分析评估，并通过大量的检测试验进行验证，最终选定这三种病原特异，且适合多重荧光定量反应体系的引物与探针组合。

[0056] 需要注意的是，设计时，普通PCR引物的设计原则并不适用荧光定量PCR引物的设计，荧光定量PCR引物的设计比普通PCR引物的设计要求苛刻，但是荧光定量PCR引物是肯定可用于普通PCR扩增反应的。

[0057] 对于每种病原体设计的扩增引物首先要进行单个病原体的扩增检测，确认单个病原体扩增检测没有非特异性扩增后，再进行多重病原体的扩增，设计引物就需要尽量避免发生交叉反应，还要考虑扩增条件要尽量一致，最终通过杂交反应排除交叉反应；根据上述设计、生物信息学分析和发明人的经验设计及大量实验检测试验筛选，结果确定以下序列：

[0058] 腐烂病菌特异的扩增引物对和探针：如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.3所示的特异性探针序列，具体如下：

[0059] SEQ IDNo.1：5′-CATTGCGCCCTCTGGTATTCC-3′

[0060] SEQ IDNo.2：5′-TCCAAAGCGAGGGTTTTACTACTG-3′

[0061] SEQ IDNo.3：5′-AGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCT-3′

[0062] 黄化病植原体特异的扩增引物对和探针：如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.6所示的特异探针序列，具体如下：

[0063] SEQ IDNo.4：5′-ATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGTG-3′

[0064] SEQ IDNo.5：5′-CGTGCCTCAGCGTCAGTAAAG-3′

[0065] SEQ IDNO.6：5′-CCGCCTACGCTTCTGGTGTTCCTCC-3′；

[0066] 丛簇病菌特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的特异扩增上下游引物，以及如SEQ ID No.9所示的杂交探针序列，具体如下：

[0067] SEQ IDNo.7：5′-TGGGCGTAAAGGGTGTGTAGG-3′

[0068] SEQ IDNo.8：5′-CGTGCCTCAGCGTCAGTTAAG-3′

[0069] SEQ IDNo.9：5′-CCGCCTTCGCTACTGGTGTTCCTCC-3′。

[0070] 本发明中，探针的设计尤为关键，探针可以在引物扩增的片段之间进行选择，首先，探针自身不可形成引物二聚体，否则会导致假阴性检测结果，其次，用于多重病原体进行检测时，进行多重检测的片段及引物之间不可有交叉反应，否则会导致假阳性或假阴性结果。设计探针时要使每种病原体探针的报告基团的荧光发射最大波长处于不同的光谱范围，以确保荧光定量PCR仪的检测通道能区分每种病原体的探针。所以设计中，除了用primer select软件进行评估，确保理论上的尽可能符合多重反应以外，还应根据反应的扩增曲线进行引物和探针浓度的适当调整，直至扩增出最佳扩增曲线。

[0071] 本发明选用的TEXRED、FAM、CY5三种荧光染料，其波长处于不同光谱范围，相互间不能干扰，具有明显的区分效果和信号强度。

[0072] 经大量实验验证，采用上述引物、探针时，可单独用于检测各对应的病原体的检测，其探针的5′端和3′端分别可选用标记 TEXRED-BHQ2、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。但进行同时检测三种病原时，各探针标记则应对应标记这三种组合关系，也就是说采用 TEXRED-BHQ2、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3分别标记腐烂病菌的探针，黄化病植原体的探针，丛簇病菌的探针，各探针5′端和3′端标记的荧光基团是不重合的，但是可随意进行组合，检测结果不受影响，当然单独一个病原体进行检测时，探针也可选用其它荧光基团如VIC、NED 和Texred等作为发光基团，使用如BHQ、MGB和BHQ1等作为荧光淬灭基团。

[0073] 实施例2普通PCR检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原[0074] 根据实施例1筛选的腐烂病菌在genebank中序列号为AF192326中的保守序列如SEQ IDNo.10所示，在此保守序列中设计引物和探针。最终确定所设计的腐烂病菌引物扩增的片段大小为177bp，扩增序列为如 SEQ IDNo.10中第21-197bp所示序列。

[0075] SEQ IDNo.10：TCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCT GGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAA GCCCTGCTTGGTGTTGGGGCATTGCCTGAGGCCGCCCCCGGGCGGG CCGGGTAAGCCCTGAAATTTAGTGGCGAGCTCGCCAGGACTCCGAG CGCAGTAGTAAAACCCTCGCTTTGGACTG。

[0076] 黄化病植原体选用genebank中序列号为AY197660筛选的保守序列如SEQ IDNo.11所示，在此保守序列中设计的引物和探针，其引物扩增片段大小为90bp，扩增序列为如SEQ IDNo.11中第17-106bp所示。

[0077] SEQ ID No.11：GATAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGG TAAAATGTGTAAATATATGGAGGAACACCAGAAGCGTAGGCGGCTT GCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAAC AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTACTAA GTG。

[0078] 引起丛簇病的病原菌，选用genebank中序列号为AF248958筛选的保守序列如SEQ IDNo.12所示序列，在此保守序列中设计的引物和探针，引物扩增片段大小引物扩增片段大小为200bp，核苷酸序列如SEQ IDNo.12中第20-219bp所示序列。

[0079] SEQ IDNo.12：AAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGT GTGTAGGCGGTTTAATAAGTCTATGGTATAAGTTCAACGCTTAACG TTGTGATGCTATGGAAACTGTTTGACTAGAGTTGGATAGAGGCAAG TGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAAC ACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTAACTGACGCTGAGGCA CGAAAGCGTG。

[0080] 对实施例1中的引物、探针及上述扩增片段进行合成，获得引物及携带有如序列SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示序列的阳性质粒DNA。

[0081] 利用引物和阳性质粒DNA并进行普通PCR扩增，采用宝生物工程 (大连)有限公司公司的Premix EX Taq×2，25μL反应体系：各上下游引物(10μM)0.5μL；Premix EX Taq×2 12.5μL；各阳性质粒DNA模板 1μL，其余用无核酸酶水补足。

[0082] PCR扩增反应条件优选为：

[0083] 反应条件：预变性阶段95℃，4min；扩增阶段94℃，25sec； 59℃，25sec；72℃，35min，45个循环；72℃，7min；4℃保温。

[0084] 对扩增产物进行电泳，如图1所示，图中，条带1为DNA Marker、2为空白对照、3为腐烂病菌、4为黄化病植原体、5为丛簇病菌的扩增结果。结果显示，所设计的引物可有效扩增出对应腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的阳性条带。

[0085] 实施例3三种病原荧光定量PCR检测试剂盒

[0086] 用于同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌这三种病原的荧光定量PCR检测试剂盒包括以下成分：

[0087] Premix EX Taq×2；

[0088] 腐烂病菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如 SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示，探针SEQ IDNo.3的 5′标记TEXRED，3′标记BHQ2；

[0089] 黄化病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示其中，探针SEQ IDNo.7的5′标记FAM，3′标记TAMRA；

[0090] 丛簇病菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如 SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示，其中，探针SEQ IDNo.11的5′标记CY5，3′标记BHQ3。

[0091] 进一步，为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有作为阳性对照及阴性对照试剂，阴性对照采用无核酸酶水；

[0092] 阳性对照采用携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示。

[0093] 阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

[0094] 其中，所述Premix EX Taq×2、无核酸酶水可购自宝生物工程(大连) 有限公司；引物、探针、质粒可委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，上述的试剂可单独使用，当检测一种病原时，只需要采用一种病原对应的检测引物及探针，即可用于单一病原的检测，也可用于两种病原的检测，并不局限于只能是三种病原的检测，为了考虑使用试剂的成本及检测目的，所用试剂可根据检测目的进行组合。

[0095] 实施例4同时检测三种病原荧光定量PCR的方法

[0096] 采用荧光定量PCR同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的方法包括以下步骤：

[0097] (1)病原体DNA提取

[0098] 所用的试剂有：液氮，CTAB抽提缓冲液：2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，1％β-巯基乙醇1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 100mmol/L Tris-HCl pH8.0，3M NaAC，50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA；氯仿：异戊醇(24:1)，异丙醇，70％乙醇，TE buffer。

[0099] 提取步DNA的方法，步骤如下：将样品材料剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中；加入液氮速冷，研磨成细粉(越细越好)；在5ml 离心管中加入抽提缓冲液2.5mll，59℃保温1小时；15 000rpm，离心 10分钟；上清转入另一个新的离心管中；加入等体积氯仿：异戊醇 (24:1)，混匀抽提至水乳胶融状；15 000rpm，离心10分钟；上清转入另一个新的离心管中；加入2/3倍体积预冷异丙醇，-20℃保温40min，缓缓混匀DNA成絮状折出；15 000rpm，离心10分钟，弃上清；DNA 沉淀用70％乙醇洗2次；加入400μl TE buffer溶解DNA。

[0100] (2)荧光定量PCR扩增

[0101] 采用实施例3制备的试剂盒配置反应体系，采用25μL反应体系：腐烂病菌、黄化病植原体的上下游引物终浓度为0.48μmol/L，探针浓度均为0.4μmol/L和丛簇病菌的上下游引物终浓度为0.64μmol/L，探针终浓度为0.48μmol/L，Premix EX Taq×2加入12.5μL，每个样品提取的DNA量加入2μL。

[0102] 设置阳性对照时，分别采用含有各病原体的阳性扩增序列的质粒替换样本DNA，设置阴性对照时，采用无核酸酶水替换样本DNA。

[0103] 扩增条件：优选以下扩增条件：

[0104] 预变性阶段95℃，5min；扩增阶段95℃，15sec；59℃，25sec； 72℃，35sec，45个循环；72℃，7min；4℃保温。

[0105] (3)收集荧光信号，分别选择TEXRED、FAM、Cy5的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

[0106] (4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性，具体本实施例中，阈值为35，当Ct值≤35，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40无明显扩增曲线为阴性结果。

[0107] 实施例5本发明试剂盒灵敏度的检测

[0108] 将实施例2中合成的腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的病原体的质粒DNA，经测定，其浓度分别为0.145ng/μL、0.202ng/μL、 0.272ng/μL，按10倍比进行稀释后，即获得的腐烂病菌DNA的浓度分别为1.45×10-2ng/μL、1.45×10-3ng/μL、1.45×10-4ng/μL、1.45×10-5 ng/μL、1.45×10-6ng/μL；黄化病植原体DNA的浓度分别为2.02×10-2 ng/μL、2.02×-3 -4 -5 -6
10 ng/μL、2.02×10 ng/μL、2.02×10 ng/μL、2.02×10  ng/μL，丛簇病菌DNA的浓度分别为2.72×10-2ng/μL、2.72×10-3ng/μL、 2.72×10-4ng/μL、2.72×10-5ng/μL、2.72×10-6ng/μL。利用实施例3制备的试剂盒分别对上述不同浓度的DNA模板进行腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的检测，其中，

[0109] 1)NTC：无核酸酶水；

[0110] 反应体系采用25μL反应体系，由12.5μL Premix EX Taq×2，腐烂病菌、黄化病植原体的上下游引物(20μM)均为0.6μL和丛簇病菌的上下游引物(20μM)均为0.8μL；腐烂病菌的探针(20μM)为0.5μL、黄化病植原体的探针(20μM)各为0.5μL，丛簇病菌的探针(20μM)为0.6μL，样品DNA的量1μL。样本DNA采用上述稀释后的阳性模板进行检测，优选扩增条件：95℃-5min；95℃-15s，59℃-40s；72℃，35sec，45个循环；72℃，7min；4℃保温。实时荧光定量PCR检测在ABI7500 PCR仪上进行。

[0111] 2)每个梯度做三个平行样。

[0112] 结果判定：Ct值≤35有明显扩增曲线为阳性结果，Ct值＞40无明显扩增曲线为阴性结果。

[0113] 检测结果的荧光值图，其中，腐烂病菌的灵敏度测试结果如图2所示，图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为1.45×10-2ng/μL、 1.45×10-3ng/μL、1.45×10-4ng/μL、1.45×10-5ng/μL、1.45×10-6ng/μL的腐烂病菌DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为2.3×10-6 ng/μL的腐烂病菌DNA都可以检出。黄化病植原体的灵敏度测试结果如图3所示，图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为2.02×10-2ng/μL、 2.02×10-3ng/μL、2.02×10-4ng/μL、2.02×10-5ng/μL、2.02×10-6ng/μL的黄化病植原体DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为 2.02×10-6ng/μL的黄化病植原体DNA都可以检出。丛簇病菌的灵敏-2
度测试结果如图4所示。图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为2.72×10  ng/μL、2.72×10-3ng/μL、2.72×10-4ng/μL、2.72×10-5ng/μL、2.72×10-6 ng/μL的丛簇病菌DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为 2.72×10-6ng/μL的丛簇病菌DNA都可以检出。可见本发明方法检测腐烂病菌、黄化病植原体、丛簇病菌的灵敏度分别为1.45×10-6ng/μL、 -6 -6
2.02×10 ng/μL、2.72×10 ng/μL。

[0114] 实施例6本发明试剂盒的特异性

[0115] 利用本发明的试剂盒对实验室保存的菌种包括有：立枯丝核菌(cfcc 7848)、黄曲霉(cfcc 84919)、尖孢镰刀菌(cfcc 89008)、链格孢菌(cfcc 82113)，盘长孢状刺盘孢(cfcc 82273)，枯草芽胞杆菌(cfcc 14476)、黄曲霉(CICC 2090)、蜡状芽孢杆菌(cfcc 2692)、绿木霉(CICC2535)、白假丝酵母(cfcc 3529)、宿白粉菌(cfcc 83251)进行了检测。

[0116] 上述菌种可通过商购获得，将上述菌种活化培养后，取菌液进行提取DNA。将提取的DNA进行实施例4所述方法进行检测。检测结果表明，上述菌种中均没有扩增曲线，检测结果为阴性，结果表明本发明设计的引物、探针具有特异性，没有非特异性扩增，特异性强。

[0117] 实施例7：利用本发明试剂盒对样品进行检测

[0118] 采集表现为腐烂病、黄化病、丛簇病症状和健康苹果树样品，均采自山东青岛地区，其中腐烂病症状的有15个样品，黄化病症状的有11 个样品、丛簇病病症状的有12个样品。

[0119] 对上述样品进行提取DNA，可采用如实施例4提取DNA的方法进行，并采用本发明的试剂盒对提取的DNA进行检测，采用实施例4所述荧光定量方法进行检测，结果显示，对应有腐烂病、黄化病和丛簇病的样品，Ct值≤35，都有明显示扩增曲线，结果都呈阳性，健康的柳叶样品的DNA检测结果没有扩增曲线，检测结果为阴性，说明本发明的检测方法对样品的检测具有很好的适用性，该检测在ABI7500荧光定量PCR 仪进行，检测准确率达100％。

[0120] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。