从细胞中有效提取蛋白质的方法

摘要

本发明提供了用于从细胞，诸如包含病毒蛋白的细胞或细胞样品中产生蛋白质提取物的方法。概括地，所述方法可以包括：增高所述细胞的pH到至少约pH 10.0，从而产生中间组合物，和然后，在存在非离子型洗涤剂如聚氧乙烯烷基醚的条件下，中和所述中间组合物的pH，从而产生蛋白质提取物。所述方法可以与用于检测样品中的一种或多种靶蛋白，诸如病毒蛋白的方法联合使用。本发明还提供了用于实践本主题方法的系统、试剂盒和组合物。

权利要求

1.用于从固定的或未固定的细胞产生蛋白质提取物的方法，所述方法包括：a)使所述细胞与提取试剂相接触，从而产生具有至少约pH10.0的pH的中间组合物，和b)使所述中间组合物与中和试剂相接触，从而中和所述中间组合物的所述pH，并产生所述蛋白质提取物，其中，所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚。

2.检测早先已知或否则表征的靶蛋白的方法，所述方法包括：a)按照权利要求1的方法从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物；和b)检验所述蛋白质在所述蛋白质提取物中的存在。

3.用于按照权利要求1的方法产生蛋白质提取物的系统，所述系统包括：a)包含固定的或未固定的细胞的细胞样品，b)具有至少约pH10.0的pH的提取试剂，和c)中和试剂，

其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。

4.用于从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物的试剂盒，所述试剂盒包括：a)具有至少约pH10.0的pH的提取试剂；

b)中和试剂；和

c)用于利用所述提取试剂和所述中和试剂进行权利要求1的方法的说明书；

其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。

5.用于从细胞样品中提取靶病毒蛋白的方法，所述方法包括：a)使包含存在或怀疑存在靶病毒蛋白的细胞的细胞样品与提取试剂相接触，从而产生具有至少约pH10.0的pH的中间组合物；和b)使所述中间组合物与中和试剂相接触，从而中和所述中间组合物的所述pH，并产生所述靶病毒蛋白提取物，其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。

说明书

从细胞中有效提取蛋白质的方法

[0001] 本申请是2008年11月14日提交的发明名称为“从细胞中有效提取蛋白质的方法”的第200880124680.0号(国际申请号PCT/US2008/083707)中国专利申请的分案申请。

[0002] 发明背景

[0003] 在许多诊断方法中，从受试者中获取细胞并将其存放在含有固定剂的液体培养基中。将细胞固定在培养基中，并通过细胞学方法对其进行检查，从而提供诊断。例如，检测子宫颈组织中的癌前或癌细胞通常通过显微镜评估剥离的子宫颈细胞进行。这种由George 
N.Papanicolaou开发并称为“Pap”检验的方法包括利用取样装置从女性子宫颈剥离细胞，将剥离的细胞存放在含有固定剂的运送培养基中，然后将该细胞放置在载玻片上。然后，染色细胞，并由受过训练的医学专业人员通过光学显微镜法检查细胞的异常性。仅在美国，每年进行超过五千五百万次的Pap检验。

[0004] 尽管该细胞学检验很成功，但是该检验容易出错。例如，估计多至40％的常规Pap检验受到存在污染物诸如粘液、血细胞和不明显的炎性细胞的危害。这些污染物引起假阴
性结果、假阳性结果、和非常大量的后继工作量。参见，例如，Koss，L.G.(1989)，用于子宫颈癌检测的巴帕尼科拉乌试验：成功和灾难(The Papanicolaou Test for Cervical Cancer Detection：A Triumph and a Tragedy)，JAMA 261：737-743；还参见DeMay，“Pap涂片解释中的问题”(″Problems in Pap Smear Interpretation″)，病理学实验室医学纪录
(Arch.Pathol.Lab.Med.)121：229-23(1997)。

[0005] 鉴于上述内容，存在着对用于分析在含有固定剂的液体培养基中存在的细胞的补充分子诊断方法的需要。然而，该方法不是直接的，因为不总是可能在固定的细胞上进行该方法。例如，某些固定剂(例如，THINPREPTM或SUREPATHTM检验系统中使用的那些运送培养基)可以导致特定的细胞蛋白沉淀或聚集，由此使得那些蛋白质不能溶解并难于或不可能
通过常规方法，例如利用酶联免疫吸附测定(ELISA)或其他免疫学检验，而得到可靠的检
测。

[0006] 因此，存在着对从固定的细胞和未固定的细胞中，以这样的方式提取蛋白质的方法和组合物的巨大需要，所述方式容许提取的蛋白质适合于在分子检测测定，例如免疫学
检测测定中使用。本文描述的发明满足了这一需要以及其他需要。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明提供了用于从细胞中产生蛋白质提取物的方法。概括地，该方法包括：使细胞样品与包含聚氧乙烯烷基醚(例如，BrijTM 35)的高pH(至少约pH 10)提取试剂接触，从而产生中间组合物，然后，在存在中和试剂的条件下，中和所述中间组合物的pH，例如，至pH值约为6-9，任选地至pH值为7-8.5，从而产生所述蛋白质提取物。在某些实施方案中，提取试剂和中和试剂中之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。细胞可以是固定的或未固定的剥离的子宫颈细胞。在某些实施方案中，该方法包括从细胞样品中提取靶病毒蛋白，如HPV E6蛋白。
本发明还提供用于检测蛋白如靶病毒蛋白的存在的方法，其包括按照上述方法从固定的或
未固定的细胞生产蛋白质提取物，并且检测所述蛋白在所述蛋白质提取物中的存在。另外，本发明提供用于生产蛋白质提取物的系统，其包括：a)包含固定的或未固定的细胞的细胞
样品；b)pH至少约为10.0的提取试剂，和c)中和试剂，其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚，并且其中所述提取试剂和中和试剂可以用在上述方法中以
产生适用于结合测定的蛋白质提取物。此外，本发明提供用于从固定的或未固定的细胞生
产蛋白质提取物的试剂盒。所述试剂盒还可以包括用于检测所述蛋白质提取物中的靶蛋白
的成分和/或试剂。

[0009] 具体而言，本发明涉及：

[0010] 1.用于从固定的或未固定的细胞产生蛋白质提取物的方法，所述方法包括：

[0011] a)使所述细胞与提取试剂相接触，从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物，和

[0012] b)使所述中间组合物与中和试剂相接触，从而中和所述中间组合物的所述pH，并产生所述蛋白质提取物，

[0013] 其中，所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者含有聚氧乙烯烷基醚。

[0014] 2.段1的方法，其中所述方法包括：

[0015] a)使所述细胞与提取试剂相接触，从而产生具有至少约pH10.0的pH的中间组合物，其中所述提取试剂含有聚氧乙烯烷基醚；和

[0016] b)使所述中间组合物与中和试剂相接触，从而中和所述中间组合物的所述pH，并产生pH约为6-9的所述蛋白质提取物。

[0017] 3.段1的方法，其中所述方法包括：

[0018] a)使所述细胞与提取试剂相接触，从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物；和

[0019] b)使所述中间组合物与中和试剂相接触，从而中和所述中间组合物的所述pH，并产生pH约为6-9的所述蛋白质提取物，其中所述中和试剂包含聚氧乙烯烷基醚。

[0020] 4.段1的方法，其中所述聚氧乙烯烷基醚为BrijTM表面活性剂。

[0021] 5.段4的方法，其中所述BrijTM表面活性剂为BrijTM 35。

[0022] 6.段5的方法，其中所述BrijTM 35在提取试剂中的浓度在约2-6％(v/v)之内。

[0023] 7.段6的方法，其中所述提取试剂还包括约0.1N NaOH，50mM柠檬酸三钠，且具有约12.5-12.9的pH。

[0024] 8.段7的方法，其中所述提取试剂还包括TritonTM洗涤剂或TweenTM洗涤剂，或其混合物。

[0025] 9.段7的方法，其中所述提取试剂还包括TritonTM X-100洗涤剂或TweenTM-20洗涤剂，或其混合物。

[0026] 10.段9的方法，其中所述TritonTM X-100或TWEEN-20TM洗涤剂或二者的浓度在约1-6％(v/v)之内。

[0027] 11.段1的方法，其中所述中和试剂为基于Tris的缓冲液。

[0028] 12.段1的方法，其中在加入所述提取试剂后，温育所述样品至少10分钟。

[0029] 13.段1的方法，其中在加入所述提取试剂后，温育所述样品10-30分钟。

[0030] 14.段1的方法，其中在加入所述中和试剂后，温育所述样品至少10分钟。

[0031] 15.段1的方法，其中在加入所述中和试剂后，温育所述样品10-30分钟。

[0032] 16.段4的方法，其中所述BrijTM表面活性剂为下列中的一种或多种：BrijTM 35聚氧乙烯(23)月桂醚，(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～23)：BrijTM 30聚氧乙烯(4)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～4)；BrijTM 52，聚氧乙烯(2)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～
2)；BrijTM 56聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 58，聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 72聚氧乙烯(2)十八烷醚，(C18H37
(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 76，聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～10)；
BrijTM 78聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 92，聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 93，聚氧乙烯(2)油基醚；(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～TM TM
2)；Brij  97，聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～10)；Brij  98，聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 700，聚氧乙烯(100)十八烷醚，(C18H37
(OCH2CH2)21OH，n～100)；或BrijTM 721，聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～
21)。

[0033] 17.段1的方法，其还包括：

[0034] 在步骤a)前，获得包括所述固定的或未固定的细胞的细胞样品，其中所述细胞样品包含或被怀疑包含靶蛋白。

[0035] 18.段17的方法，其中所述细胞是固定的子宫颈细胞，并且所述靶蛋白是人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白。

[0036] 19.段18的方法，其中所述固定的细胞存在于SUREPATHTM、CYTOLYTTM、THINPREPTM或PRESERVCYTTM运送培养基中。

[0037] 20.段17的方法，其中所述细胞是未固定的子宫颈细胞，并且所述靶蛋白是人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白。

[0038] 21.段17的方法，其中所述细胞样品获自个人。

[0039] 22.段1的方法，其中所述pH处于约pH 11.0-约pH 13.0的范围内。

[0040] 23.段1的方法，其中所述提取试剂还包括变性剂。

[0041] 24.段23的方法，其中所述变性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素或十二烷基肌氨酸钠。

[0042] 25.段1的方法，其还包括通过滤器过滤所述蛋白质提取物的步骤。

[0043] 26.段25的方法，其中所述滤器具有0.1μm-50.0μm的孔径。

[0044] 27.段25的方法，其中所述滤器包括下列各项：聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚(对苯二甲酸乙二酯)，人造丝，尼龙，聚(丁酸乙烯酯)，聚偏二氟乙烯(PVDF)，硅氧烷，聚甲醛，纤维素，醋酸纤维素，硝化纤维素，玻璃纤维滤纸，聚氯乙烯，聚乙酸乙烯酯，乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物，聚酰胺，聚碳酸酯，奥纶，聚酯，聚苯乙烯或它们的任意组合。

[0045] 28.检测早先已知或否则表征的靶蛋白的方法，所述方法包括：

[0046] a)按照段1的方法从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物；和

[0047] b)检验所述蛋白质在所述蛋白质提取物中的存在。

[0048] 29.段28的方法，其中所述检验使用关于所述靶蛋白的捕获剂。

[0049] 30.段28的方法，其中所述检验包括免疫学测定。

[0050] 31.段30的方法，其中所述测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。

[0051] 32.段30的方法，其中所述测定是免疫色谱测定或侧向流动(LF)测定。

[0052] 33.段32的方法，其中所述测定使用单克隆抗体-缀合的金粒子。

[0053] 34.段30的方法，其中所述测定使用荧光标记的单克隆抗体。

[0054] 35.段30的方法，其中所述测定使用化学发光粒子、有色/染色的胶乳粒子、SERS拉曼粒子、具有多种报告染料的硅石-包被的金核、或具有报告染料的硅石-包被的银核。

[0055] 36.段30的方法，其中所述测定使用一种或多种单克隆抗体的连续应用。

[0056] 37.段28的方法，其中所述检验使用细胞计数珠阵列(CBA)或多元珠测定。

[0057] 38.段28的方法，其中所述靶蛋白是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白，且所述检验使用与HPV E6蛋白结合的PDZ结构域多肽。

[0058] 39.段28的方法，其中所述未固定的细胞是剥离的子宫颈细胞。

[0059] 40.段28的方法，其中所述固定的细胞是剥离的子宫颈细胞。

[0060] 41.段28的方法，其中在所述接触步骤a)之前，从远程位置接收所述固定的或未固定的细胞。

[0061] 42.段28的方法，其还包括：

[0062] d)将所述检验的结果传达到远程位置。

[0063] 43.用于按照段1的方法产生蛋白质提取物的系统，所述系统包括：

[0064] a)包含固定的或未固定的细胞的细胞样品，

[0065] b)具有至少约pH 10.0的pH的提取试剂，和

[0066] c)中和试剂，

[0067] 其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。

[0068] 44.段43的系统，其中所述聚氧乙烯烷基醚是BrijTM洗涤剂。

[0069] 45.段44的系统，其中所述BrijTM洗涤剂为BrijTM 35。

[0070] 46.段43的系统，其还包括用于检测所述蛋白质提取物中的靶蛋白的试剂。

[0071] 47.段43的系统，其还包括滤器。

[0072] 48.段47的系统，其中所述滤器具有0.1μm-50.0μm的孔径。

[0073] 49.段47的系统，其中所述滤器包括下列各项：聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚(对苯二甲酸乙二酯)，人造丝，尼龙，聚(丁酸乙烯酯)，聚偏二氟乙烯(PVDF)，硅氧烷，聚甲醛，纤维素，醋酸纤维素，硝化纤维素，玻璃纤维滤纸，聚氯乙烯，聚乙酸乙烯酯，乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物，聚酰胺，聚碳酸酯，奥纶，聚酯，聚苯乙烯或它们的任意组合。

[0074] 50.用于从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物的试剂盒，所述试剂盒包括：

[0075] a)具有至少约pH 10.0的pH的提取试剂；

[0076] b)中和试剂；和

[0077] c)用于利用所述提取试剂和所述中和试剂进行段1的方法的说明书；

[0078] 其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。

[0079] 51.段50的试剂盒，其中所述聚氧乙烯烷基醚是BrijTM洗涤剂。

[0080] 52.段51的试剂盒，其中所述BrijTM洗涤剂为BrijTM 35。

[0081] 53.段50的试剂盒，其还包括用于检测所述蛋白质提取物中的靶蛋白的试剂。

[0082] 54.段53的试剂盒，其中所述试剂包括关于所述靶蛋白的捕获剂。

[0083] 55.段54的试剂盒，其中所述靶蛋白是HPV E6蛋白，并且所述捕获剂为针对所述HPV E6蛋白的单克隆抗体或结合所述HPV E6蛋白的PDZ结构域多肽。

[0084] 56.用于从细胞样品中提取靶病毒蛋白的方法，所述方法包括：

[0085] a)使包含存在或怀疑存在靶病毒蛋白的细胞的细胞样品与提取试剂相接触，从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物；和

[0086] b)使所述中间组合物与中和试剂相接触，从而中和所述中间组合物的所述pH，并产生所述靶病毒蛋白提取物，

[0087] 其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包含聚氧乙烯烷基醚。

[0088] 57.段56的方法，其中所述聚氧乙烯烷基醚是BrijTM表面活性剂。

[0089] 58.段57的方法，其中所述BrijTM表面活性剂是BrijTM 35，其以约2-6％(v/v)的浓度包含在所述提取试剂中。

[0090] 59.段58的方法，其中所述提取试剂还包含约0.1N NaOH，50mM柠檬酸三钠，并且pH为12.5-12.9。

[0091] 60.段59的方法，其中所述提取试剂还包含TritonTM洗涤剂或TweenTM洗涤剂，或其混合物。

[0092] 61.段60的方法，其中所述提取试剂还包含TritonTM X-100洗涤剂或TweenTM-20洗涤剂，或其混合物。

[0093] 62.段61的方法，其中所述TritonTM X-100或TWEEN-20TM洗涤剂或二者的浓度在约2-6％(v/v)之内。

[0094] 63.段56的方法，其中所述中和试剂是基于Tris的缓冲液。

[0095] 64.段56的方法，其中在加入所述提取试剂后，温育所述样品10-30分钟。

[0096] 65.段56的方法，其中在加入所述中和试剂后，温育所述样品10-30分钟。

[0097] 66.段57的方法，其中所述BrijTM表面活性剂为下列中的一种或多种：BrijTM 35聚氧乙烯(23)月桂醚，(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～23)：BrijTM 30聚氧乙烯(4)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～4)；BrijTM 52，聚氧乙烯(2)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 56聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 58，聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 72聚氧乙烯(2)十八烷醚，(C18H37
(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 76，聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～10)；
BrijTM 78聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 92，聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 93，聚氧乙烯(2)油基醚；(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～
2)；BrijTM 97，聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 98，聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 700，聚氧乙烯(100)十八烷醚，(C18H37
TM
(OCH2CH2)21OH，n～100)；或Brij  721，聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～
21)。

[0098] 67.段56的方法，其中所述细胞样品中的细胞用化学固定剂固定。

[0099] 68.段67的方法，其中所述化学固定剂选自由下列各项组成的组：醇、醛、酮、四氧化锇、乙酸、苦味酸、重金属离子盐、和丙二醇。

[0100] 69.段68的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇；所述醛是戊二醛或甲醛；且所述酮是丙酮。

[0101] 70.段67的方法，其中所述固定的细胞存在于SUREPATHTM、CYTOLYTTM、THINPREPTM或PRESERVCYTTM运送培养基中。

[0102] 71.段56的方法，其还包括：

[0103] 在步骤a)前接收所述细胞样品。

[0104] 72.段56的方法，其中所述靶病毒蛋白由致病病毒编码。

[0105] 73.段72的方法，其中所述致病病毒选自由下列各项组成的组：HIV、依波拉病毒、马尔堡病毒、肝炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、和人乳头瘤病毒(HPV)。

[0106] 74.段56的方法，其中所述靶病毒蛋白是HPV的E6或E7蛋白。

[0107] 75.段74的方法，其中所述HPV是HPV毒株4，6，11，20，24，28，36，48，50，16，18，31，35，30，39，45，51，52，56，59，58，33，66，68，69，26，53，73，或82。

[0108] 76.段74的方法，其中所述HPV是致癌HPV毒株，所述致癌HPV毒株选自由下列各项组成的组：HPV 26，HPV 53，HPV 66，HPV 73，HPV 82，HPV 16，HPV 18，HPV 31，HPV 35，HPV 
30，HPV 39，HPV 45，HPV 51，HPV 52，HPV 56，HPV 59，HPV 58，HPV 33，HPV 68，HPV 69，和HPV 82。

[0109] 77.段56的方法，其还包括：

[0110] 检测所述靶病毒蛋白在所述提取物中的存在。

[0111] 78.段77的方法，其中所述检测使用关于所述靶病毒蛋白的捕获剂。

[0112] 79.段78的方法，其中所述病毒蛋白是HPV的E6蛋白；且所述捕获剂是针对所述E6蛋白的抗体。

[0113] 80.段78的方法，其中所述病毒蛋白是HPV的E6蛋白；且所述捕获剂包括包含PDZ结构域的多肽。

[0114] 81.段78的方法，其中所述病毒蛋白是HPV的E6蛋白，并且所述捕获剂包括针对所述E6蛋白的抗体和包含PDZ结构域的多肽二者。

[0115] 82.段78的方法，其中所述病毒蛋白是HPV的E6蛋白；且所述捕获剂包括BP或AP肽。

[0116] 83.段78的方法，其中所述PDZ结构域是MAGI-1的第二结构域、或者是DLG或TIP1的PDZ结构域。

[0117] 84.段56的方法，其中所述细胞样品还含有粘液、血液或痰液。

[0118] 85.段56的方法，其中所述细胞样品含有剥离的子宫颈细胞。

[0119] 86.段77的方法，其中所述检测包括免疫学测定。

[0120] 87.段86的方法，其中所述测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。

[0121] 88.段86的方法，其中所述测定是免疫色谱测定或侧向流动(LF)测定。

[0122] 89.段86的方法，其中所述测定使用单克隆抗体-缀合的金粒子。

[0123] 90.段86的方法，其中所述测定使用荧光标记的单克隆抗体。

[0124] 91.段86的方法，其中所述测定使用化学发光粒子、有色/染色的胶乳粒子、SERS拉曼粒子、或具有报告染料的硅石-包被的金核或银核。

[0125] 92.段86的方法，其中所述测定使用一种或多种单克隆抗体的连续应用。

[0126] 93.段77的方法，其中所述检测使用细胞计数珠阵列(CBA)或多元珠测定。

[0127] 附图简述

[0128] 图1A显示使用与某些添加剂组合的具有高pH的提取试剂对检测提取的HPV16 E6蛋白的增效作用。按照本文所述的流程，将预先纯化的重组HPV16 E6蛋白(MBP-E6)悬浮在
提取试剂中，然后用中和试剂中和。E6蛋白用本文所述的侧向流动(LF)测定法捕获并用UMM读取仪检测。

[0129] 图1B支持在中和阶段引入添加剂对检测提取的HPV16 E6蛋白的影响不如在提取阶段过程中引入的影响强。

[0130] 图2显示在提取试剂中使用多种添加剂检测由表达HPV 16的SiHa细胞提取的HPV16 E6蛋白。

[0131] 图3显示滴定细胞浓度对提取的HPV16 E6蛋白的检测的影响。使用两种HPV-阳性和一种HPV-阴性细胞系。

[0132] 图4显示从掺有表达HPV 16的SiHa细胞的未固定的阴性临床样品提取HPV16 E6蛋白。

[0133] 图5显示当提取试剂中BrijTM 35浓度增加时和当BrijTM 35与其他非离子洗涤剂如TritonTM X-100或TweenTM-20组合时对提取的HPV16 E6蛋白的检测的影响。

[0134] 图6显示当使用不同的提取和/或中和时间时对提取的HPV16 E6蛋白的检测的影响。

[0135] 图7显示使用4％BrijTM 35/高pH缓冲液2提取源自HPV毒株18和45的E6蛋白。

[0136] 图8显示对来源于HPV毒株16和18的E6蛋白的检测的剂量-反应影响。

[0137] 图9显示对提取试剂中BrijTM 35浓度(有或无其他非离子添加剂)的进一步优化。

[0138] 图10显示对提取试剂中BrijTM 35浓度(有或无其他非离子添加剂)的进一步优化，和对由掺有表达HPV的细胞的未固定的临床阴性样品提取HPV16 E6蛋白的影响。

[0139] 图11显示检测由表达HPV的SiHa细胞提取的HPV16 E6蛋白的细胞计数珠阵列(CBA)形式。

[0140] 图12显示在由固定的或未固定的细胞提取HPV16 E6蛋白中使用4％BrijTM 35/高pH缓冲液2。

[0141] 图13显示样品通过5.0mm Millipore PVDF注射器滤器过滤不显著减小样品的信号。

[0142] 定义

[0143] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管如此，为了清楚和容易参考起见，在下文中定义了某些要素。

[0144] 当用于本文时，术语“细胞样品(cellular sample)”或“细胞样品(cell sample)”涉及含有一种或多种目的细胞的液体组合物。细胞样品可以是含有从个体取出(例如，切除或剥离)的细胞的临床样品，所述细胞包括但不仅限于，例如，来自血浆、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮肤表面部分(external sections)、呼吸道、肠道、和生殖泌尿道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、或器官的细胞。在其他实施方案中，细胞样品可以包含体外生长的细胞(包括但不仅限于在细胞培养基中的细胞、病毒感染的细胞、重组细胞等)。在某些实施方案中，细胞样品可以包含最容易被HPV感染的细胞。在这些实施方案中，可以从子宫颈、外阴、阴道、肛门、阴茎、口腔或喉咙中获得细胞。在某些实施方案中，细胞来自粘膜，并可以是上皮来源的。除剥离或切除的细胞外，细胞样品可以或可以不包含污染物。例如，粘液细胞、或细菌细胞、酵母细胞或血细胞可以存在于细胞样品中。

[0145] “HPV”是人乳头瘤病毒属(Papillomavirus)，其包括但不限于HPV毒株4、6、11、20、24、28、36、48、50、16、18、31、35、30、39、45、51、52、56、59、58、33、66、68、69、26、53、73、和82。

[0146] “致癌HPV毒株”是已知为如由国家癌症研究所(NCI，2001)确定的引起子宫颈癌的HPV毒株。

[0147] “致癌E6蛋白”是由致癌HPV毒株编码的E6蛋白。示范性的致癌毒株是：HPV 26、HPV 53、HPV 66、HPV 73、HPV 82、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 35、HPV 30、HPV 39、HPV 45、HPV 
51、HPV 52、HPV 56、HPV 59、HPV 58、HPV 33、HPV 66、HPV 68、HPV 69、和HPV 82。致癌E6蛋白的氨基酸序列存放在NCBI基因库(NCBI′s GenBank)数据库中。虽然不希望受到理论的限制，但是通常认为HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、和50不是致癌的。

[0148] 术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。术语“多肽”包括这样的多肽和肽，在所述多肽中用非-天然存在的或合成的主链替换常规主链，且在所述肽中用一个或多个非-天然存在的或合成的氨基酸替换一个或多个常规氨基酸。

[0149] 术语“融合蛋白”或其语法等价物指包括许多多肽成分的蛋白质，所述多肽成分在不以它们的天然状态附着时，由它们各自的氨基和羧基末端通过肽键连接，从而形成单一连续多肽。融合蛋白可以是2种、3种或甚至4种以上不同蛋白质的组合。术语多肽包括融合蛋白，其包括但不仅限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，融合体，具有异源和同源前导序列，具有或不具有N-末端的甲硫氨酸残基；免疫学标记的蛋白质；具有能检测的融合配偶体的融合蛋白，例如包括荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等作为融合配偶体的融合蛋白。

[0150] 通常，多肽可以是任意长度，例如多于2个氨基酸，多于4个氨基酸，多于约10个氨基酸，多于约20个氨基酸，多于约50个氨基酸，多于约100个氨基酸，多于约300个氨基酸，通常至多约500或1000个以上氨基酸。“肽”通常为多于2个氨基酸，多于4个氨基酸，多于约10个氨基酸，多于约20个氨基酸，通常至多约50个氨基酸。在一些实施方案中，肽长度为5-30个氨基酸。多肽可以是天然的，因为它们可以由生物体或病毒的基因组编码，或是非-天然的，因为它们是非天然存在的。

[0151] 术语“捕获剂”指通过这样的相互作用结合蛋白质的试剂，所述相互作用足以允许该试剂结合并且浓缩来自不同蛋白的均匀混合物中的蛋白质。因此，术语“捕获剂”指这样的分子或多分子复合物，其能够以低于约10-6M的解离常数(KD)，特异性结合分析物，例如，特异性结合关于所述捕获剂的分析物，而不结合其他靶标。该结合相互作用可以由捕获剂的亲合区域介导。代表性的捕获剂包括抗体(包括其片段和模拟体)和含有PDZ结构域的蛋
白质等。

[0152] 术语“特异性结合”指捕获剂优先结合不同蛋白质的均匀混合物中存在的特定蛋白质的能力。在某些实施方案中，特异性结合相互作用应该区样品中的特定蛋白质和其他
蛋白质，在一些实施方案中，超过约10-100倍以上(例如，超过约1000-或10,000-倍)。

[0153] 术语“捕获剂/蛋白质复合物”是由捕获剂与蛋白质的特异性结合产生的复合物，即“结合配偶体对”。捕获剂和关于该捕获剂的蛋白质在“适合于特异性结合的条件”下，彼此特异性结合，其中所述条件是容许在处于溶液中的捕获剂和待结合的蛋白质之间发生结
合的那些条件(在盐浓度、pH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等方面)。该条件，特别是关于抗体和它们的抗原，是本领域中众所周知的(见，例如，Harlow和Lane，抗体：冷泉港实验室实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港
(Cold Spring Harbor)，纽约(1989))。在某些实施方案中，在捕获剂/蛋白质复合物中特异性结合的捕获剂和蛋白质之间的亲和性由KD(解离常数)表征，所述KD低于10-6M，低于10-7M，低于10-8M，低于10-9M，或低于约10-10M。

[0154] “结合配偶体”和等价物指能够存在于捕获剂/分析物复合物中的，即表现出彼此间特异性结合的分子对。

[0155] 术语“抗体”和“免疫球蛋白"在本文中可互换使用，指至少具有抗体的表位结合结构域的捕获剂。这些术语是本领域技术人员所熟知的，且指含有一种或多种与抗原特异性结合的多肽。一种抗体形式构成抗体的基本结构单位。该形式是四聚物，且由两对相同的抗体链对组成，每对具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻链和重链可变区共同负责与抗原的结合，且恒定区负责抗体效应子功能。

[0156] 识别的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链和α、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ重链或其他物种中的等价物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包括位于NH2-末端的约110个氨基酸的可变区和位于COOH-末端的κ和λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)，类似地包括可变区(约116个氨基酸)和上述重链恒定区之一，例如γ(约330个氨基酸)。

[0157] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体和免疫球蛋白，保持与抗原特异性结合的抗体片段，其包括但不仅限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、以及包括抗体的抗原-结合部分和非-抗体蛋白的融合蛋白。可以例如利用放射性同位素，产生可检测产物的酶、荧光蛋白等，可检测地标记所述抗体。抗体可以进一步与其他结构部分，诸如特异性结合对成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对
的成员)等缀合。抗体还可以与固相支持体结合，所述固相支持体包括但不仅限于聚苯乙烯平板或珠，金胶粒等。该术语还包括Fab′、Fv、F(ab′)2和或其他保持与抗原特异性结合的抗体片段。抗体还可以与可扩增的检测颗粒联合使用。

[0158] 抗体可以以多种其他形式存在，所述其它形式包括例如，Fv、Fab、和(Fab′)2、以及双-功能(即，双-特异性)杂种抗体(Lanzavecchia等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)17，105(1987))，和以单链存在(例如，Huston等，美国国家科学院学报
(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，85，5879-5883(1988)和Bird等，科学(Science)，242，423-
426(1988)，将其引入本文作为参考)。(通常参见，Hood等，“免疫学”(″Immunology″)，Benjamin，N.Y.，第2版.(1984)，和Hunkapiller和Hood，自然(Nature)，323，15-16(1986))。
单克隆抗体和“噬菌体展示”抗体在本领域中众所周知，且包含在术语“抗体”中。

[0159] 术语“评估”包括任何形式的测量，并包括确定元素是否存在。术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”和“测定”可互换使用，并且可以包括定量和/或定性的确定。评估可以是相对的或绝对的。“评估……的存在”包括确定某物存在的量，和/或确定其是存在还是不存在。

[0160] “远程位置”意指除了获得细胞并将其存放在含有固定剂的液体中的位置以外的位置。例如，远程位置可能是在获得细胞的同一建筑物中的不同房间(例如，另一个实验
室)，在与获得细胞的同一建筑群中的不同建筑物，或同一城市、州或国家中不同的位置，等等。例如，当显示细胞样品是从远程位置“接收”的时，该细胞样品可以从远程位置获得，或从远程位置交送、邮寄或信使递送。

[0161] “传达”信息指使所述信息从一个位置到达另一个位置的任何方法，无论是通过实体传送包含该信息的打印材料或计算机可读媒体(例如，通过邮寄)，还是通过传输信息。如果传输信息，则通过合适的通讯通道(例如，私人的、公共的或无线网络)传输代表该信息的数字或模拟信号(例如，电磁信号，诸如光或电信号)。可以使用任何便利的方法传输数据，例如传真、调制解调器、因特网、电子邮件、等等。

[0162] 用于本文时，术语“运送培养基”用于描述适合于收集细胞和以某种方式保存那些细胞的液体，所述方式是容许它们适合于基于-液体的细胞学研究。Pap检验中普遍使用运送培养基。存放在运送培养基中的细胞可以或可以不在该培养基中，被从一个位置运输到
另一个位置。运送培养基含有固定剂。将细胞存放在运送培养基中固定该细胞，从而产生固TM TM
定的细胞。典型的运送培养基包括SUREPATH 或PRESERVCYT 运送培养基。

[0163] “固定的细胞”是用化学固定剂处理并通过化学固定剂进行细胞学保存的细胞。固定的细胞通常适合于染色和随后通过光学显微镜法进行的形态学和/或细胞学分析。

[0164] 作为参考的引入

[0165] 以如同每篇单独出版物或专利申请特别和分别指出进行参考引用的相同的程度，通过参考将本说明书提及的所有出版物和专利申请引入本文。

[0166] 发明详述

[0167] 尽管在本文中显示和描述了本发明的优选实施方案，但是所述实施方案仅以举例的方式提供，这对于本领域技术人员而言是显然的。现在，在不偏离本发明的条件下，本领域技术人员应该想到许多变体、改变、和替换。应该理解本文中所述发明的实施方案的不同备选方案可以用于实施本发明。下列权利要求意欲定义本发明的范围，且这些权利要求范
围内的方法和结构以及它们的等价物包括在其中。

[0168] 本发明提供了用于从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物的方法。概括地，该方法包括：使细胞样品与包含聚氧乙烯烷基醚(例如，BrijTM35)的高pH(至少约pH 
10.0)的提取试剂接触，从而产生中间组合物，并且然后，在中和试剂的存在下，中和中间组合物的pH，从而产生蛋白质提取物。所述提取试剂和中和试剂之一或二者含有聚氧乙烯烷
基醚。在某些实施方案中，所述细胞可以是固定的或未固定的剥离的子宫颈细胞。本发明还提供了用于实施本主题方法的试剂盒和组合物。本主题方法用于多种不同的应用，包括在
由此产生的蛋白质提取物中检测特殊蛋白质的诊断检验中。

[0169] 进一步描述本发明前，应该理解本发明不受限于以下所述的本发明的特殊实施方案，因为可以产生所述特殊实施方案的变体，并且其仍然属于所附权利要求的范围。还应该理解，所使用的术语是为了描述特殊实施方案的目的，且不意欲进行限制。替代地，本发明的范围应该由所附权利要求确定。

[0170] 在该说明书和所附权利要求中，单数形式“一”(″a″)、“一”(″an″)和“这”(″the″)包括复数涵义，除非上下文另外明确指示。

[0171] 在提供数值范围时，除非上下文另外明确指示，应该理解为本发明包括在该范围上限和下限之间的每个介于其间的数值，直到下限单位的1/10，和该指定范围内的任何其
他指定的或介于其间的数值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该较小的范围
内，并也包括在本发明内，服从于该指定范围内的任何明确排除的界限。当该指定范围包括所述界限之一或二者时，排除那些包括的界限之一或二者的范围也包括在本发明中。

[0172] 除非另外定义，本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员普遍理解的相同的含义。尽管类似于或等价于本文所述内容的任何方法、装置和
材料能够用在本发明的实践或检验中，现在描述优选的方法、装置和材料。

[0173] 出于描述和公开在出版物中所描述的、可以与本文所述的发明联合使用的要素的目的，将本文提及的全部出版物引入本文作为参考。

[0174] 如上总结，本主题发明提供用于从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物的方法和组合物。在对本发明更详细的描述中，首先描述了该方法，随后描述在实践本主题方法中使用的试剂盒和系统。

[0175] 蛋白质提取方法

[0176] 如上所示，本发明提供用于从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物的方法。通常，该方法包括两个步骤：a)使所述固定的或未固定的细胞与具有高于约pH 10.0的pH的提取试剂相接触，从而产生中间组合物，和b)使所述中间组合物与中和试剂相接触。所述提取试剂和/或中和试剂含有聚氧乙烯烷基醚。由此产生的蛋白质提取物含有聚氧乙烯
烷基醚，并具有中性pH(即，约pH 7.0-约pH 8.0)。该方法通常产生含有这样的蛋白质的蛋白质提取物，所述蛋白质可以容易地通过利用有关那些蛋白质的捕获剂检测。同样地，由本方法产生的蛋白质提取物通常适合用于为了检测那些蛋白质的结合测定，例如免疫学测
定。

[0177] 在某些实施方案中，所述方法包括：a)使细胞与包含聚氧乙烯烷基醚和高pH的提取试剂相接触，从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物；和b)使所述中间组合物与中和试剂相接触，从而中和所述中间组合物的所述pH并产生蛋白质提取物。由于，如上所
述，聚氧乙烯烷基醚可以存在于提取试剂或中和试剂的任一种中(或提取试剂和中和试剂
二者中)，所以本方法的某些实施方案包括a)和b)使所述中间组合物与包含聚氧乙烯烷基
醚的中和试剂相接触，从而中和所述中间组合物的所述pH并产生蛋白质提取物。

[0178] 在某些实施方案中，与利用其他方法，例如不使用：高pH提取步骤(即，增高pH至高于约pH 10.0或pH 11.0的步骤)、中和步骤(即，调节pH至约pH 6.0-约pH 9.0的步骤)和聚氧乙烯烷基醚的方法生成的蛋白质提取物相比，由本方法产生的蛋白质提取物可以含有更
多易受捕获剂影响的蛋白质。单独的高pH和单独的聚氧乙烯烷基醚都不产生这样的蛋白质
提取物。在特殊的实施方案中，高pH提取试剂溶解固定的或未固定的细胞中的蛋白质，而聚氧乙烯烷基醚防止中间组合物中溶解的蛋白质在中和所述中间组合物的pH时再-聚集或沉
淀。

[0179] 以下更详细地描述了本方法中使用的试剂和由本方法产生的蛋白质提取物，也更详细描述了可以如何使用所述试剂产生蛋白质提取物。如下文中所讨论地，本方法中使用
的试剂的最适浓度和pH可以根据使用哪种试剂而变化。然而，试剂的最适浓度和pH容易通
过试验或凭经验确定。通过利用本发明的方法从中提取蛋白质的细胞

[0180] 根据本发明的方法学能够用于从细胞样品中提取靶蛋白或目的蛋白。细胞样品可以是同源细胞群、或不同类型细胞的异源混合物。细胞样品还可以含有“污染物”，诸如粘液、血液细胞和炎性细胞，所述污染物对于靶蛋白提取目的不重要或不含有靶蛋白。

[0181] 在一些实施方案中，所述靶蛋白是在受到病毒、优选地病理学病毒感染的细胞中存在的病毒蛋白，并且所述细胞优选地是从哺乳动物如人中分离的细胞。

[0182] 致病病毒可以是在人或其他动物中引起致病作用或疾病的任何致病病毒。所述致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的各种毒株，诸如HIV-1和HIV-2。病毒蛋白可以是HIV
糖蛋白(或表面抗原)诸如HIV GP120和GP41，或衣壳蛋白(或结构蛋白)诸如HIV P24蛋白。

[0183] 致病病毒可以是依波拉或马尔堡病毒。病毒蛋白可以是依波拉糖蛋白或表面抗原，诸如依波拉GP 1或GP2蛋白。

[0184] 致病病毒可以是肝炎病毒，诸如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒。例如，病毒蛋白可以是乙型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白，诸如小乙型肝炎表面抗原(SHBsAg)(也称为澳大利亚抗原(Australia antigen))，中乙型肝炎表面抗原(MHBsAg)和大乙型肝
炎表面抗原(LHBsAg)。病毒抗原可以是丙型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白，诸如NS3、NS4和NS5抗原。

[0185] 致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如，RSV病毒蛋白可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或融合蛋白(F-蛋白)。

[0186] 致病病毒可以是单纯疱疹病毒(HSV)，诸如HSV-1和HSV-2。例如，HSV病毒抗原可以是来自HSV-2的糖蛋白D。

[0187] 靶蛋白可以是肿瘤抗原，诸如乳腺癌细胞的Her 2和淋巴瘤细胞上的CD20，病毒致癌基因诸如人乳头瘤病毒的E6和E7，或是细胞致癌基因诸如突变的ras。

[0188] 在一些实施方案中，细胞样品含有其中存在靶蛋白的固定的细胞。本方法中使用的固定的细胞通常通过将细胞样品(例如，通过切除、剥离或灌洗从受试者摘除细胞而获
得)存放在液体培养基中获得。可以将细胞样品存放在已经包含化学固定剂的液体培养基
中，或可以在将细胞置于所述培养基后，向所述液体培养基中添加化学固定剂。含有固定剂和固定的细胞的液体培养基以及未固定的细胞包含在本文中术语″细胞样品″的含义内。

[0189] 本方法中可以使用的代表性化学固定剂包括：醇(例如，甲醇或乙醇)，醛(例如，戊二醛(gluteraldehyde)或甲醛)和酮(例如，丙酮)，以及四氧化锇，乙酸，苦味酸(picric acid)和重金属离子盐。本方法可以使用的固定剂的其他实例包括基于亚硫酸氢盐(bi-sulfite)的固定剂(其可以还包括乙酸)，基于PVP的固定剂(其可以还含有丙二醇和甲醇)
以及美国专利号3,546,334、4,578,282、4,857,300、5,104,640、5,256,571、5,432,056和5,
196,182中记述的那些。本方法可能使用的固定剂的实例，包括那些固定剂的工作浓度，可以在Baker，(生物学显微技术原理：固定和染色的研究(Principles of Biological 
Microtechnique：A Study of Fixation and Dyeing)，1959)和Williams(“用于免疫细胞化学的组织制备”(″Tissue preparation for immunocytochemistry″)，临床病理学杂志(J Clin Pathol)1997 50：422)中找到。

[0190] 本方法中特别感兴趣的是被称为″运送培养基″并作为妇科检查一部分常规用于收集、保存(即，固定)和运送子宫颈阴道细胞(例如，剥离的子宫颈细胞)的液体培养基。FDA批准的运送培养基是特别感兴趣的。

[0191] 可以使用的可商购运送培养基的实例包括：例如，基于甲醇的PRESERVCYTTM运送培养基(其作为Mass.莫尔伯勒(Marlborough)Cytyc公司(Cytyc，Inc.)的THINPREPTM妇科取样试剂盒的一部分出售)，基于乙醇的、正式称为CYTORICHTM的SUREPATHTM运送培养基(TriPath公司(TriPath，Inc.)Burlington，N.C.)，和基于甲醇的CYTOLYTTM运送培养基
(Cytyc，公司，莫尔伯勒(Marlborough)，Mass.).

[0192] 可以通过任何常规方法，包括但不仅限于剥离(例如，刮)、切除和灌洗，而获得细胞。特别感兴趣的是子宫颈来源的上皮细胞，该细胞典型地是通过利用适合的刷子、药签、抹刀或刮刀的剥离方法获得的，并将其存放在含有或不含有固定剂的液体培养基中。

[0193] 提取试剂

[0194] 本方法中使用的提取试剂含有以这样的量存在的成分，所述量在浓度上足以在将该提取试剂加入到细胞中时，产生具有至少pH 10.0的pH的蛋白质提取物。因此，所述提取试剂通常具有至少约pH 10.0的pH。

[0195] 使提取试剂与细胞相接触，从而产生中间组合物。提取试剂和由此产生的中间组合物的pH通常是至少约pH 10.0，例如，在约pH 10.0-约pH 13.0或约pH 12.0-约pH 13.0的范围内。在某些实施方案中，提取试剂可以具有约pH 10.0-约pH 10.5、pH 10.5-约pH 
11.0、pH 11.0-约pH 11.5、pH 11.5-约pH 12.0、pH 12.0-约pH 12.5或pH 12.5-约pH 13.0的pH。在某些优选的实施方案中，提取试剂具有约pH 12.5-约pH 12.9的pH。例如，提取试剂可以利用任何合适的氢氧离子来源，例如氢氧化钠或氢氧化钾，或碳酸钙制成。

[0196] 在某些实施方案中，提取试剂可以含有缓冲剂，从而将该试剂维持在所需的pH。如果本主题提取试剂中存在缓冲剂，则该缓冲剂在25℃，可以具有约9.0-约12.5范围内的pKα。可以在主题蛋白质提取试剂中使用的示范性缓冲剂包括例如，CABS、哌啶、磷酸盐、CAPS、甘氨酸或乙醇胺。本发明所用的提取试剂包含以这样的量存在的成分，所述量在浓度上足以在将该提取试剂加入到固定的或未固定的细胞中时，产生具有至少pH 10.0的pH的
蛋白质提取物。因此，所述提取试剂通常具有至少约pH 10.0的pH。

[0197] 在优选的实施方案中，提取试剂包含柠檬酸三钠和NaOH。例如，提取试剂可以包含0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0或2.0N NaOH。示例性的提取试剂包含约0.1N NaOH，约50mM柠檬酸三钠，且pH为12.5-12.9。

[0198] 在一些优选的实施方案中，使样品达到目标pH如大于pH 10的pH所需要的提取试剂的量或pH应该在添加提取试剂前凭经验预先确定。在这样的实施方案中，将凭经验确定
的提取试剂添加到细胞样品中。在其他实施方案中，在加入提取试剂后，测量中间组合物的pH。在该测量步骤之后，如果需要，调节pH，以达到目标pH。

[0199] 提取试剂还可以包含下列各项中的一种或多种、或其混合物：HEPES，TritonTMX-100，NaCl，甘油和EGTA。示例性的提取试剂可以包含约50mM HEPES，pH约pH 7.5，约1.1％TritonTMX-100，约150mM NaCl，约10％甘油，和约1mM EGTA。

[0200] 在某些实施方案中，除了具有至少10.0的pH，提取试剂还可以包含式为CH3(CH2)n1CH2(OCH2CH2)n2OH的聚氧乙烯烷基醚。所述聚氧乙烯烷基醚，也称为聚氧乙烯醇，在工业、化妆品和药学应用上通常用作乳化剂，湿润剂，增溶剂，脱泡剂，洗涤剂和/或润滑剂。(参见，例如，默克索引(The Merck Index).第13版，7659)。在某些实施方案中，聚氧乙烯烷基醚是BrijTM表面活性剂如BrijTM35或本文所述的其他BrijTM家族成员。

[0201] BrijTM35CAS[9002-92-0]是一种非离子表面活性剂，其通常用在高效液相色谱法(HPLC)应用中，用于分离膜复合物。其通常用来防止与色谱支持体的非特异性结合。其具有
16.9的亲水-亲脂平衡数值(HLB)，这表明其为一种能够用作增溶剂，如膜蛋白的非变性增
溶，或用作乳化剂的亲水化合物。(参见，例如，Umbreit，J.N.，和Strominger，J.L.1973.洗涤剂HLB数值与来自枯草芽胞杆菌膜的D-丙氨酸羧肽酶的增溶和稳定作用的关系
(Relation of detergent HLB number to solubilization and stabilization of D-
alanine carboxypeptidase from Bacillus subtillis membreanes).美国国家科学院学
报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)70，2997)。

[0202] BrijTM35，包含一个月桂基(CH3(CH2)10CH2)和23个乙烯氧基(OCH2CH2)单位，且具有化学式CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)23OH。其他化学同义词包括：聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylene lauryl ether)；LAURETH-23；聚氧乙烯(23)月桂醚C12E23；聚氧乙烯二醇十二烷醚(Polyoxyethyleneglycol dodecyl ether)；月桂醇环氧乙烷(Lauryl Alcohol Ethylene Oxide)，乙氧基化月桂醇(Ethoxylated Lauryl Alcohol)，月桂醇，乙氧基化的(Lauryl alcohol，ethoxylated)，；月桂基聚乙二醇醚(lauryl polyethylene glycol 
ether)；α-十二烷基-ω-羟基-聚氧乙烯(alpha-Dodecyl-omega-hydroxy-
polyoxyethylene)；聚乙二醇，单十二烷醚(PolyethyleneGlycols，monododecyl ether)；
十二烷醇乙氧基化物(Dodecanol ethoxylate)；十二烷醇，聚氧乙基化的(Dodecanol，
polyethoxylated)；十二烷基聚(氧乙烯)醚(Dodecyl poly(oxyethylene)ether)；
Lauromacrogol；月桂基聚(氧乙烯)醚(Lauryl poly(oxyethylene)ether)；氧乙烯基化的
十二烷醇(Oxyethylenated dodecyl alcohol)；聚(环氧乙烷)十二烷醚(Poly(ethylene 
oxide)dodecyl ether)；α-十二烷基-ω-羟基-聚(氧-1，2-乙二基)(alpha-dodecyl-
omega-hydroxy-Poly(oxy-1，2-ethanediyl))；聚(氧乙烯)单月桂醚(Poly(oxyethylene)
monolauryl ether)；聚乙氧基化的十二烷醇(Polyethoxylated dodecanol)；聚乙二醇十
二烷醚(Polyethylene glycol dodecyl ether)；聚乙二醇月桂醚(Polyethylene glycol 
lauryl ether)；聚氧乙烯十二烷醇(Polyoxyethylene dodecanol)；聚氧乙烯月桂酸醇
(Polyoxyethylene lauric alcohol)；和聚氧乙烯月桂醇(Polyoxyethylene lauryl 
alcohol.)；3，6，9，12，15，18，21，24，27-Nonaoxanonatriacontan-l-ol；十二烷醇，乙氧基化的(Dodecyl alcohol，ethoxylated)；；Laureth 4[USAN]；Laureth 9[USAN]；Laureth-
11；Lauromacrogol 400[INN]；PEG-11月桂醚(PEG-11Lauryl ether)；Polidocanol，40L(聚醚)；Actinol L7；Actinol L3；Adeka Carpol M2；Adeka Carpol MBF 100；Adekatol LA 
1275；乙氧硬化醇(Aethoxysklerol)；Akyporox RLM 160；Akyporox RLM 22；Akyporox 
RLM230；Akyporox RLM 40；Aldosperse L 9；Alkasurf LAN 1；Alkasurf LAN 3；
Arapol0712；Atlas G 2133；Atlas G 3705；Atlas G 3707；Atlas G 4829；Atlas G-2133；
Atlas G-3705；B 205；碱(BASE)LP 12；BL 9；BL 9(聚乙二醇)；碱(BASE)LP 12；BrijTM22；
BrijTM 23；BrijTM 30；BrijTM 30ICI；BrijTM 30SP；BrijTM 35；BrijTM 35L；BrijTM36T；CCRIS 
3397；Calgene 40L；Carsonol L 2；Carsonol L 3；Chemal LA 23；Chimipal AE 3；
Cimagel；Conion 275-100；Conion 275-20；Conion 275-30；Conion 275-80；Conion 2P80；
十二烷醇聚氧乙烯醚(Dodecyl alcohol polyoxyethylene ether)；Du Pont WK；
Ethosperse LA 12；Ethosperse LA 23；；G 3707；乙二醇，聚乙烯，单十二烷醚(Glycols，polyethylene，monododecyl  ether)；HSDB  4351；羟基聚乙氧基十二烷
(Hydroxypolyethoxydodecane)；LA(醇)；LA 7；Laureth；Laureth 9；Lipal4LA；Lubrol 
12A9；Lubrol PX；Marlipal 1217；Mergital LM 11；NCI-C54875；Newcol 1203；Nikkol BL；
Noigen ET 160；Noigen ET 170；Noigen YX 500；Noniolite AL 20；Pegnol L 12；；聚(氧-
1，2-乙二基)，α-十二烷基-ω-羟基-(Poly(oxy-1，2-ethanediyl)，alpha-dodecyl-omega-hydroxy-)；聚乙二醇单十二烷醚(Polyethylene glycol monododecyl ether)；聚乙二醇
单十二烷醚，名称之后接着数字(400)，其近似对应于聚乙二醇部分的平均分子量；聚乙二醇单月桂醚(Polyethylene  glycol  monolauryl  ether)；聚氧乙烯月桂醚
(Polyoxyethylene lauryl ether)；Rokanol L；Romopal LN；Simulsol P 23；Simulsol P 
4；Siponic L；Slovasol S；Standamul LA 2；Stmer 135；表面活性剂WK；Texofor B 9；
Thesat；Thesit；α-十二烷基-ω-羟基聚(氧-1，2-乙二基)(alpha-Dodecyl-omega-
hydroxypoly(oxy-1，2-ethanediyl))；或α-十二烷基-ω-羟基聚(氧乙烯)(alpha-
Dodecyl-omega-hydroxypoly(oxyethylene))。

[0203] 其他BrijTM聚氧乙烯烷基醚包括：BrijTM 30聚氧乙烯(4)月桂醚CH3(CH2)10CH2TM TM
(OCH2CH2)nOH，n～4)；Brij  52，聚氧乙烯(2)十六烷醚C16H33(OCH2CH2)nOH，n～2)；Brij  
56聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 58，聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 72聚氧乙烯(2)十八烷醚，(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～2)；
BrijTM 76，聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 78聚氧乙烯(20)十TM
八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～20)；Brij  92，聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 93，聚氧乙烯(2)油基醚；(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 97，聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 98，聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 700，聚氧乙烯(100)十八烷醚，C18H37(OCH2CH2)21OH，n～100；和BrijTM 
721，聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～21)。

[0204] 聚氧乙烯烷基醚，如果存在的话，可以以不显著降低将来测定的灵敏性的浓度存在。聚氧乙烯烷基醚的浓度，在某些实施方案中，可以在样品处理过程中减小，例如，通过用中和缓冲液稀释该聚氧乙烯烷基醚或通过在使用前向蛋白质提取物加入稀释剂，如缓冲液
或水。

[0205] 取决于所用的聚氧乙烯烷基醚的强度和提取缓冲液的pH，聚氧乙烯烷基醚可以在提取缓冲液中以约0.05％-约0.1％，约0.1％-0.5％，约0.5％-约1％，约1％-约5％，约5％-约10％，或约10％-约20％的浓度(v/v)存在。

[0206] 在优选的实施方案中，聚氧乙烯烷基醚，例如BrijTM35，在提取试剂中以约2％-约10％的浓度(v/v)存在。在其他实施方案中，所述聚氧乙烯烷基醚存在于中和试剂中。在其他实施方案中，所述聚氧乙烯烷基醚存在于提取试剂和中和试剂二者中。

[0207] 在其他优选的实施方案中，提取试剂和/或中和试剂除聚氧乙烯烷基醚外还包括其他非离子型洗涤剂。所述非离子型洗涤剂可以存在于提取试剂或中和试剂中，或者存在
于提取试剂和中和试剂二者中。在某些实施方案中，使用的非离子型洗涤剂可以是诺乃洗
涤剂(Nonidet)P-40、n-辛基葡萄糖苷(n-octylglucoside)、TRITONTM洗涤剂诸如TRITONTM X-100、辛基β-硫葡糖吡喃糖苷(octyl β-thioglucopyranoside)、TWEENTM洗涤剂诸如
Tween-20、或NP-40。根据所用洗涤剂的强度，洗涤剂可以以约0.01M-约0.05M、约0.05M-约
0.1M、01M-约0.2M、约0.2M-约0.5M、约0.5M-约1.0M、约1.0M-约2.0M、约2.0M-约4.0M、或约
4.0M-约8.0M的浓度存在于提取缓冲液或中和缓冲液中。洗涤剂可以以约0.1％-20％，优选
0.5％-10％，1％-6％或2％-5％的浓度存在于提取缓冲液中。美国专利6,488,671的第7和8栏中列出了可以在本方法中使用的其他洗涤剂，该专利的全部内容引入本文作为参考。

[0208] 示例性的洗涤剂及其在所述中和试剂和/或提取试剂中的浓度包括：Triton X-100：约0.1％至约10％，例如，约1％，NP40：约0.1％至约10％，例如，约1％和Tween-20：约
0.1％至约10％，例如，约1％，重量/体积。

[0209] 在优选实施方案中，提取试剂和/或中和试剂包括与其他非离子型洗涤剂组合的聚氧乙烯烷基醚。所述聚氧乙烯烷基醚可以是BrijTM表面活性剂且可以与TweenTM洗涤剂或TritionTM洗涤剂中的一种或两种组合。在某些优选实施方案中，所述BrijTM表面活性剂为TM TM
与下述非离子型洗涤剂中的一种或多种组合的Brij 35：Tween -20，约0.1％-约10％，例
如，约2％；或TritionTMX-100，约0.1％-约10％，例如，约2％。

[0210] 在某些实施方案中，提取试剂可以不含有显著量的变性剂。然而，在其他实施方案中，除了具有至少10.0的pH和聚氧乙烯烷基醚如BrijTM35外，提取试剂还可以含有变性剂，例如，离子型洗涤剂，诸如十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基肌氨酸钠，或离液剂如尿素。在这些实施方案中，变性剂，如果存在的话，可以以这样的浓度存在，所述浓度不显著降低将来测定的灵敏性。变性剂的浓度，在某些实施方案中，可以在样品处理过程中降低，例如，通过用中和缓冲液稀释该变性剂或在使用前对蛋白质提取物添加稀释剂，例如缓冲液或水。变性剂也可以在不存在聚氧乙烯烷基醚的情况下单独存在。

[0211] 根据所使用的变性剂的强度和提取缓冲液的pH，变性剂可以以约0.01M-约0.05M、约0.05M-约0.1M、0.1M-约0.2M、约0.2M-约0.5M、约0.5M-约1.0M、约1.0M-约2.0M、约2.0M-约4.0M、或约4.0M-约8.0M的浓度存在于提取缓冲液中。变性剂，如果存在于提取试剂中的话，可以以这样的浓度存在，所述浓度充分低于使蛋白质变性典型使用的变性剂浓度。换言之，提取试剂可以含有处于这样浓度的变性剂，所述浓度容许在按照本主题方法产生蛋白
质提取物后，利用关于该蛋白质的捕获剂检测蛋白质。所使用的变性剂浓度通常足以产生
含有这样的蛋白质的蛋白质提取物，所述蛋白质是在使用捕获剂的结合测定，例如在抗体
检测测定中可容易检测的。

[0212] 示范性变性剂及其在本提取试剂中的浓度：十二烷基硫酸钠(SDS)：约0.01％-约2％，例如，0.05％，十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)：约0.01％-约5％，例如，0.5％，胍：约
0.1M-约6M，例如，约0.5M，和尿素：约0.1M-约8M，例如，约0.5M，重量/体积。

[0213] 典型地使用浓度为0.1％-0.5％的SDS变性蛋白质，典型地使用浓度为2％w/v的十二烷基肌氨酸钠变性蛋白质，典型地使用浓度为2M-8M的尿素变性蛋白质，典型地使用浓度为3M-8M的盐酸胍变性蛋白质，典型地使用浓度为5％w/v的N-十六烷基三甲基铵氯化物(N-
cetyl trimethylammonium chloride)变性蛋白质，且典型地使用浓度为2％，w/v的N-辛基葡萄糖苷变性蛋白质(见蛋白质纯化手册(Protein purification Handbook)，安玛西亚法
玛西亚生物技术(Amersham Pharmacia Biotech)，第71页(1999))。

[0214] 除上述成分外，本主题蛋白质提取试剂可以含有其他成分，例如盐离子螯合剂、蛋白酶抑制剂、等。

[0215] 蛋白质提取试剂可以是液体或固体组合物，并且在某些实施方案中，可以含有不同变性剂的组合。

[0216] 本提取缓冲液中可以使用的变性剂通常是强变性剂，且包括但不仅限于：离液剂(例如，尿素、盐酸胍、或硫氰酸盐诸如硫氰酸钠或硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠等；参见K.Hamaguchi等，国家科学院学报(Proc Natl.Acad.Sci.)62：1129-1136，1962)和离子型洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)，十二烷基肌氨酸钠或N-十六烷基三甲基铵氯化物)，其包括阳离子、阴离子和两性离子洗涤剂(诸如CHAPS或CHAPSO)。本方法中可以使用的其他变性剂列在美国专利6,488,671的第7和8栏中，将其全部内容引入本文作为参考。

[0217] 在某些实施方案中，在提取缓冲液中不使用弱变性剂，诸如LiCl、LiClO4、LiBr、CaCl2或NaCl作为变性剂，尽管在提取缓冲液或蛋白质提取物中除了前段列出的变性剂外，可以存在这样的化合物。

[0218] 如上所示，使提取试剂与固定的或未固定的细胞相接触(例如，与之组合或混合)。在某些实施方案中，可以将含有细胞的细胞样品(例如，含有固定的细胞的运送培养基)直
接加入到提取试剂中。在其他实施方案中，可以在向蛋白质提取试剂添加细胞之前，从细胞样品中分离(例如，通过沉降、离心、过滤或亲合方法)细胞。在将细胞加入到提取试剂中前，可以洗涤细胞，或使细胞与其他试剂相接触。

[0219] 全部或一部分可用的固定的或未固定的细胞可以与提取试剂相组合。例如，在某些实施方案中，一部分细胞可以在细胞学检验中使用，并且一部分细胞可以与提取试剂相
接触，从而产生中间组合物。细胞和提取试剂可以组合并温育或被维持在合适的温度(例
如，冰上，在约室温下或在约37℃)并且持续合适的时间(例如，10秒-24小时)，从而产生中间组合物。例如，细胞和提取试剂可以组合至少1，2，3，4，5，10，15，30分钟或1，2，3，4，5，10，
15小时。作为另一个实例，细胞和提取试剂可以组合5分钟-10小时或10分钟-1小时或10-30分钟。在某些实施方案中，在使细胞与提取试剂相接触后，立即使中和试剂和中间组合物相接触。细胞和中和试剂可以组合并温育或被维持在合适的温度(例如，冰上，在约室温下或在约37℃)并且持续合适的时间(例如，10秒-24小时)，从而产生中间组合物。例如，细胞和中和试剂可以组合至少1，2，3，4，5，10，15，30分钟或1，2，3，4，5，10，15小时。作为另一个实例，细胞和中和试剂可以组合5分钟-10小时或10分钟-1小时或10-30分钟。

[0220] 中和试剂

[0221] 本方法中使用的中和试剂具有在与所述中间组合物相接触时，足以中和上述中间组合物pH的pH。换言之，中和试剂具有这样的pH，所述pH在该中和试剂与上文讨论的中间组合物相混合时，足以中和该中间组合物的pH。如在下文中更详细描述地，在某些实施方案
中，中和试剂可以含有聚氧乙烯烷基醚或其他非离子型洗涤剂或洗涤剂混合物。

[0222] 中和试剂的pH足以中和通过使固定的或未固定的细胞与主题提取试剂相接触产生的中间组合物。根据提取试剂的pH和是否使用缓冲剂，中和试剂的pH可以是pH 4.0-pH 
8.0。在某些实施方案中，中和试剂可以具有约pH 4.0-约pH 4.5、pH 4.5-约pH 5.0、pH 
5.0-约pH 5.5、pH 5.5-约pH 60、pH 6.0-约pH 6.5、pH 6.5-约pH 7.0或pH 7.0-约pH 7.5的pH。例如，中和试剂可以是利用任何合适的氢离子来源，例如盐酸或乙酸制成的。在某些实施方案中，中和试剂可以具有低于pH 4.0的pH。

[0223] 中和试剂可以是缓冲的或非缓冲的。例如，如果所述中和试剂是缓冲的，则所述中和试剂可以是利用具有约6-约8的pKa的任何缓冲剂，例如，tris，hepes或tricine来缓冲的。在某些优选的实施方案中，中和试剂包含2M Tris-HCl，pH约为pH 6.0。在其他优选的实施方案中，中和试剂包含0.9M Tris-HCl，pH约为pH 7.8。

[0224] 在一些优选的实施方案中，在加入中和试剂之前，凭经验预先确定使得样品达到目标pH，例如约pH 6.0-9.0，或pH 7.0-8.5或pH 7.5-8.5或pH 8.0-8.5的pH所需要的中和
试剂的量或pH。在这样的实施方案中，将凭经验确定的中和试剂添加到细胞样品中。在其他实施方案中，在加入中和试剂后，测量被中和的样品的pH。在该测量步骤之后，如果需要，调节pH，以达到目标中性pH。

[0225] 在其他实施方案中，中和试剂包含下列各项中的一种或多种、或其混合物：HEPES，TritonTMX-100，NaCl，甘油和EGTA。示例性的中和试剂包含约50mM HEPES，pH约为pH 7.5，约1.1％TritonTMX-100，约150mM NaCl，约10％甘油，和约1mM EGTA。另一种示例性的中和缓冲TM TM
液包含：约20mM Tris，pH 8，约2％BSA，约1％Triton X-100，约2％Tween -20，约0.2％肌氨酸，约250mM NaCl，和约50mM EDTA(或EGTA)。

[0226] 如上所示，提取试剂和/或中和试剂可以含有非离子型洗涤剂或表面活性剂，其包括但不限于式为CH3(CH2)n1CH2(OCH2CH2)n2OH的聚氧乙烯烷基醚。示例性的聚氧乙烯烷基醚TM TM
为Brij 表面活性剂，其包括以下一种或多种：Brij  35，聚氧乙烯(23)月桂醚(CH3(CH2)
10CH2(OCH2CH2)nOH，n～23)；BrijTM 30聚氧乙烯(4)月桂醚(CH3(CH2)10CH2(OCH2CH2)nOH，n～
4)；BrijTM 52，聚氧乙烯(2)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 56聚氧乙烯(10)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 58，聚氧乙烯(20)十六烷醚(C16H33(OCH2CH2)TM TM
nOH，n～20)；Brij  72聚氧乙烯(2)十八烷醚，(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～2)；Brij  76，聚氧乙烯(10)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 78聚氧乙烯(20)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～20)；BrijTM 92，聚氧乙烯(2)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 
93，聚氧乙烯(2)油基醚；(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～2)；BrijTM 97，聚氧乙烯(10)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～10)；BrijTM 98，聚氧乙烯(20)油基醚(C18H35(OCH2CH2)nOH，n～20)；
BrijTM 700，聚氧乙烯(100)十八烷醚，C18H37(OCH2CH2)21OH，n～100；或BrijTM 721，聚氧乙烯(21)十八烷醚(C18H37(OCH2CH2)nOH，n～21)。

[0227] 取决于所用的聚氧乙烯烷基醚的强度和提取缓冲液的pH，聚氧乙烯烷基醚可以在提取缓冲液中以约0.05％-约0.1％，约0.1％-0.5％，约0.5％-约1％，约1％-约5％，约5％-约10％，或约10％-约20％的浓度(v/v)存在。

[0228] 在某些实施方案中，使用的非离子型洗涤剂可以是诺乃洗涤剂(Nonidet)P-40、n-辛基葡萄糖苷、TRITONTM洗涤剂诸如TRITONTM X-100、辛基β-硫葡糖吡喃糖苷、TWEENTM洗涤剂诸如Tween-20、或NP-40。根据所用洗涤剂的强度，洗涤剂可以以约0.01M-约0.05M、约
0.05M-约0.1M、01M-约0.2M、约0.2M-约0.5M、约0.5M-约1.0M、约1.0M-约2.0M、约2.0M-约
4.0M、或约4.0M-约8.0M的浓度存在于提取缓冲液或中和缓冲液中。美国专利6,488,671的
第7和8栏中列出了可以在本方法中使用的其他洗涤剂，将该专利的全部内容引入本文作为
参考。在某些实施方案中，洗涤剂可以存在于提取和中和缓冲液二者中。

[0229] 示范性洗涤剂及其在该中和试剂和/或提取试剂中的浓度包括：Triton X-100：约0.1％-约10％，例如，约1％，NP40：约0.1％-约10％，例如，约1％，和Tween-20：约0.1％-约
10％，例如，约1％，重量/体积。

[0230] 如上所示，聚氧乙烯烷基醚或其他非离子型洗涤剂可以单独地、组合地存在于中TM
和试剂中，或不存在于中和试剂中。聚氧乙烯烷基醚可以是Brij 表面活性剂，且可以与
TweenTM洗涤剂或TritionTM洗涤剂之一或二者组合。在某些优选的实施方案中，BrijTM表面活性剂为与下述非离子型洗涤剂中的一种或多种组合的BrijTM35：TweenTM-20，约0.1％-约
10％，例如约2％；或TritionTM X-100，约0.1％-约10％，例如约2％。

[0231] 如上所示，使中和试剂与中间组合物相接触(例如，与之组合或混合)，从而产生具有中性pH(即，在约pH 6.5-约pH 8.0范围内，例如，在约pH 7.0-约pH 7.8范围内的pH)的蛋白质提取物。蛋白质提取物还含有来自固定的或未固定的细胞的蛋白质、处于以上列出的浓度的聚氧乙烯烷基醚，和在某些实施方案中，用于将蛋白质提取物维持在特定pH范围内
的缓冲剂和/或其他非离子型洗涤剂。如果将变性剂加入到固定的或未固定的细胞中，则蛋白质提取物还可以含有该变性剂。pH、洗涤剂的选择和所用洗涤剂的浓度(和，如果使用变性剂，则变性剂的身份(identity)和浓度)足以容许蛋白质提取物直接用于结合测定，从而检测在蛋白质提取物中存在的蛋白质。

[0232] 细胞提取物的中和还可以通过使该提取物流经充满中和试剂的过滤器或过滤嘴而实现。在提取物流过过滤材料时，中和试剂被溶解，且该提取物的pH接近中性。

[0233] 用于中和细胞提取物的备选方法是使所述提取物流过经处于中性pH的溶液预平衡的BioSpin柱(BioRad)。还可以将提取物置于容纳含有中和剂的凝胶(或过滤材料)的注
射器或相似的装置中，并通过正压使其从所述注射器中释放出来。

[0234] 在某些实施方案中，本主题蛋白质提取物含有溶解的HPV E6蛋白(特别是来自HPV致癌毒株的E6蛋白质)，所述HPV E6蛋白在对蛋白质提取物不进行进一步处理的条件下(例
如，在不进一步加入变性剂、改变pH或加热的条件下)，容易被捕获剂接近和容易检测。蛋白质提取物还可以含有溶解的或不可溶的膜、除HPV E6蛋白外的蛋白质、和其他细胞内容物
诸如DNA、RNA、碳水化合物、等等。还可以存在其他污染物，诸如源自原始细胞样品的mucal污染的那些。蛋白质提取物组成通常不含有完整的(即，细胞学完整)细胞。

[0235] 蛋白质提取物可以立即使用，或在使用前，例如，以冷冻形式对其进行保存。

[0236] 在特殊的实施方案中，由上述方法产生的蛋白质提取物可以用在蛋白质检测方法中，下文中更加详细地描述了该方法。

[0237] 如由上文明显地，在上述试剂中可以使用多种不同的变性剂、洗涤剂、缓冲剂、pH和组分浓度。任何试剂中的最佳变性剂、洗涤剂、缓冲剂或pH、或组分浓度是容易利用常规方法确定的。

[0238] 在中和细胞提取物后，通过用含有关于E6的粘合剂的粒子温育该提取物，可以从所述细胞提取物中浓缩E6蛋白。该粘合剂可以包括PDZ、E6关联蛋白(E6AP)或其片段、或E6结合蛋白(E6BP)或其片段。在E6被该粒子捕获后，洗涤该粒子，并且然后通过用pH高于10的缓冲液温育，将E6从所述粒子中释放出来。将粒子从洗脱溶液中分离出来，并且然后通过前述过程中和剩余的溶液。备选地，可以在不从所述捕获粒子中释放出来的条件下，检测E6蛋白。

[0239] 美国专利6,488,671的第7和8栏中列出了可以在本方法中使用的其他洗涤剂，该专利的全部内容引入本文作为参考。在某些实施方案中，洗涤剂可以存在于提取和中和缓
冲液二者中。

[0240] 在其他实施方案中，样品可以在中和步骤后稀释。示例性的稀释剂可以包括：约TM
50mM HEPES，pH约为pH 7.5，约1.1％Triton X-100，约150mM NaCl，约10％甘油，和约1mM EGTA。另一种示例性的稀释剂可以包括：约50mM Tris，pH 8.2，约2％BSA，约2％TritonTMX-
100，约0.1％肌氨酸，约150mM NaCl，和约50mM EDTA(或EGTA)。

[0241] 蛋白质检测方法

[0242] 由上述方法制成的蛋白质提取物可以直接或间接地(即，添加其他试剂后)用于评估该蛋白质提取物中存在一种或多种蛋白质的方法中。蛋白质检测法通常涉及特异性结合
蛋白质的捕获剂。在进行所述方法时，待检测蛋白质的身份可以是已知的(即，预-确定的)或未知的身份。

[0243] 可以利用本主题蛋白质检测方法检测的蛋白质包括这样的蛋白质，所述蛋白质是疾病或病症，例如癌症、炎性疾病、或由例如病毒、细菌或真菌引起的感染的诊断标记。在某些实施方案中，利用本主题方法检测的蛋白质是常规不可检测的，除非使用本主题蛋白质
提取物方法。

[0244] 可以利用本方法检测的示范性蛋白质包括由传染性介质，诸如人乳头瘤病毒(HPV)编码的蛋白质。在特殊的实施方案中，本方法可以用于检测HPV的E6蛋白质，其是被证明在由固定的细胞制成的蛋白质提取物中通过其他方法很难或不可能检测的蛋白质。

[0245] 概括地，蛋白质检测方法是本领域中众所周知的，且包括结合测定，即，检测蛋白质和关于该蛋白质的捕获剂之间的结合的测定。所述测定包括免疫学测定，即，使用与蛋白质特异性结合的抗体的结合测定，包括但不仅限于，利用诸如下列技术的竞争和非竞争测定系统：仅指出一些，蛋白质印迹法、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、″夹心″免疫测定、酶免疫测定、细胞计数珠阵列(CBA)、多元珠测定、蛋白质印迹法、免疫组织化学测定、免疫细胞化学测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体-结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、和蛋白质A免疫测定。所述测定是本领域中常规的和众所周知的(见，例如，Ausubel等，编，1994，分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)，卷1，John Wiley和Sons，公司，纽约，将其全部内容引入本文作为参考)。以下简要描述示范性免疫测定。利用E6BP或AP肽、特异性抗体、或PDZ结构域蛋白的捕获或释放可以用作浓缩HPV E6的提取后测定前方法。备选地，可以使用二元单克隆抗体形式。

[0246] 免疫沉淀方案通常包括产生蛋白质提取物，向蛋白质提取物中添加捕获剂如抗体，和在一段合适的时间和温度下，温育所述蛋白质提取物和捕获剂。捕获剂然后与固相支持体，例如，亲合基底诸如与蛋白质A和/或蛋白质G相连的珠子相结合，并温育和洗涤该混合物。将固相支持体重新混悬在样品缓冲液中，并可以通过例如，蛋白质印迹法检测目的蛋白质。

[0247] ELISA可以包括制备蛋白质提取物，连接蛋白质提取物和固相支持体(例如，多孔微量滴定平板的孔)，使该支持体-结合的蛋白质提取物与捕获剂例如抗体相接触，和检测
所述捕获剂和所述蛋白质之间的结合。在某些ELISA方法中，在使捕获剂与支持体-结合的
蛋白质提取物相接触前，可以用可检测结构部分如酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)可检测地标记捕获剂。然而，在其他实施方案中，可以通过可检测的第二捕获剂(例
如，第二抗体)，检测捕获剂与蛋白质提取物的结合，所述第二捕获剂结合与所述蛋白质提取物相接触的捕获剂。

[0248] 在其它ELISA测定中，捕获剂可以与固相支持体相连接，且蛋白质提取物和与固相支持体-结合的捕获剂相接触。利用关于该蛋白质的第二捕获剂，可以检测蛋白质提取物中的蛋白质和固相-支持体抗体的结合。所述“夹心测定”是本领域中众所周知的。

[0249] 在其他测定中，在捕获剂的表面固定前，可以在溶液中发生该捕获剂和蛋白质之间的结合。

[0250] 特别地，本方法可以用于检测来自HPV致癌毒株的E6蛋白。在这些实施方案中，该检测方法中使用的捕获剂可以是，例如，包括与E6蛋白中包含的PDZ配体(即，关于PDZ结构域的结合位点)结合的PDZ结构域的抗体或多肽。例如，本E6检测结合方法可以使用包含PDZ结构域的蛋白质，所述蛋白质含有MAGI-1的第二PDZ、或DLG或TIP1的PDZ结构域，等等，如在公开的申请US 20040018487(2004年1月29日公开)中所述，并将其全部内容引入本文作为
参考。示范性的包含PDZ结构域的蛋白质和PDZ结构域序列显示在申请US 20040018487的表
2和实施例4中。术语″PDZ结构域″还包括该序列的变体(例如，天然存在的变体)(例如，多形变体，具有保守取代的变体、等)和来自备选物种(例如，小鼠、大鼠)的结构域。典型地，PDZ结构域与美国专利申请系列号09/724,553中显示的那些基本相同，将该申请引入本文作为
参考，例如，当为了最大对应性而进行比较和比对时，至少约70％，至少约80％，或至少约
90％的氨基酸残基相同。本领域中认识到能够突变PDZ结构域，从而提供能够加强或削弱结合的氨基酸变化和改变特异性，但它们保持PDZ结构域(Schneider等，1998，自然生物技术(Nat.Biotech.)17：170-5)。除非另外指出，引用特殊PDZ结构域(例如，MAGI-1结构域2)意欲包括该特殊PDZ结构域及其HPV E6-结合变体。换言之，如果对特殊PDZ结构域作出引用，则也对结合HPV的致癌E6蛋白质的PDZ结构域的变体作出引用，如下所述。在这方面，注意到蛋白质中PDZ结构域的编号可以改变。例如，如本文中所引用的MAGI-1结构域2(氨基酸序列为
PSELKGKFIHTKLRKSSRGFGFTVVGGDEPDEFLQIKSLVLDGPAALDGKMETGDVIVSVNDTCVLGHTHAQWKIFQ
SIPIGASVDLELCRGYPLPFDPDDPN的)，在其他文献中可以被引用为MAGI-1结构域1。同样地，当在本申请中引用蛋白质的特殊PDZ结构域时，应该鉴于如本文，特别是在申请US 
20040018487的序列列表表2中所述的该结构域的序列，对该引用进行理解，当合适时，申请US 20040018487的序列列表表2显示了所述序列列表的序列和关于不同结构域的名称和
Genbank编号之间的关系。用于本文时，术语″PDZ蛋白质″指天然存在的含有PDZ结构域的蛋白质。示范性PDZ蛋白质包括CASK，MPP1，DLG1，DLG2，PSD95，NeDLG，TIP-33，SYNla，TIP-43，LDP，LIM，LIMK1，LIMK2，MPP2，NOS1，AF6，PTN-4，prIL16，41.8kD，KIAA0559，RGS12，KIAA0316，DVL1，TIP-40，TIAM1，MINT1，MAGI-1，MAGI-2，MAGI-3，KIAA0303，CBP，MINT3，TIP-
2，KIAA0561，和TIP-1。用于本文时，术语″PDZ-结构域多肽″指含有PDZ结构域的多肽，诸如包括PDZ结构域序列的融合蛋白、天然存在的PDZ蛋白质、或分离的PDZ结构域肽。因此，PDZ-结构域多肽可以是约60或更多个氨基酸的长度、约70或更多个氨基酸的长度、约80或更多
个氨基酸的长度、约90或更多个氨基酸的长度、约100或更多个氨基酸的长度、约200或更多个氨基酸的长度、约300或更多个氨基酸的长度、约500或更多个氨基酸的长度、约800或更多个氨基酸的长度、约1000或更多个氨基酸的长度，通常至多约2000或更多个氨基酸的长
度、约50-2000个氨基酸的长度、约50-1500个氨基酸的长度、约50-1000个氨基酸的长度、约
60-1000个氨基酸的长度、约70-1000个氨基酸的长度。PDZ结构域肽通常不多于约200个氨
基酸(例如，50-200个氨基酸、60-180个氨基酸、80-120个氨基酸、或90-110个氨基酸)，并编码PDZ结构域。

[0251] 例如，适合于检测HPV的E6蛋白质的抗体记述在20050142541(2005年6月30日公开的)中。在公开的美国专利申请US20040018487中找到用于识别来自HPV致癌毒株的E6蛋白
的详细方法，将该方法的全部内容引入本文。这些公开的方法易于适合在本方法中使用。

[0252] 在某些实施方案中，抗-E6抗体可以与固相支持体结合，并且由本主题方法产生的蛋白质提取物和与固相支持体结合的抗体相接触。所述固相支持体在本领域中是公知的，
且可以包括但不限于：胶体金粒子，化学发光粒子，染色的胶乳粒子，或SERS拉曼粒子，例如，具有报告染料的硅石-包被的金核或银核。在某些实施方案中，抗-E6抗体可以缀合到荧光标记上。

[0253] 利用包含PDZ结构域的蛋白质，可以检测蛋白质提取物中的致癌E6蛋白的结合。在其他实施方案中，包含PDZ结构域的蛋白质可以与固相支持体结合，并且由本主题方法产生的蛋白质提取物和与固相支持体结合的包含PDZ结构域的蛋白质相接触。利用抗-E6抗体，
可以检测蛋白质提取物中的致癌E6蛋白的结合。在备选的方法中，在包含PDZ结构域的蛋白质的抗体之间的结合可以发生在溶液中(即，在缺乏抗体或包含PDZ结构域的蛋白质与固相
支持体结合的条件下)，并且，结合后，该抗体或包含PDZ结构域的蛋白质可以与固相支持体(例如，珠或类似物，诸如上述那些)结合。在这些实施方案中，包含PDZ结构域的蛋白质可以是具有亲合结构域的融合蛋白，所述亲合结构域与固相支持体相结合。利用识别E6蛋白的
第二捕获剂，能够检测E6蛋白的存在。

[0254] 在优选的实施方案中，利用侧向流动(LF)测定、免疫色谱测定、浸染棒检测(dipstick tests)或流过免疫测定(flow-through immunoassays)来检测提取的、捕获的
E6蛋白。在优选实施方案中，将包括包含PDZ结构域的蛋白的“捕获区”的侧向流动(LF)条带置于含有提取的样品的小瓶或孔中，其中已经加入了第二捕获剂如与金颗粒缀合的抗-HPV E6单克隆抗体(mAb)。然后允许该金颗粒和样品通过毛细管作用在条带上迁移。可以将吸附垫附着在远端以促进液体在条带上流动。在样品在条带上迁移的过程中，捕获区中的PDZ结构域蛋白可以与E6蛋白结合。如果溶液中存在金缀合的mAb的结合，则抗-E6-金缀合物可以结合PDZ结构域蛋白。备选地，E6蛋白可以结合PDZ结构域蛋白，然后捕获E6金缀合物。在任一种情形中，成功的捕获可以导致在LF条带上形成可视和可检测的线条。

[0255] 在优选实施方案中，利用细胞计数珠阵列(CBA)辅助检测捕获的E6蛋白。CBA，还称为多元珠测定，是一系列可以用于捕获和定量可溶分析物的光谱离散性颗粒。然后，通过检测基于荧光的发射的检测和流式细胞术分析来测量分析物。Becton Dickinson(BD)TM CBA产生与基于ELISA的测定相当的、但以“多元”或同时方式的数据。如使用任一种夹心形式的测定相同，未知分析物浓度的计算通常通过使用已知的标准物且将未知物针对标准曲线绘
图而进行。

[0256] 有效用于检测捕获的E6蛋白的仪器室本领域中公知的。例如，可以使用反射计仪器或UMN读取仪来检测LF条带上得到的线条。备选地，如果使用荧光标记的抗E6mAb捕获E6
蛋白，则可以使用荧光计读取仪。还可以使用其中结合探测粒子作为装置的固有部分的装
置。备选地，本发明的提取方法可以产生由E6结构部分单独地或与特异性抗体、肽或蛋白
(与粒子附着或不附着的)复合组成的输入样品。所述输入样品可以引入到特异性捕获或基
于非特异性膜的流过检测装置中，并且随后通过酶或基于粒子的系统或放大检测系统进行
检测。

[0257] 可以利用多种方法提高信号检测。一种这样的方法利用缀合至金粒子上的酶缀合的(例如，辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP))单克隆抗体(mAbs)与沉淀底物结合。具有多个生物素接着链霉抗生物素蛋白金粒子的抗体也可以导致放大的信号。生物素酪胺可
以用来在检测线条周围沉积更多生物素，然后是链霉抗生物素蛋白-缀合的金来进行放大
和检测。备选地，信号增强可能由使用双重方法导致，所述双重方法包括由生物素和特异性mAb-共缀合的金粒子(或荧光标记的粒子)组成的一级粒子，其后是与链霉抗生物素蛋白缀
合的二级粒子。一级粒子可以是特异性E6重复标记的粒子，其后是抗-标记的二级粒子。一级粒子还可以是能够与来源于一些、许多或全部致癌HPV毒株的E6蛋白和/或与该E6蛋白的
一个或多个表位反应的抗体的混合物。所述抗体混合物可以被生物素酰化、缀合至固相支
持体(例如，金粒子)上、或荧光标记；并且本文所述的多种方法可以与所述混合物联合使用以检测E6蛋白。

[0258] 在某些实施方案中，可以增加提取缓冲液中的活性成分，以增加临床样本的溶解。这样增加的溶解可以消除对澄清样品的需要，并且减少测定中的一个步骤。还可以可能地
沉淀抗-E6-mAb-金复合物，并且在小体积中重建，从而浓缩样品，由此富集E6蛋白且提高测定的灵敏性。

[0259] 可以在检测之前过滤样品，以去除可能干扰样品流动和检测的不需要的物质。过滤可以降低样品的粘度，导致样品提高的流速。这可以提高将样品浓缩为样品膜的效率或
在侧向流动装置上的流速。另外，通过减少样品中较大粒径的物质，可以降低样品的粘度，这导致样品提高的流速。这可以增加将样品浓缩为样品膜的效率或在侧向流动装置上的流
速。

[0260] 可以使用广泛多样的天然的和合成的有机和无机聚合物来过滤样品。示例性的聚合物包括聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚(对苯二甲酸乙二酯)(poly(ethylene terephthalate))，人造丝，尼龙，聚(丁酸乙烯酯)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)(PVDF)，硅氧烷，聚甲醛，纤维素，醋酸纤维素，硝化纤维素，玻璃纤维滤纸，聚氯乙烯，聚乙酸乙烯酯(polyvinyl acetate)，乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物，聚酰胺，聚碳酸酯，奥纶(orlon)，聚酯，聚苯乙烯，等等，或者还可以使用掺合物。在优选的实施方案中，滤器的孔径允许样品蛋白通过而防止其他物质(例如，细胞碎片)通过。例如，滤器孔径可以在例如0.1μm-50.0μm范围内。优选地，孔径在0.5-25μm，1.0-20μm，2.0-15μm，3.0-10μm，或4.0-6.0μm范围内。例如，在通过使细胞与本发明的提取试剂接触然后与本发明的中和试剂接触进行的蛋白提取步骤后，样品可以通过孔径为0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，
1.6，1.8，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0或8.0μm的滤器。本领域技术人员应该认识到，基于待过滤的样品，可能需要不同的孔径。可以迫使样品通过滤器(例如，通过包含膜滤器孔的注射器或使用通过滤器的真空吸力)。存在本领域技术人员公知的多种过滤样品的方法。

[0261] 样品过滤可以导致样品的提高的流速。在一些情形中，相比于不过滤的样品，样品的流速可以提高5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。适当的滤器尺寸可以在信号检测没有任何可评估的损失的条件下引起流速的提高。

[0262] 可以将获自上述测定方法的结果与获自合适的对照，例如，阳性对照(其中，可以使用已知含有与捕获剂结合的蛋白质的蛋白质提取物)或阴性对照(例如，其中可以使用不
与细胞样品相接触的蛋白质提取试剂)的结果进行比较。

[0263] 获自上述测定方法的结果可以显示在蛋白质提取物中蛋白质的存在、缺乏，或在某些实施方案中，显示在蛋白质提取物中蛋白质的量。

[0264] 在某些实施方案中，可以将获自上述测定方法的结果传达回远程位置，例如，通过电话、传真、电子邮件、邮寄或任何其他方式。例如，可以将所述结果传达给受试者或受试者的医生。

[0265] 以上蛋白质检测方法可以与不同的检验，诸如细胞学检验，例如用于确定癌或癌前子宫颈细胞的Pap检验、或其他分子检验联合进行。在这些实施方案中，在使用前，可以将细胞样品分为几部分。第一部分可以在细胞学测定中使用，且第二部分可以在上述方法中
使用。

[0266] 依照以上内容，本发明的某些实施方案还提供了用于产生蛋白质提取物的系统。该系统通常含有：a)包含固定的或未固定的细胞的细胞样品；b)具有至少约pH 10.0的pH的提取试剂；和c)中和试剂，其中所述固定的或未固定的细胞、提取试剂和中和试剂可以在以上方法中使用，从而产生适合于在结合测定中使用的蛋白质提取物。所述提取试剂和/或中和试剂含有聚氧乙烯烷基醚。

[0267] 试剂盒

[0268] 在另一方面中，本发明提供用于实施本主题方法的试剂盒，例如，用于从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物的试剂盒，在某些实施方案中，用于检验蛋白质提取物中蛋白质的存在的试剂盒。本主题试剂盒至少包括具有至少约pH 10.0的pH的提取试剂，和中和试剂。所述提取试剂和/或中和试剂含有聚氧乙烯烷基醚。另外，该试剂盒可以包括用于检测蛋白质的捕获剂，和，在某些实施方案中，用于利用捕获剂检测蛋白质的试剂(例如，缓冲剂和检测试剂)。以上成分可以存在于分别的容器中或可以将一种或多种成分组合到
一个容器，例如玻璃或塑料瓶中。

[0269] 除以上成分外，本主题试剂盒还可以包括用于实施本主题方法的说明书。这些说明书可以以多种形式出现在本主题试剂盒中，在试剂盒中可以存在一份或多份说明书。这
些说明书可以出现的一种形式是作为在试剂盒包装中、在包装插页等中的合适媒介或基底
上印刷的信息，例如在一张或数张在其上印刷了该信息的纸上的印刷的信息。另一种方式
是其上记录了该信息的计算机可读媒体，例如，磁盘、CD、等。再一种可以出现的方式是可以用来通过互联网访问处于远端的信息的网站地址。该试剂盒中可以存在任何便利的方式。

[0270] 效用

[0271] 上述方法和系统易于用于多种研究和诊断方法，包括诊断特殊疾病或病症、或由传染性媒介诸如病毒或细菌引起的感染的方法。在一个实施方案中，将本方法用作检测HPV感染的细胞的诊断的一部分。由于HPV的致癌毒株的存在与癌细胞和癌前细胞相关，所以本方法可以用于检测癌或癌前子宫颈细胞。

[0272] 已知HPV是下列疾病中的病原体：疣状表皮发育不良(epidermodysplasia verruciformis)(EV)，即导致皮肤(例如，鳞状细胞的(squamocelllar))癌高风险的终身皮肤病症；子宫颈瘤形成(cervical neoplasias)，诸如子宫颈上皮内瘤形成(cervical 
intraepithelial neoplasia)(CIN)和侵入性子宫颈癌(invasive cervical carcinoma)
(ICC)；阴道瘤形成(viginal neoplasias)，诸如阴道上皮内瘤形成(vaginal 
intraepithelial neoplasia)(VAIN)和阴道癌(vaginal carcinoma)(VC)；外阴瘤形成
(vulval neoplasias)，诸如外阴上皮内瘤形成(vulvar intraepithelial neoplasia)
(VIN)和外阴癌(vulvar carcinoma)；阴茎癌(penile carcinoma)(包括，退行发育丘疹病
(Bowenoid papulosis))；肛门(AC)和肛周癌(PC)(anal(AC)and perianal carcinomas
(PC))；口咽癌(oropharyngeal carcinomas)(OS)；食管癌(esophageal carcinomas)(EC)；
非-黑素瘤皮肤癌(non-melanoma skin cancers)(例如，基细胞癌(basal cell 
carcinoma)-BCC和鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)-SCC)；和黑素瘤(melanoma)。
同样，在一个实施方案中，本方法可以用作对任何这些疾病的诊断。

[0273] 在一个实施方案中，从受试者获得(例如，剥离或切除)细胞，并将其存放在含有固定剂的液体培养基中，在某些实施方案中，所述含有固定剂的液体培养基可以是用于细胞学检验的运送培养基。通常在医生的办公室或诊室中获得细胞，将细胞样品转送到检验机
构并且由其接收，在所述机构中，进行上述蛋白质检测方法和，任选地，进行细胞学测定。将来自该检验的结果传达给受试者，在一些实施方案中，通过医生及其同事传达。

[0274] 其细胞被采用的受试者可以是哺乳动物，例如，狗或猫，啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠、或大鼠)，或灵长类动物(例如，人、黑猩猩、或猴)。在许多实施方案中，受试者应该是人，具体地，男性或女性。在某些实施方案中，受试者可以表现出HPV感染的症状(例如，可以在身体的一处或多处具有疣)，可以被怀疑受到HPV的感染(例如，可以含有与所述感染在细胞学上一致的细胞)或可以已被检验出HPV阳性。在某些实施方案中，受试者可以不具有HPV感染的适应证，且以上方法可以用作常规筛查的一部分。

[0275] 在一个实施方案中，本方法可以用于检测致癌HPV的任何毒株，例如，HPV 26，HPV 53，HPV 66，HPV 73，HPV 82，HPV 16，HPV 18，HPV 31，HPV 35，HPV 30，HPV 39，HPV 45，HPV 
51，HPV 52，HPV 56，HPV 59，HPV 58，HPV 33，HPV 66，HPV 68或HPV 69，(特别地，任何最普遍的HPV毒株，例如，HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33和HPV 45)，其通过检测来自所述毒株的E6蛋白而进行。在一个实施方案中，在本方法的起始点，尚不知固定的或未固定的细胞是否含有致癌E6蛋白或致癌E6蛋白来自哪种毒株。如果检测测定显示出在细胞中存在致癌E6
蛋白，则感染那些细胞的HPV毒株的身份能够通过其他分子测定或通过病毒DNA测序而确
定，所述分子测定例如使用对特殊E6蛋白或由病毒编码的其他蛋白质特异的抗体的那些。

[0276] 通过举例说明而非限制的方式，提供了以下实施例。实施例

[0277] 实施例1：提取掺加的(spiked)临床样品

[0278] 将受HPV16 E6基因(C33A+)转染的细胞用THINPREPTM培养基固定，并如下所列出地，将其添加(即，“掺加”)到部分THINPREPTM-固定的临床样品中。将细胞掺加到5种临床样品中每一种的一半中(每一半临床样品具有两千万个C33A+细胞)。

[0279] 提取方案：

[0280] C33A(+)ThinPrep细胞/20M细胞/ml

[0281] 1-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#229(1.0ml提取物)中

[0282] 2-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#230(1.0ml提取物)中

[0283] 3-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#231(1.0ml提取物)中

[0284] 4-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#232(1.0ml提取物)中

[0285] 5-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#233(1.0ml提取物)中

[0286] 6-20M C33A(+)ThinPrep细胞(1.0ml提取物)

[0287] 提取试剂：

[0288] Triton X-100/Lot 092K0171-(1％＝250μl)

[0289] 5M NaCI/Lot 5701-53-(0.15M＝750μl)

[0290] 0.5M Tris碱/Lot 5708-20-(0.1M＝5ml)

[0291] 05M甘氨酸/Lot 5708-9-(0.1M＝5ml)

[0292] 10％SDS/Lot 5708-8-(0.05％＝125μl)

[0293] 8M尿素/Lot 5678-83-(0.25M＝781μl)

[0294] 加入RO/DI至20ml-(8.1ml)

[0295] 5N NaOH/Lot A09522-(525μl)

[0296] 加入RO/DI至25ml-(4.475ml)

[0297] 最终pH-11.48

[0298] 最终制剂：0.1M Tris/0.1M甘氨酸/0.15M NaCl/1％TritonTM X-100/0.05％SDS/0.25M尿素pH 11.48

[0299] 蛋白质提取程序：

[0300] 1.将细胞混悬液加入到50ml离心管中

[0301] 2.在3000rpm旋转10-15分钟

[0302] 3.小心地去除上清液

[0303] 4.将内容物转移到1.5ml nunc管中

[0304] 5.在3000rpm旋转10-15分钟

[0305] 6.小心地去除上清液

[0306] 7.向沉淀加入需要量的提取试剂

[0307] 8.重新混悬，从而打碎细胞沉淀

[0308] a.添加剂(处于1∶100的DTT)

[0309] 9.检查pH，调节到11.5

[0310] 10.在RT(或对提取合适的温度)下混合30分钟

[0311] 11.在14,000rpm旋转10-15分钟

[0312] 12.去除澄清的上清液

[0313] 13.加入处于1∶100的DTT

[0314] 14.用5N HCl中和到pH 8.0，并在ELISA中检验

[0315] (用31.0μl 5N HCl/1ml中和到pH 8.0)

[0316] 100mM DTT/NR 5701-90/DOM 2/7/05

[0317] ELISA方法

[0318] 1-用5ug/ml处于PBS(lot 021405)中的GST-Magi-PDZ(lot 88.18/0.65ug/ul)包被平板(Nunc 439454Maxisorp F96/lot 542043)-100ul/孔

[0319] 11ml x 5ug/ml＝55ug x 1ul/0.65ug＝84.6ul GST-Magi-PDZ

[0320] 2-在4℃温育过夜

[0321] 3-用平板清洗剂清洗3次(TBS-Tween)

[0322] 4-用250ul封闭缓冲液(lot 033005)封闭平板

[0323] 5-在25℃温育2小时

[0324] 6-用平板清洗剂清洗3次(TBS-Tween)

[0325] 7-将100ul MBP-E6/溶解产物样品加入到合适的孔中

[0326] 8-在25℃温育1小时

[0327] 9-用平板清洗剂清洗3次(TBS-Tween)

[0328] 10-将100ul处于5ug/ml的抗-E6抗体(4C6-2.85mg/ml-lot 02)加入到处于2％BSA HNTG缓冲液(lot 031805B)中的合适孔中。将N-末端肽(HPV16E6lot#PN3952-2)以10ug/ml
加入到合适的样品中，从而证实信号的特异性(在加入前，用抗-E6抗体预培养肽45分钟)

[0329] 11-在25℃温育2小时

[0330] 12-用平板清洗剂清洗3次(TBS-Tween)

[0331] 13-在2％BSA/0.05％Tween20缓冲液(lot 040505)中制备山羊抗-小鼠IgG-HR(杰克逊(Jackson)GxM IgG-HRP/目录#115-035-062/lot 60988)的1∶5000稀释液。

[0332] 10.0ml x 1/5000＝0.002ml x 1000ul/ml＝2.0ul山羊抗-小鼠IgG-HRP

[0333] 14-将100ul 1∶5000山羊抗-小鼠IgG-HRP稀释液加入到合适的孔中(去除TMB底物并置于室温下)

[0334] 15-在25℃温育1小时

[0335] 16-用平板清洗剂清洗5次(TBS-Tween)

[0336] 17-加入100ul Neogen K-蓝TMB底物(lot 041018)

[0337] 18-在25℃温育30分钟

[0338] 19-加入100ul终止溶液(lot 030705)并读取A450

[0339] 制剂：

[0340] 2％BSA/0.05％Tween缓冲液-(lot 040505)

[0341] 2％BSA封闭剂lot 033005(49.975ml)

[0342] Tween20lot A016759301(0.025ml)

[0343] 结果

[0344]

[0345] 如能够从上表中所示结果看到地，对所有掺加的临床样品检测到E6结合。

[0346] 实施例2：高pH缓冲液加添加剂对MBP-E6检测的影响

[0347] 图1所述的实施例举例说明不同组成的缓冲液对重组麦芽糖结合蛋白(MBP)-E6蛋白的检测的影响。通常，应该使用本文所述的提取缓冲液从细胞中提取蛋白。然而，此处，使用预先纯化的重组蛋白以最优化条件。简言之，图1A所述的实验包括将MBP-E6蛋白悬浮在
新鲜制备的、在添加剂含量和pH方面不同的提取缓冲液中。该“提取”步骤之后是中和步骤，在中和步骤中，样品的pH被调节至中性pH。然后，使用侧向流动测定检测MBP-E6蛋白。

[0348] 缓冲液的组成

[0349] 本文所述的实验中所用的缓冲液来源于两种缓冲液之一，一种为较低pH缓冲液，即“缓冲液1”，另一种为较高pH缓冲液，即“缓冲液2”。缓冲液1(pH约为11.5)由下列组成：约
100mM Tris/甘氨酸，约50mM Hepes，约150mM NaCl，约1mM EGTA，约1.1％TritonTM X-100，和约0.125-0.14N NaOH。缓冲液2(pH约为12-13)由下列组成：约0.1N NaOH和约50mM柠檬酸三钠。然后用或不用“低量”或“高量”图1A所示的添加剂补充每种缓冲液。添加剂在低-添加剂缓冲液中的浓度为约：0.25M尿素；0.05％SDS；2％TweenTM-20；2％BrijTM 35(西格玛
(Sigma))；2％皂苷(saponin)；2％Tergitol NP 40；或10mM EDTA，pH 8。添加剂在高-添加剂缓冲液中的浓度为约2M尿素；0.5％SDS；4％TweenTM-20；4％BrijTM 35；4％皂苷；4％TM
Tergitol NP 40；或50mM EDTA，pH 8。如上文所示，缓冲液1具有1.1％Triton  X-100的储备水平，其用于低的和高的样品二者。对于缓冲液2，TritonTM X-100的浓度为2％(低)或4％(高)。

[0350] 在本文所述的大部分实施例中，缓冲液，包括各种添加剂，在即将加入至样品之前制备。然而，在某些情形中，在向样品中引入一种或多种添加剂之前，首先用缓冲液处理该样品。

[0351] 检测MBP-E6蛋白

[0352] 在图1A所述的实验中，将520pg MBP-E6悬浮在1.03-1.13ml用所示添加剂新鲜配制的所示提取缓冲液中。然后，将该混悬液在RT下轻轻混合(末端-对-末端)约30分钟。对于中和步骤，使用约2M Tris将该混悬液调节至较低的pH(约7.8-8)，并且再在RT下旋转30分
钟。将约150-200ul样品通过本文所述的侧向流动(LF)测定进行分析，以检测MBP-E6重组蛋白。

[0353] 侧向流动(LF)测定的描述

[0354] 本文所述的侧向流动(LF)测定也称为免疫色谱测定或浸染棒测定(dipstick assay)。简言之，本文的LF测定包括将金-粒子结合的病毒蛋白捕获在LF棒上存在的“捕获区”上。成功的捕获导致在LF条带上出现可视且可检测的线条。

[0355] 材料：20％(w/v)BSA 0.22μm过滤的(西格玛(Sigma)A7906)；胶体金8G11(BBI)；侧向流动条带，PDZ捕获。

[0356] 方法：1)将约150-200μl样品一式两份置于96孔平板的两个孔中。

[0357] 2)向每个孔中加入约20μl 20％BSA，并且用移液管吸头混合。

[0358] 3)向每个孔中加入约10μl 8G11-缀合的胶体金，并且用移液管吸头混合。8G11是识别HPV16 E6蛋白的单克隆抗体(mAb)。

[0359] 4)将LF条带置于每个孔中约120分钟，以允许样品通过毛细管作用在该条带上迁移。可以在远端附着有吸附垫，以促进液体在条带上流动。在样品迁移过程中，HPV 16 E6蛋白可以与附着在胶体金粒子上的mAb结合。E6蛋白还被LF条带上包含多种携带PDZ结构域蛋
白的区域所捕获，所述多种携带PDZ结构域蛋白能够识别E6蛋白。所述捕获导致在LF条带上出现可视且可检测的红线。

[0360] 5)然后通过UMM仪器分析该LF条带，所述UMM仪器为能够量化可视信号输出的测量反射系数的读取仪。所获得的值是相对的反射系数值。

[0361] 结果

[0362] 图1所示的实施例表明组合某些添加剂和高pH提取缓冲液(缓冲液2，pH 12.9)对MBP-E6蛋白的检测产生协同作用。例如，当在不存在添加剂条件下比较缓冲液1和缓冲液2
时，似乎提高的pH对重组MBP-E6蛋白的检测没有影响(图1A，后4列)。某些添加剂，特别是SDS，TWEENTM-20，BrijTM 35和Tergitol NP40，在甚至使用较低pH的缓冲液，即缓冲液1，pH 
11.5时，的确提高MBP-E6蛋白的检测(图1A)。然而，当将添加剂与较高pH缓冲液(缓冲液2)TM TM TM
组合时，在SDS，TWEEN -20，Triton  X 100，和Brij  35样品中，极大提高了重组蛋白的检测。例如，当提高pH时，在TritonTM X-100处理的样品中的蛋白检测由0跃至高于～2.4UMM的读数。因此，有可能推论在“提取”步骤中组合高pH与某些添加剂对E6蛋白的检测产生协同作用。

[0363] 图1B描述了与在1A中进行的实验相似的实验。然而，图1B中，是在中和步骤而不是之前的“提取”步骤过程中向样品中引入添加剂。与在提取步骤过程中引入添加剂时相比，这一方法产生低得多的信号强度。因此，在中和步骤引入添加剂不是最理想的方法。

[0364] 实施例3：添加剂对由细胞提取E6蛋白的影响

[0365] 图2所示的实施例评价了不同百分数的缓冲液添加剂对由细胞提取E6蛋白的影响。在该实施例中，蛋白提取自表达HPV16 E6基因的SiHa细胞或提取自C33A-细胞，C33A-细胞为非HPV感染的子宫颈癌细胞系。提取步骤

[0366] 对于提取步骤，首先从-80℃冰箱中取出包含约一千万个细胞的细胞沉淀物，并且允许在RT下解冻约10分钟。然后，向大部分样品中加入约750μl实施例2所述的缓冲液2。还向指定的样品中引入添加剂，如BrijTM 35，TweenTM-20，或TritonTMX-100。这些添加剂以2％或4％(v/v)的终浓度存在。作为对照，一些样品用缓冲液673提取，缓冲液673为一种中性pH缓冲液，其包含20mM Tris pH 8，2％BSA，1％TritonTM-X 100，2％TweenTM-20，0.2％肌氨酸，250mM NaCl，和50mM EDTA。将样品短时涡旋振荡，然后在RT下旋转30分钟。

[0367] 中和步骤

[0368] 对于中和步骤，加入约140-180ul的2M Tris，pH 6.0，以将每份样品的pH减小为约pH 7.8-8。中和样品的pH所需要的Tris，pH 6.0的体积预先凭经验确定。在加入Tris和短时涡旋后，将样品在RT下旋转30分钟。然后，通过以14K rpm离心10分钟而澄清样品。然后，在通过实施例2所述的LF测定进行分析之前，将澄清的溶解产物(终体积约为1.09)转移至干净管中。

[0369] 结果

[0370] 当在提取步骤中使用含有4％BrijTM 35的缓冲液2时，最好地检测到HPV 16 E6蛋白(图2)，另外，比较来自SiHa细胞与HPV E6-阴性C33A-细胞的信号，表明这种条件还极大地提高了所述测定的信噪比(图2)。

[0371] 实施例4：在用4％BrijTM35/缓冲液2提取后HPV-16 E6蛋白的剂量响应检测

[0372] 在该实施例中，用实施例2和3中所述的4％BrijTM35/缓冲液2提取渐增数量的表达6
HPV-16 E6的SiHa和Caski细胞。提取方法与实施例3所述的方法相似，并且使用约9.2X 10
细胞/ml的起始浓度。然而，LF测定的不同在于，每个LF条带使用递增的细胞数目。如图3所示，LF测定中所用的每个条带的细胞数目为约31,000；约62,000；约125,000；约250,000；约
500,000；约1,000,000；或约1,700,000。阴性对照包括用中性pH的缓冲液673提取这些细胞(实施例3所述)和用4％BrijTM35/缓冲液2或缓冲液673提取HPV-阴性C33A细胞。

[0373] 如图3所示，当使用C33A细胞时不存在剂量响应，当使用中性pH缓冲液673时仅有有限的剂量响应。然而，由于使用了渐增的细胞数目，在两种表达HPV-16 E6的细胞系(SiHa和Caski)中检测到渐增量的E6蛋白。这些结果表明该测定以剂量-响应方式检测HPV-16 E6
蛋白。

[0374] 实施例5：在由掺加的临床样品提取HPV-16 E6蛋白中使用4％BrijTM35/缓冲液2

[0375] 图4所示的实施例举例说明在来自已经组合或“掺加”了表达HPV-16 E6的SiHa细胞的PAP正常临床样品的提取物中检测HPV-16 E6蛋白。本实施例中所用的临床样品是传统
Pap涂片检测为阴性的未固定的、子宫颈刷拭样品(brush sample)。首先将该样品由-80℃
冰箱取出，并且允许在RT下解冻约10分钟。然后用小剪钳剪掉每个刷子，然后将其置于含有约一千万个SiHa细胞的冷冻细胞沉淀物的微量离心管中。以与实施例3和4所述的那些相似
的方式进行样品的提取、中和和LF测定。对于这一实验，在提取步骤过程中使用4％
BrijTM35/缓冲液2或中性缓冲液673(二者均在前述实施例中描述过)。两种缓冲液的提取体积约为1ml。

[0376] 在5份使用4％BrijTM35/缓冲液2提取的SiHa-细胞-掺加的临床样品中检测到非常大量的HPV16 E6蛋白(图4)。相反，5份非-SiHa掺加样品的提取产生较低的信号。类似地，使用缓冲液673提取每种细胞类型也产生较低的信号。这些结果表明，在将来可以成功地使用BrijTM35/缓冲液2来检测临床样品中的HPV16 E6蛋白。

[0377] 实施例6：进一步优化用于蛋白提取的BrijTM35/缓冲液2

[0378] 该实施例举例说明使用不同百分比的BrijTM 35和/或不同的添加剂组合进一步优化BrijTM 35提取。此处，使用含有不同BrijTM 35水平的缓冲液2(实施例2所述)辅助由SiHa细胞提取HPVl6 E6，SiHa细胞为转染了HPV16 E6的基因的细胞系(图5)。另外，还检测了含有与其他添加剂如EDTA，TweenTM-20，或TritonTM X-100组合的BrijTM 35的缓冲液2。对于这一实验，提取、中和和LF测定步骤与实施例2和3所述的那些相似，区别在于提取缓冲液中所用的添加剂水平不同。提取缓冲液中所用的添加剂的量为：4％BrijTM35，5％BrijTM 35，6％BrijTM 35，4％BrijTM 35+10mM EDTA，2％BrijTM 35+2％Tween-20，2％BrijTM 35+2％
TritonTMX-100，2％BrijTM 35+2％TweenTM-20+2％TritonTM X-100，或2％BrijTM 35+2％TweenTM-20+10mM EDTA。作为对照，一些样品用中性pH缓冲液673提取。每个LF条带的近似细胞数目为约1,300,000。

[0379] 如图5所示，BrijTM 35百分数由4％增加至6％导致对HPV 16 E6蛋白的提高的检测。该测定还通过向BrijTM 35缓冲液中添加TritonTM X-100和/或TweeTMn-20而改善。

[0380] 实施例7：提取和/或中和步骤的时间对HPV16 E6蛋白检测的影响

[0381] 本实施例举例说明提取和/或中和步骤的时间对HPV E6蛋白的最终检测所具有的影响。在本实施例中，通常按照实施例3所述的步骤，同样从SiHa细胞提取E6蛋白。然而，在该实施例中，提取和/或中和步骤的温育时间改变(图6)。SiHa细胞以约10,000,000细胞/ml提取30分钟或10分钟，并且中和30分钟或10分钟，如图6所示。中和步骤的终止时间由澄清步骤的离心时间所确定。另外，对于LF测定，每个条带使用1,700,000或500,000个SiHa细
胞。

[0382] 当使用不同的提取或中和温育时间时，没有检测到HPV-16 E6蛋白的显著不同(图6)。因此，本实施例表明，当提取和/或中和温育步骤的时间由30分钟改变为10分钟时，所述测定没有受到不利的影响。

[0383] 实施例8：使用4％BrijTM35/缓冲液2提取E6蛋白的HPV 18和HPV 45变体

[0384] 本实施例举例说明实施例2和3中所述的4％BrijTM35/缓冲液2提取系统提取不同HPV毒株的E6蛋白的应用(图7)。E6蛋白提取自表达HPV 18的HeLa细胞或表达HPV 45的
MS751细胞。HPV阴性C33A-细胞系用作阴性对照。提取和中和步骤与实施例2和3所述的那些相似。对于LF测定，每个LF条带使用相等的约1,700,000个各种类型的细胞。此外，LF测定中所用的胶体金与识别HPV毒株18和45的E6蛋白的F82-5A2单克隆抗体缀合。

[0385] 如图7所表明的，4％BrijTM35/缓冲液2提取系统可以成功地用于提取HPV18 E6蛋白和HPV45 E6蛋白。

[0386] 实施例9：使用4％BrijTM35/缓冲液2提取E6蛋白的HPV 16和HPV 18变体

[0387] 本实施例比较了HPV16 E6蛋白的和HPV 18E6蛋白的4％BrijTM35/缓冲液2提取。关于图8所述实验的提取和中和步骤以与实施例8的那些相似的方式进行。然而，本实施例使
用的是表达的HPV16的SiHa细胞和表达HPV 18的HeLa细胞。同前，将C33A-细胞用作阴性对
照。对于LF测定，每个LF条带使用渐增数量的细胞(与实施例4相同的范围)。另外，在SiHa细胞提取物的LF测定中使用抗-HPV16金，而在HeLa细胞提取物的LF测定中使用抗-HPV18金.

[0388] 在来自HeLa和SiHa细胞的提取物中检测到E6蛋白(图9)。HPV16 E6蛋白和HPV18 E6蛋白二者的检测以剂量-响应方式发生(图9)。

[0389] 实施例10：进一步优化BrijTM35/缓冲液2系统

[0390] 本实施例举例说明将缓冲液2(实施例2所述)中的BrijTM35水平由约4％改变为约10％的影响。对于图9所述的实验，提取和中和步骤与实施例3的那些相似。如在该实施例
中，起始细胞为HPV16-感染的SiHa细胞或HPV-阴性C33A-细胞。然而，此处，在提取时存在的BrijTM35百分比不同。更具体地，所用的BrijTM35百分比为：约4％，约6％，约8％或约10％。
另外，还检测了2％BrijTM35/2％TweenTM20和2％BrijTM 35/2％TweenTM-20/10mM EDTA。LF测定如本文所述那样进行。每个LF条带使用约170万个细胞。

[0391] 如图9所示，来自SiHa细胞提取物的阳性信号随着BrijTM35浓度增加而增加。然而，在由HPV-阴性C33A-细胞制备的提取物中，信号也增加，这导致在较高的BrijTM百分比处的减小的信噪比。然而，当使用4％或6％BrijTM时，该测定的信噪比似乎得到改善。另外，组合BrijTM与TweenTM-20也似乎改善了信噪比。

[0392] 实施例11：优化由SiHa-掺加的阴性临床样品的提取

[0393] 本实施例举例说明改变提取条件对由SiHa-掺加的阴性临床样品提取E6蛋白的影响。此处所用的样品制备以及提取和中和步骤与实施例5所用的那些相似。然而，在本实施例中，阴性临床样品(NCS)存在于药签上而不是刷子上。另外，在本实验中改变提取条件，从而包括具有4％BrijTM35；2％BrijTM35/2％TweenTM-20，或；2％BrijTM35/2％TweenTM-20/
10mM EDTA的缓冲液2(图10)。如所示，对于LF测定使用约170万个SiHa细胞/条带。

[0394] 如图10所示的结果所示，由于SiHa-掺加的样品产生相对一致的阳性信号，而阴性样品产生相对较低的信号(图10)，所以4％BrijTM35/缓冲液2条件可能是检测临床样品中的HPV16 E6蛋白的优越条件。

[0395] 实施例12：在存在HPV-阴性细胞的条件下由SiHa细胞提取HPV 16 E6蛋白

[0396] 本实施例举例说明在存在HPV-阴性C33A-细胞的条件下由SiHa细胞提取HPV16 E6蛋白。对于本实施例，将渐增量的SiHa提取物滴定至含有固定量(约1百万/ml)C33A-细胞的缓冲液中(图11)。对于这一实验，每种细胞系分别使用4％BrijTM35/缓冲液2或Arbor Vita溶胞缓冲液(AVLB)提取。AVLB由下列组成：约50mM HEPES，pH约为pH 7.5，约1.1％
TritonTMX-100，约150mM NaCl，约10％甘油和约1mM EGTA。提取和中和步骤以与实施例3相似的方式进行。然而，在这一实验中，制备由AVLB或中和的4％BrijTM35/缓冲液2组成的稀释剂。然后，将C33A-提取物以约1百万个细胞/ml的水平掺加至每种缓冲液中。然后，将SiHa细胞提取物连续稀释至所示的包含C33A-的缓冲液中。样品通过细胞计数珠阵列(CBA)分析，
并由荧光计进行读数。

[0397] 本实验的结果揭示检测E6蛋白的最佳条件为4％BrijTM35/缓冲液2提取和中和然后稀释在AVLB缓冲液中(图11)。另外，检测E6蛋白的水平似乎为约5000个细胞/ml或500个
细胞/孔(图11)。

[0398] 实施例13：由固定在ThinPrepTM或SurePathTM固定剂中的SiHa细胞提取HPV 16 E6蛋白

[0399] 本实施例举例说明缓冲液2/4％BrijTM35提取系统可以用于从固定的细胞提取蛋白。在图12所述的实验中，将一千万个HPV16阳性SiHa或HPV-阴性C33A-细胞添加至1ml所示的固定剂或DMEM培养基中在RT下1小时。然后，将细胞以1000RPM离心15分钟，沉淀，并且重悬在1ml实施例3所述的4％BrijTM35/缓冲液2中。然后，对样品进行实施例3所述的提取、中和和LF测定。

[0400] 如图12所示，在提取步骤中使用4％BrijTM35/缓冲液2时，成功地检测到ThinPrepTM-和SurePathTM-固定的SiHa细胞二者中存在的E6蛋白。

[0401] 由以上结果和讨论证明本主题方法为固定的或未固定的细胞的分子分析提供许多独特的优势。具体地，本方法提供用于从固定的或未固定的细胞中产生蛋白质提取物的
常规方法，其中蛋白质提取物中的蛋白质是可以在结合测定中检测的。由于通常很难检测
固定的或未固定的细胞中的某些蛋白质，所以，本主题发明表现出对本领域的显著贡献。

[0402] 实施例14：通过膜滤器过滤蛋白质提取物对样品流速的影响

[0403] 在本实施例中，蛋白提取自表达HPV16 E6蛋白的SiHa细胞或提取自C33A-细胞，C33A-细胞为非HPV感染的子宫颈癌细胞系，并且在评估得到的样品的流速之前使其通过过
滤膜运行。

[0404] 提取步骤

[0405] 对于提取步骤，首先从-80℃冰箱中取出包含约一千万个细胞的细胞沉淀物，并且允许在RT下解冻约10分钟。然后，向大部分样品中加入约750μl实施例2所述的缓冲液2。还向指定的样品中引入添加剂，如BrijTM 35，TweenTM-20，或TritonTMX-100。这些添加剂以2％或4％(v/v)的终浓度存在。将样品短时涡旋，然后在RT下旋转30分钟。

[0406] 中和步骤

[0407] 对于中和步骤，加入约140-180ul 0.9M Tris，pH 7.8，以将每份样品的pH减小为约pH 8.5。中和样品的pH所需要的Tris，pH7.8的体积预先凭经验确定。在加入Tris和短时涡旋后，将样品在RT下旋转30分钟。然后，通过以14K rpm离心10分钟而澄清样品。

[0408] 过滤步骤

[0409] 将澄清的溶解产物(终体积约为1.09)通过5.0μm Millipore PVDF注射器滤器过滤。然后，使样品通过样品流通装置运行，并且测量运行整份样品所需要的时间。还评估样品的免疫测定信号强度，并且在视觉上或用CAMAG密度计进行读数。HPV E6的存在视觉上以
0-4等级计分。

[0410] 结果

[0411] 样品通过5.0μm PVDF注射器滤器的流动时间减少，在一些情形中，减少几乎50％。数据显示在下表1中。另外，通过视觉读取评估样品表明在通过5.0μm注射器滤器过滤后
SiHa信号没有显著损失(图13)。

[0412] 表1.过滤后样品的流动评估

[0413]

[0414]

[0415] 将本说明书中引用的全部出版物和专利申请引入本文作为参考，如同将每篇单独的出版物或专利申请特别地和个别地指定引入作为参考。任何出版物的引用是关于其在提
交日前的公开，并且不应该将其解释为承认本发明没有资格通过在先的发明先于所述出版
物。

[0416] 尽管为了清楚理解的目的，通过举例说明或实施例详细描述了前述发明，但是对于本领域中普通技术人员明显地是，根据本发明的教导，在不偏离所附权利要求的精神或
范围的条件下，可以对其进行某些改变和改进。