抑制类风湿因子干扰的超敏C-反应蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒

摘要

本发明提供一种抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂盒，它包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的溶液，所述试剂2为包被有抗体致敏的胶乳颗粒分散液，所述试剂1中包含1‑40g/L的N‑羟基琥珀酰亚胺，和所述试剂2中还可以包括1‑8mmol/L的甘油。本发明的试剂盒能够有效消除胶乳增强免疫比浊的样品中含有类风湿因子对免疫检测结果的干扰，提高测量的准确性和精确度，它具有良好的通用性。

权利要求

1.抑制类风湿因子干扰的超敏C-反应蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的溶液，所述试剂2为包被有C-反应蛋白抗体致敏的胶乳颗粒分散液，所述试剂1中包含1-40g/L的N-羟基琥珀酰亚胺；所述试剂1中还包括缓冲液、生物防腐剂、表面活性剂和IgM抗体；和所述试剂2中还包括缓冲液、生物防腐剂、表面活性剂、封闭剂和稳定剂。

2.根据权利要求1的所述胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述试剂1中包含5-

30g/L、10-20g/L、10-30g/L或20-40g/L的N-羟基琥珀酰亚胺。

3.根据权利要求1的所述胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述试剂2中包含1-

8mmol/L的甘油。

4.根据权利要求3的所述胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述试剂1中包含1-

30g/L的N-羟基琥珀酰亚胺。

5.根据权利要求1的所述胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述试剂1中包括25-

200mmol/L磷酸盐缓冲液、0.9-120g/L的氯化钠、0.5-200mg/L抗人IgM抗体、0.1-5g/L生物防腐剂Proclin300和1-20g/L的表面活性剂TX100。

6.根据权利要求5的所述胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述试剂1中包括

100mmol/L磷酸盐缓冲液、30g/L的氯化钠、50mg/L抗人IgM抗体、1g/L生物防腐剂Proclin300和3g/L的表面活性剂TX100。

7.根据权利要求1的所述胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述试剂2中包括20-

200mmol/L甘氨酸缓冲液、0.1-5g/L的生物防腐剂Proclin300、1-20g/L的表面活性剂TX100、1-5g/L牛血清白蛋白、1-200g/L海藻糖和0.2-5g/L的抗体致敏的胶乳颗粒。

8.根据权利要求7的所述胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述试剂2中包括

50mmol/L甘氨酸缓冲液、1g/L的生物防腐剂Proclin300、3g/L的表面活性剂TX100、3g/L牛血清白蛋白、3g/L海藻糖和0.5g/L的抗体致敏的胶乳颗粒。

9.根据权利要求1的所述胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述胶乳增强免疫比浊试剂盒致敏胶乳上包被的是动物抗人IgG多克隆或单克隆抗体。

说明书

抑制类风湿因子干扰的超敏C-反应蛋白胶乳增强免疫比浊试

剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种抑制类风湿因子干扰的超敏C-反应蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒。

背景技术

[0002] 超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)是血浆中的一种C反应蛋白，又称为高敏C反应蛋白。急性脑梗死老年患者中，CRP升高者预后不佳；hs-CRP含量与梗死面积、神经功能缺损程度相关,是脑梗死患者病变程度的指标之一；而且CRP也参与了血栓形成和动脉硬化的病理过程，是脑卒中的危险因素之一。动脉粥样硬化斑块的炎症反应是斑块破裂和不稳定的重要原因,在动脉粥样硬化斑块的形成过程中，CRP、补体复合物和泡沫细胞等沉积在动脉壁内，CRP可与脂蛋白结合，激活补体系统，产生大量炎症介质，释放氧自由基，造成血管内膜损伤、血管痉挛及不稳定斑块脱落，加重动脉粥样硬化所致的管腔狭窄以及ACI的发生。越来越多的证据表明，低水平CRP与心血管疾病的其他危险因素密切相关,如高血压、高脂血症；同时，CRP升高可增加高血压患者心脏病、脑卒中的发病率；因此，CRP是与动脉粥样硬化发生、演变和发展都有关的促炎因子。流行病学调查也显示,hs-CRP水平升高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的2倍,发生心肌梗死的几率是正常者的3倍。

[0003] 超敏C反应蛋白的临床指导作用主要表现在对心血管疾病，新生儿细菌感染，肾移植等方面。超敏C反应蛋白是由肝脏合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，是心血管事件危险最强有力的预测因子之一。

[0004] 胶乳颗粒增强比浊法(PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。基本原理是在高分子胶乳微球的表面交联抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足以检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。

[0005] 胶乳增强免疫比浊法常规检测的一个限制是易于受到由可能存在于测试样品中的嗜异性抗体引起的干扰，尤其是类风湿因子引起的干扰。类风湿因子(rheumatoid factor,RF)是在类风湿性关节炎(RA)病人血清中发现，是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中，它是一种抗变性IgG的抗体，属IgM型。可与IgGFc段结合。RA病人和约50％的健康人体内都存在有产生RF的B细胞克隆，在变性IgG(或与抗原结合的IgG)或EB病毒直接作用下，可大量合成RF。在商业免疫类检测试剂中所采用的抗体大多是动物来源的IgG类抗体，Fc段与人IgG的Fc段具有较高的同源性，能被RF识别并结合，所以在待测物质为阴性、RF阳性的检测样本中，免疫检测试剂有可能被RF捕获产生信号，从而导致假阳性结果。

[0006] 目前在现有的免疫检测试剂研制中，减少类风湿因子或异嗜性干扰的方法通常有：(1)从样品中去除干扰性的免疫球蛋白或使其失活。比如使用IgG固相吸附剂吸附样本中的类风湿因子，或使用含有2-巯基乙醇的稀释液稀释样本，以降解IgM型类风湿因子，但这会使检测操作复杂化，并且有可能在去除干扰蛋白的同时也减少了待测物质的含量或活性。(2)使用减少干扰的封闭剂，大多为IgG，市场上有许多商品化的封闭剂。但由于类风湿因子或异嗜性抗体的多样化，以及各种产品所使用的抗体不同，目前尚未有一种产品可以有效消除所有干扰，通常需要使用不同产品进行组合、筛选，不但增加工作量、挺高试剂成本，另一方面由于使用多种不明成分的封闭剂，也不可控制地引入新的干扰检测结果的因素。(3)修饰测定抗体以使其更不易与类风湿因子反应。目前最常使用的一种方法是将检测IgG抗体酶切去除Fc片段，用F(ab’)2替代完整的IgG，既保留其识别结合抗体的活性，又消除Fc的干扰，减少试剂的非特异性反应。但在IgG的酶切、纯化制备工艺中会损失一部分抗体且对抗体活性也有一定程度影响，提高试剂成本，更重要的是试剂制备过程进一步复杂，对控制试剂批间差设置了不可逾越的障碍，从而限制了此类试剂在临床上的推广。

[0007] 现有的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，一般包括试剂1和试剂2，试剂1为促进抗原和抗体反应的缓冲液，试剂2为包被有抗体的胶乳颗粒分散液。

发明内容

[0008] 为解决上述问题，本发明提供一种抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂盒，该试剂盒组成简单，针对胶乳增强免疫比浊试剂具有广泛的通用性，可以有效地消除类风湿因子的干扰，提高检测结果的特异性和准确性。

[0009] 本发明提供一种抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂盒，它包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的溶液，所述试剂2为包被有C-反应蛋白抗体致敏的胶乳颗粒分散液，所述试剂1中包含1-40g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，优选地为5-30g/L、10-20g/L、10-30g/L或20-40g/L的N-羟基琥珀酰亚胺。在一些实施方式中，试剂1中N-羟基琥珀酰亚胺的量可以是1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、
11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、
36g/L、37g/L、38g/L、39g/L或40g/L。

[0010] 在一种实施方式中，所述试剂2中包含1-8mmol/L的甘油。甘油用于增加分散介质黏度，或吸附于微粒表面，形成保护屏障，防止或减少微粒间的吸引或絮凝，维持微粒比较均匀的分散状态。

[0011] 在一种实施方式中，所述试剂1中包含1-30g/L的N-羟基琥珀酰亚胺。

[0012] 在一种实施方式中，所述试剂1中还包括缓冲液、生物防腐剂、表面活性剂和IgM抗体；和所述试剂2中包括缓冲液、生物防腐剂、表面活性剂、封闭剂和稳定剂。

[0013] 缓冲液可以为本领域中常规使用的缓冲溶液。在一些实施方式中，所述缓冲溶液可以各自独立地为MOPS、good's缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液以及其任意组合。

[0014] 在一些实施方式中，所述生物防腐剂可以为二氯乙酰胺、咪唑烷基脲、生物防腐剂ProClin系列、山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金酯等或其任意组合。

[0015] 在一些实施方式中，所述表面活性剂可以是可以为TWEEN、SPAN、TRITON、EMULGEN系列表面活性剂，例如吐温20、吐温40、TX100等等。

[0016] 封闭剂的作用是为了与胶乳颗粒中游离的-COOH位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成不良影响，本发明试剂2中封闭剂可以是各种蛋白质，优选BSA蛋白作为封闭剂。

[0017] 稳定剂的主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。常用的稳定剂为糖类、醇类、蛋白类以及一些氨基酸等。在一些实施方式中，稳定剂为糖类，例如蔗糖或海藻糖。

[0018] 在一种实施方式中，所述试剂1中包括25-200mmol/L磷酸盐缓冲液、0.9-120g/L的氯化钠、0.5-200mg/L抗人IgM抗体、0.1-5g/L生物防腐剂Proclin300和1-20g/L的表面活性剂TX100。

[0019] 在一些实施方式中，试剂1中磷酸盐缓冲液浓度可以为25-100mmol/L或100-200mmol/L。在一些实施方式中，试剂1中氯化钠的量是0.9-30g/L、30-120g/L、30-60g/L或
60-80g/L。在一些实施方式中，试剂1中抗人IgM抗体的量是0.5-50mg/L、50-100mg/L、100-
200mg/L或50-200mg/L。在一些实施方式中，试剂1中生物防腐剂的量是0.1-1g/L、1-3g/L、或1-5g/L。在一些实施方式中，试剂1表面活性剂剂的量是1-3g/L、1.5-3g/L、1.5-20g/L或
3-20g/L。

[0020] 在一种实施方式中，所述试剂1中包括100mmol/L磷酸盐缓冲液、30g/L的氯化钠、50mg/L抗人IgM抗体、1g/L生物防腐剂Proclin300和3g/L的表面活性剂TX100。

[0021] 在一种实施方式中，所述试剂2中包括20-200mmol/L甘氨酸缓冲液、0.1-5g/L的生物防腐剂Proclin300、1-20g/L的表面活性剂TX100、1-5g/L牛血清白蛋白、1-200g/L海藻糖和2-50g/L的抗体致敏的胶乳颗粒。

[0022] 在一些实施方式中，试剂2中甘氨酸缓冲液浓度可以为20-50mmol/L、50-200mmol/L或100-200mmol/L。

[0023] 在一些实施方式中，试剂2中稳定剂的量是1-3g/L、1-150g/L、3-150g/L或150-200g/L。在一些实施方式中，试剂2中生物防腐剂的量是0.1-1g/L、1-3g/L、或1-5g/L。在一些实施方式中，试剂2中表面活性剂剂的量是1-3g/L、1.5-3g/L、1.5-20g/L或3-20g/L。在一些实施方式中，试剂2中封闭剂的量是1-2g/L、1-3g/L、2-5g/L或3-5g/L。在一些实施方式中，试剂2中抗体致敏的胶乳颗粒的浓度为0.2-0.5g/L或0.5-5g/L。

[0024] 在一种实施方式中，所述试剂2中包括50mmol/L甘氨酸缓冲液、1g/L的生物防腐剂Proclin300、3g/L的表面活性剂TX100、3g/L牛血清白蛋白、3g/L海藻糖和0.5g/L的抗体致敏的胶乳颗粒。

[0025] 在一种实施方式中，所述胶乳增强免疫比浊试剂盒致敏胶乳上包被的是动物抗人IgG多克隆或单克隆抗体。所述动物的种属包括兔、山羊、绵羊、鸡和鼠。

[0026] 在一种实施方式中，本发明提供上述试剂盒的应用，样品的体积与试剂的体积比为1:10-1:150；样品是血清、血浆或全血。

[0027] 本发明采用在试剂1中添加NHS，加入NHS后，样品中RF因子与抗人IgG结合的能力减低，而标记抗体与待测抗原的结合能力不受影响。试剂2中加入甘油后，增加了测试结果的稳定性和重复性。此外，试剂1中的抗人IgM抗体，能够与减活后的RF因子结合，从而彻底消除RF因子对测定结果的干扰。因此，本发明的试剂盒能够提高检测结果的特异性和准确性；另外本试剂盒组成简单，具有较高的灵敏度，具有广泛的通用性。

具体实施方式

[0028] 为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

[0029] 实施例一:含有不同NHS量超敏C-反应蛋白测定试剂盒

[0030] 1.含有不同NHS量的超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂1

[0031] 超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂1-A：100mmol/L磷酸盐缓冲液，30g/L的氯化钠，50mg/L羊抗人IgM抗体，1g/L生物防腐剂Proclin300，3g/L表面活性剂TX100，0g/L NHS；

[0032] 超敏C-反应蛋白测定试剂1-B、C、D、E、F、G、H和I中各组分与试剂1-A相同，除了NHS浓度不同，它们分别为1g/L NHS、5g/L NHS、10g/L NHS、20g/L NHS、30g/L NHS、40g/L NHS、45g/L NHS和50g/L NHS。

[0033] 2.超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂2：50mmol/L甘氨酸缓冲液，0.5g/L抗人超敏C-反应蛋白多克隆抗体致敏的胶乳颗粒，1g/L生物防腐剂Proclin300，3g/L表面活性剂TX100，3g/L牛血清白蛋白，3g/L海藻糖。

[0034] 3.含有不同类风湿因子含量的超敏C-反应蛋白测定试剂盒样本制备：在含有2.60mg/L的超敏C-反应蛋白测定试剂盒纯品的样品中分别加入不同的RF，配制成含有0、
100、200、500、1000IU/mL RF的溶液。

[0035] 以上配制的九种超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂(试剂1-A，1-B，1-C，1-D，1-E，1-F，1-G，1-H，1-I，各试剂的NHS量不同)，对含有0、100、200、500、1000IU/mL的RF的超敏C-反应蛋白测定试剂盒样本进行检测。

[0036] 表1：超敏C-反应蛋白测定试剂盒中试验结果

[0037]

[0038] 以上数据可知：试剂1中无NHS时，测定结果明显随着RF因子含量增加而升高，由最初的2.60mg/L升高到40.43mg/L。试剂1中添加NHS可以明显减少RF因子的干扰，当NHS含量为20g/L时，RF因子对测定结果影响基本没有。但当NHS量逐渐增加到45g/L、50g/L时，测定结果明显偏低，显示为副干扰。

[0039] 实施例二:含有不同甘油浓度的超敏C-反应蛋白测定试剂盒中试验

[0040] 1.含有不同甘油浓度的超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂1

[0041] 超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂1：100mmol/L磷酸盐缓冲液，30g/L的氯化钠，50mg/L羊抗人IgM抗体，1g/L生物防腐剂Proclin300，3g/L表面活性剂TX100，10g/L NHS；

[0042] 2.含有不同浓度甘油的超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂2-A：50mmol/L甘氨酸缓冲液，0.5g/L抗人超敏C-反应蛋白多克隆抗体致敏的胶乳颗粒，1g/L生物防腐剂Proclin300，3g/L表面活性剂TX100，3g/L牛血清白蛋白，3g/L海藻糖；甘油0mmol/L。

[0043] 超敏C-反应蛋白测定试剂2-B、C、D、E、F、G和H中各组分与试剂2-A相同，除了甘油浓度不同，它们分别为1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L和12mmol/L。

[0044] 3.含有不同类风湿因子含量的超敏C-反应蛋白测定试剂盒样本制备：在含有2.60mg/L的超敏C-反应蛋白测定试剂盒纯品的样品中分别加入不同的RF，配制成含有0、
100、200、500、1000IU/mL RF的溶液。

[0045] 以上配制的八种超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂(试剂2-A，2-B，2-C，2-D，2-E，2-F，2-G和2-H，各试剂的甘油浓度不同)，对含有0、100、200、500、1000IU/mL的RF的超敏C-反应蛋白测定试剂盒样本进行检测。

[0046] 表2：超敏C-反应蛋白测定试剂盒中试验结果

[0047]

[0048] 以上数据可知：当试剂2中加入不同浓度的甘油时，与2-A中没有加入甘油相比，试剂2-B、2-C、2-D、2-E、2-F测定的结果更稳定，而2-G和2-H的测量结果与2-A相比结果更不稳定，变化范围更大。从该实验结果可以看出，当甘油浓度在1-8mmol/L时，测定结果更为稳定，消除RF的影响更彻底。

[0049] 实施例三:含有不同甘油浓度和NHS的超敏C-反应蛋白测定试剂

[0050] 1.含有不同甘油浓度和NHS的超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂1

[0051] 超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂3-A：100mmol/L磷酸盐缓冲液，30g/L的氯化钠，50mg/L羊抗人IgM抗体，1g/L生物防腐剂Proclin300，3g/L表面活性剂TX100，0g/L NHS；

[0052] 超敏C-反应蛋白测定试剂3-B、C、D、E、F、G、H和I中各组分与试剂1-A相同，除了NHS浓度不同，它们分别为1g/L NHS、5g/L NHS、10g/L NHS、20g/L NHS、30g/L NHS、40g/L NHS、45g/L NHS和50g/L NHS。

[0053] 2.含有不同浓度甘油的超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂2：50mmol/L甘氨酸缓冲液，0.5g/L抗人超敏C-反应蛋白多克隆抗体致敏的胶乳颗粒，1g/L生物防腐剂Proclin300，3g/L表面活性剂TX100，3g/L牛血清白蛋白，3g/L海藻糖；甘油2mmol/L。

[0054] 3.含有不同类风湿因子含量的超敏C-反应蛋白测定试剂盒样本制备：在含有2.60g/L的超敏C-反应蛋白测定试剂盒纯品的样品中分别加入不同的RF，配制成含有0、
100、200、500、1000IU/mL RF的溶液。

[0055] 以上配制的九种超敏C-反应蛋白测定试剂盒测定试剂(试剂3-A，3-B，3-C，3-D，3-E，3-F，3-G，3-H和3-I)，对含有0、100、200、500、1000IU/mL的RF的超敏C-反应蛋白测定试剂盒样本进行检测。

[0056] 表3：超敏C-反应蛋白测定试剂盒中试验结果

[0057]

[0058] 以上数据可知：试剂1中无NHS时，测定结果明显随着RF因子含量增加而升高，由最初的2.62mg/L升高到38.65mg/L。试剂1中添加NHS可以明显减少RF因子的干扰，当试剂2中添加甘油2mmol/L时，在NHS浓度为1-30g/L，RF因子对测定结果影响基本没有，结果稳定。但当NHS量逐渐增加到40g/L以上时，测定结果不是很稳定。

[0059] 此外，发明人对于试剂2和试剂1中不同物质的量也进行了研究，发现在试剂2中20-200mmol/L甘氨酸缓冲液、0.1-5g/L的生物防腐剂Proclin300、1-20g/L的表面活性剂TX100、1-5g/L牛血清白蛋白、1-200g/L海藻糖和0.2-5g/L的抗体致敏的胶乳颗粒；和/或，试剂1中25-200mmol/L磷酸盐缓冲液、0.9-120g/L的氯化钠、0.5-200mg/L羊抗人IgM抗体、
0.1-5g/L生物防腐剂Proclin300和1-20g/L的表面活性剂TX100，结果同表1-3中类似。

[0060] 应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

[0061] 本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。