一种含硫生物碱类化合物及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN201710922885.4
文献号 : CN107629060A
文献日 : 2018-01-26
发明人 : 周敏 , 耿慧春 , 廖凌敏 , 王琨淼 , 李干鹏 , 胡秋芬 , 杨光宇
申请人 : 云南民族大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种含硫生物碱类化合物,其特征在于所述的含硫生物碱类化合物是具有4-methyl-hexah-ydropyrrolo[1,2-c]imidazole骨架的生物碱,是以十字花科独行菜属云南特色引种资源植物玛咖(拉丁名:Lepidium meyenii)的根为原料制备得到,其分子式为C15H18N2O3S,该化合物命名为5-hydroxy-3-(3-methoxybenzyl)-2-thioxo-1,3-diaz-abicyclo[3.3.1]nonan-4-one,其化学结构式为:。
2.一种权利要求1所述的含硫生物碱类化合物的制备方法,其特征在于是以十字花科独行菜属云南特色引种资源植物玛咖(拉丁名:Lepidium meyenii)的根为原料,经提取、萃取、微孔树脂脱色素、正相柱色谱法划段、色谱富集、色谱纯化和高效液相手性半制备柱拆分步骤制备得到,具体包括:A、提取:将十字花科独行菜属云南特色引种资源植物玛咖(拉丁名:Lep-idium meyenii)的根粉碎过10 100目筛得到物料a,加入物料a重量3 8倍的有机溶剂冷浸1 2天并~ ~ ~超声提取2 5次,每次1 3h,提取液经抽滤得到滤液b,蒸馏浓缩得到玛咖粗提物的浓缩品a;
~ ~
B、萃取;向玛咖粗提物的浓缩品a中加入玛咖粗提物的浓缩品a重量1 3倍的水,搅拌得~到悬浊液,用与水等体积且与水不混溶的有机溶剂萃取2 5次,合并有机溶剂的萃取相,减~压浓缩得到精制品b;
C、微孔树脂脱色素:将精制品b用精制品b重量2 3倍的甲醇-水混合溶剂溶解,用微孔~树脂层析纯化,用体积百分浓度为80 90%的甲醇水溶液洗脱,合并洗脱液,减压浓缩得到精~制品c;
D、正相柱色谱法划段:将精制品c用精制品c重量2 3倍的甲醇或丙酮溶解,用精制品c~重量1 3倍的80 100目或者200 300目的硅胶拌样,然后用正相柱色谱法进行纯化,即用精~ ~ ~制品c重量5 10倍量的100 200目硅胶装柱,用体积比为1:0 0:1的混合有机溶剂梯度洗脱,~ ~ ~收集并浓缩,经硅胶薄层层析检测,合并显色和分离系数相同的点,得到含有(±)-修正的玛咖硫脲B的混合物d;
E、制备高效液相色谱富集:使用制备高效液相色谱,以体积百分浓度40 90%甲醇溶液~或体积百分浓度30 80%的乙腈溶液洗脱得到(±)-修正的玛咖硫脲B粗品;
~
F、半制备高效液相色谱纯化:将(±)-修正的玛咖硫脲B粗品经半制备高效液相色谱分离纯化得到(±)-修正的玛咖硫脲B纯品。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于A步骤中所述的有机溶剂为50% 100%的~丙酮、80% 100%的乙醇、80% 100%的乙酸乙酯或80% 100%的甲醇。
~ ~ ~
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于B步骤中所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、环己烷或石油醚。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于C步骤中所述的甲醇-水混合溶剂的体积百分浓度为80%。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于D步骤中所述的混合有机溶剂为氯仿-丙酮或石油醚-丙酮。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于所述的氯仿-丙酮中氯仿和丙酮的体积比为10:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于所述的石油醚-丙酮中石油醚和丙酮的体积配比为10:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2和0:1。
9.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于E步骤制备高效液相色谱富集是以体积百分浓度40 90%的甲醇水溶液或体积百分浓度30 80%的乙腈水溶液为流动相,流速为10~ ~ ~
14mL/min,以Zorbax PrepHT GF(5μm,21.2×250mm)反相制备柱为固定相,紫外检测器的检测波长为203nm和306nm,每次进样量为10 1000μL,收集10 25min范围内的色谱峰,以相同~ ~步骤多次累加后,用旋转蒸发仪蒸干,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B粗品;F步骤所述的半制备高效液相色谱纯化是以体积百分浓度40 90%的甲醇水溶液或体积百分浓度30~ ~
80%的乙腈水溶液为流动相,流速为1 4ml/min,以Zorbax SB-C18(10μm,9.4×250mm)反相~半制备柱为固定相,DAD检测器检测波长为203、220、254、265和306 nm,每次进样1 100μL,~收集10 25min的色谱峰,相同步骤多次累加后,用旋转蒸发仪蒸干,即得所述的(±)-修正~的玛咖硫脲B的纯品。
10.一种权利要求1所述的含硫生物碱类化合物的应用,其特征在于所述的含硫生物碱类化合物在制备抗癌药物、膳食、保健品、功能食品和食品添加剂中的应用。
说明书 :
一种含硫生物碱类化合物及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
产自中国云南丽江的玛咖进行了化学成分研究 ,首次从玛咖中发现了一类结构新颖的含硫六氢咪唑[1,5-c]噻唑衍生物meyeniins A–C,它们的相对和绝对构型是通过仿生合成、消旋体结晶、X-单晶衍射以及旋光比对来确定的,化合物活性测定表明(+)-meyeniin A表现了一定的抗肿瘤活性,这在一定程度上支持了玛咖作为防癌膳食和添加剂在功能食品中的应用。然而,同一特色资源植物在不同的产地成分存在较大的差异,中国引种的玛咖药理活性研究基本停留在提取物的活性评价阶段,并未开展系统物质基础和药效成分研究,其安全性和有效性都亟待阐明。本发明是针对其开展的相关研究,首次从中发现了一个新颖的具有潜在应用价值的生物碱类化合物。首次从中发现了一个新颖的且具有潜在应用价值的生物碱类化合物。
发明内容
超声提取2 5次,每次1 3h,提取液经抽滤得到滤液b,蒸馏浓缩得到玛咖粗提物的浓缩品a;
~ ~
B、萃取;向玛咖粗提物的浓缩品a中加入玛咖粗提物的浓缩品a重量1 3倍的水,搅拌得~
到悬浊液,用与水等体积且与水不混溶的有机溶剂萃取2 5次,合并有机溶剂的萃取相,减~
压浓缩得到精制品b;
C、微孔树脂脱色素:将精制品b用精制品b重量2 3倍的甲醇-水混合溶剂溶解,用微孔~
树脂层析纯化,用体积百分浓度为80 90%的甲醇水溶液洗脱,合并洗脱液,减压浓缩得到精~
制品c;
D、正相柱色谱法划段:将精制品c用精制品c重量2 3倍的甲醇或丙酮溶解,用精制品c~
重量1 3倍的80 100目或者200 300目的硅胶拌样,然后用正相柱色谱法进行纯化,即用精~ ~ ~
制品c重量5 10倍量的100 200目硅胶装柱,用体积比为1:0 0:1的混合有机溶剂梯度洗脱,~ ~ ~
收集并浓缩,经硅胶薄层层析检测,合并显色和分离系数相同的点,得到含有(±)-修正的玛咖硫脲B的混合物d;
E、制备高效液相色谱富集:使用制备高效液相色谱,以体积百分浓度40 90%甲醇溶液~
或体积百分浓度30 80%的乙腈溶液洗脱得到(±)-修正的玛咖硫脲B粗品;
~
F、半制备高效液相色谱纯化:将(±)-修正的玛咖硫脲B粗品经半制备高效液相色谱分离纯化得到(±)-修正的玛咖硫脲B纯品。
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附图说明
具体实施方式
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超声提取2 5次,每次1 3h,提取液经抽滤得到滤液b,蒸馏浓缩得到玛咖粗提物的浓缩品a;
~ ~
B、萃取;向玛咖粗提物的浓缩品a中加入玛咖粗提物的浓缩品a重量1 3倍的水,搅拌得~
到悬浊液,用与水等体积且与水不混溶的有机溶剂萃取2 5次,合并有机溶剂的萃取相,减~
压浓缩得到精制品b;
C、微孔树脂脱色素:将精制品b用精制品b重量2 3倍的甲醇-水混合溶剂溶解,用微孔~
树脂层析纯化,用体积百分浓度为80 90%的甲醇水溶液洗脱,合并洗脱液,减压浓缩得到精~
制品c;
D、正相柱色谱法划段:将精制品c用精制品c重量2 3倍的甲醇或丙酮溶解,用精制品c~
重量1 3倍的80 100目或者200 300目的硅胶拌样,然后用正相柱色谱法进行纯化,即用精~ ~ ~
制品c重量5 10倍量的100 200目硅胶装柱,用体积比为1:0 0:1的混合有机溶剂梯度洗脱,~ ~ ~
收集并浓缩,经硅胶薄层层析检测,合并显色和分离系数相同的点,得到含有(±)-修正的玛咖硫脲B的混合物d;
E、制备高效液相色谱富集:使用制备高效液相色谱,以体积百分浓度40 90%甲醇溶液~
或体积百分浓度30 80%的乙腈溶液洗脱得到(±)-修正的玛咖硫脲B粗品;
~
F、半制备高效液相色谱纯化:将(±)-修正的玛咖硫脲B粗品经半制备高效液相色谱分离纯化得到(±)-修正的玛咖硫脲B纯品。
~
×250mm)反相制备柱为固定相,紫外检测器的检测波长为203nm和306nm,每次进样量为10~
1000μL,收集10 25min范围内的色谱峰,以相同步骤多次累加后,用旋转蒸发仪蒸干,即得~
所述的(±)-修正的玛咖硫脲B粗品;F步骤所述的半制备高效液相色谱纯化是以体积百分浓度40 90%的甲醇水溶液或体积百分浓度30 80%的乙腈水溶液为流动相,流速为1 4ml/m-~ ~ ~
in,以Zorbax SB-C18(10μm,9.4×250mm)反相半制备柱为固定相,DAD检测器检测波长为
203、220、254、265和306 nm,每次进样1 100μL,收集10 25min的色谱峰,相同步骤多次累加~ ~
后,用旋转蒸发仪蒸干,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B的纯品。
提取2 5次,每次1 3小时,所得的提取溶剂减压抽滤,合并滤液;旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩~ ~
提取液,从而得到玛咖粗提物的浓缩样品M1;
(2) 有机溶剂萃取提纯:玛咖粗提物的浓缩样品M1中加入重量比1 3倍量的水,充分搅~
拌成悬浊液,所得溶剂放入分液漏斗中,用与等体积有机溶剂萃取提纯2 5次,合并有机溶~
剂萃取提纯相,减压浓缩成精制样品M2;
(3) 微孔树脂脱色素:精制样品M2,用重量比2 5倍量的甲醇水体系溶解,用微孔树脂~
层析纯化,用80%-90%甲醇和水混合溶剂系统洗脱,合并洗脱液,减压浓缩成精制样品M3;
(4) 正相硅胶柱层析富集目标化合物划段:将精制样品M3用重量比2 3倍量的易溶溶~
剂溶解,用浸膏重1 3倍的200 300目或者80 100目硅胶拌样,然后用正相硅胶柱层析富集~ ~ ~
目标化合物纯化(装柱硅胶为100 200目),用量为精制样品M3重量的5 10倍;用体积比为1:
~ ~
0 0:1的混合有机溶剂梯度洗脱,冲柱、收集和浓缩,经硅胶薄层层析检测,合并分离系数相~
同的点,得到纯度低的含有(±)-修正的玛咖硫脲B的混合物;
(5) 制备高效液相色谱富集:用制备高效液相色谱,以体积含量30 80%乙腈 (或40~ ~
90%甲醇) 水溶液洗脱得到的洗脱液,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B的粗品,纯度为40
60%。该步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以30 80%乙腈 (或40 90%甲醇) 水溶液为流~ ~ ~
动相,流速10 14 mL/min,21.2× 250mm,5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相,~
紫外检测器检测波长为203和306nm,每次进样10 1000μL,收集10 25min的色谱峰,相同步~ ~
骤多次累加后,用旋转蒸发仪蒸干,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B的粗品;
(6) 半制备高效液相色谱纯化:(±)-修正的玛咖硫脲B的粗品经半制备高效液相色谱分离纯化,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B纯品,纯度为90 98%。该步骤所述的高效液相~
色谱分离纯化是以30 80%乙腈 (或40 90%甲醇) 水溶液为流动相,流速1 4mL/min,9.4×~ ~ ~
250mm,10μm的Zorbax SB-C18反相半制备柱为固定相,DAD检测器检测波长为203、220、254、
265和306nm,每次进样1 100μL,收集10 25min的色谱峰,相同步骤多次累加后,用旋转蒸发~ ~
仪蒸干,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B的纯品。
酸乙酯、正丁醇、异丙醇、环己烷或者石油醚,其体积配比为10:1,9:1,8:2,7:3,6:4,1:1,1:
2和0:1等。
取自然风干的产自云南丽江的独行菜属植物玛咖 (Lepidium meyenii) 的根50kg,粗粉碎至50目,70%的丙酮水冷浸并超声提取3次,每次60min,提取液减压抽滤,合并,用旋转蒸发仪减压浓缩至无丙酮的混悬液;静置,滤除沉淀物,浓缩成10kg玛咖粗提物的浓缩样品M1;在玛咖粗提物的浓缩样品M1中加入20kg水,用与水等体积的氯仿萃取5次,合并萃取相,减压浓缩成500g精制样品M2;精制样品M2用MCI装柱,在精制样品M2中加入1000g的80%甲醇水体系溶解,然后上柱,用90%甲醇水8 10升洗脱,收集洗脱液,减压浓缩得到400g精制样品~
M3;精制样品M3中加入900g的丙酮溶解,然后加入80目硅胶600g拌样,拌样后上柱,用200目硅胶4000g装柱;用体积比分别为10:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,冲柱、收集和浓缩,经硅胶薄层层析检测,合并分离系数相同的点,得到6个部分,其中,第二部分(体积比9:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液所得)样品35g,再重复正相硅胶柱层析富集目标化合物,用体积比分别为10:1,8:1,5:1,2:1,0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,冲柱、收集和浓缩,经硅胶薄层层析检测,合并分离系数相同的点,得到五个部分,其中第四部分,即2:1部分约24g, 再以50%的甲醇为流动相,流速12 mL/min,21.2×250mm,5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相,紫外检测器检测波长为
203和306 nm,每次进样100μL,收集10 20min的色谱峰,相同步骤多次累加后,用旋转蒸发~
仪蒸干,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B的粗品180mg;(±)-修正的玛咖硫脲B的粗品再经半制备高效液相色谱分离纯化,以85%甲醇水溶液为流动相,流速3 mL/min,9.4×250 mm,10 μm的Zorbax SB-C18反相半制备柱为固定相,DAD检测器检测波长为203、220、254、
265和306nm,每次进样35μL,收集12.5min的色谱峰,相同步骤多次累加后,用旋转蒸发仪蒸干,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B的纯品55mg,纯度为90 98%。
~
品M3中加入100g的丙酮溶解,然后加入80目硅胶60g拌样,拌样后上柱,用200目硅胶400g装柱;用体积比分别为10:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,冲柱、收集和浓缩,经硅胶薄层层析检测,合并分离系数相同的点,得到6个部分,其中,第二部分(体积比9:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液所得)样品7g,再重复正相硅胶柱层析富集目标化合物,用体积比分别为10:1,8:1,5:1,2:1,0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,冲柱、收集和浓缩,经硅胶薄层层析检测,合并分离系数相同的点,得到五个部分,其中第四部分,即2:1部分约2g, 再以40%的甲醇为流动相,流速12 mL/min,21.2×
250mm,5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相,紫外检测器检测波长为203和306nm,每次进样80μL,收集10 20min的色谱峰,相同步骤多次累加后,用旋转蒸发仪蒸干,即得所~
述的(±)-修正的玛咖硫脲B的粗品25mg;(±)-修正的玛咖硫脲B的粗品再经半制备高效液相色谱分离纯化,以80%甲醇水溶液为流动相,流速3 mL/min,9.4×250 mm,10μm的Zorbax- SB-C18反相半制备柱为固定相,DAD检测器检测波长为203、220、254、265和306nm,每次进样
35μL,收集18min的色谱峰,相同步骤多次累加后,用旋转蒸发仪蒸干,即得所述的(±)-修正的玛咖硫脲B的纯品10mg,纯度为90 98%。
~
(1)紫外光谱(溶剂为甲醇),λmax (log ε):220 (0.32), 248 (0.28), 275 (0.35) nm;
+ 1 13
(2)ESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 307 [M + H] ;H 和 C NMR谱(图1和图2)给出其分子式为C15H18N2O3S。
15.0 Hz, 2H, H2-1a), 4.21 and 3.53 (m, 2H, H2-7), 3.91 and 3.70 (d, J = 12.0 Hz, 2H, H2-9), 3.77 (s, 3H, OMe), 2.13 (m, 2H, H2-6), 1.98 and 1.89 (m, 2H, H2-5); 13C NMR (125 MHz, in CDCl3): δC 188.0 (s, C-1), 175.8 (s, C-3), 159.8 (s, C-4a), 137.2 (s, C-2a), 129.6 (d, C-6a), 120.5 (d, C-7a), 113.5 (d, C-
3a), 113.5 (d, C-5a), 75.1 (s, C-4), 64.0 (t, C-9), 55.3 (q, OMe), 48.7 (t, C-7), 45.3 (t, C-1a), 27.9 (t, C-5), 25.6 (t, C-6)。
2H, H2-1a) 以及一个1,3-二取代苯环7.21 (t, J = 7.9 Hz, 1H, H-6a),7.00 (d, J =
7.5 Hz, 1H, H-7a),6.95 (brs,1H, H-3a)和6.79 (brd, J = 7.8 Hz, 1H, H-5a) 构成。
其它7个碳原子属于骨架上的信号,包括了四个典型的亚甲基信号δC 48.7 (t, C-7),64.0 (t, C-9),27.9 (t, C-5)和25.6 (t, C-6),一个含杂原子季碳信号75.1 (s, C-4),一个酯基信号175.8 (s, C-3)和一个硫羰基信号188.0 (s, C-1),其相应的氢谱数据分别为:
4.21 and 3.53 (m, 2H, H2-7),3.91 and 3.70 (d, J = 12.0 Hz, 2H, H2-9),2.13 (m,
2H, H2-6)和1.98 and 1.89 (m, 2H, H2-5)。结合二维核磁共振,确定这7个碳原子与杂原子构成两个杂环,其中C-1,N-2,C-3,C-4和N-8构成一个2-thioxoimidazolidin-4-one片段,而C-4,C-5,C-6,C-7,C-9和N-8则构成pyrrolidine片段,这两个片段构成一个罕见的4-methyl-hexahydropyrrolo[1,2-c]imidazole母核,其中,连接在C-4位上的C-9被氧化。最后,母核4-methyl-hexahydropyrrolo[1,2-c]imidazole与be-nzyl的取代基的连接顺序通过关键H2-1a 与C-1/C-3的HMBC相关确定。因此,该生物碱的平面结构得以确定,为一个具有新颖骨架类型的天然产物,命名为(±)-修正的玛咖硫脲B,英文名为(±)-
macahydantoin revised B,系统名为3-benzyl-5-hydroxy-2-thioxo-1,3-diazabicyclo[3.3.1]nonan-4-one。
五株细胞株分别为早幼细胞(HL-60)、肺癌细胞(A549)、人神经母细胞瘤细胞
(SHSY5Y)、前列腺癌细胞(PC3)和乳腺癌细胞(MCF7),均由中国科学院上海药物研究所提供。
阳性对照为顺铂,用生理盐水溶解。每孔分别加入10μL不同浓度的样品(1号试液-5号试液)。加样组及对照组均设4个复孔,加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔,每块板均设有4个空白对照孔 (仅加培养基)。样品的终浓度分别为10-2、10-1、1、10及102 µg/mL,相应DMSO的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样品在终浓度
102µg/mL时,用0.1% DMSO作为溶剂对照,其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药-1
顺铂的终浓度为10 、1、10 µg/mL。细胞在37摄氏度,5% CO2培养箱中分别孵育48小时后,加入MTT (5 mg/ml, Sigma),10 µL/孔。继续培养4小时后,加入三联液 [10% SDS-5%异丁醇-
0.012mol/L HCL (w/v/v)],100 µL/孔,放置过夜后用酶标仪在570nm、630nm双波长下测定各孔的OD值。