一种鉴别太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种使用专属性肽段组鉴别太平洋鳕鱼(Gadus macrocephalus)鱼皮胶原蛋白的方法，以及一组用于通过液相色谱-串联质谱检测分析方法鉴定太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的对照多肽，包含有序列为SEQ ID NO.1-7的多肽。所述肽段组中虽有肽段在其他物种中存在，但其他物种中不会同时存在上述7条肽段，上述肽段组为太平洋鳕鱼皮胶原蛋白专有肽段组。

权利要求

1.一种用于检测太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的多肽组合，包含有如下序列的多肽：SEQ ID NO.1:EGPSGAAGQDGR、SEQ ID NO.2:GESGPAGPSGFAGPPGADGQTGPR、SEQ ID NO.3:GAMGPAGPDGQQGSR、SEQ ID NO.4:VGSPGPYGVGPSGIEGR、SEQ ID NO.5:GESGDTGPK、SEQ ID NO.6:GKPGLPGMPGSDGPPGHPGK、SEQ ID NO.7:GPQGPAGPAGPK。

2.权利要求1所述的多肽组合在检测太平洋鳕鱼皮胶原蛋白中的应用。

3.权利要求1所述的多肽组合在制备检测太平洋鳕鱼皮胶原蛋白制品中的应用。

4.一种鉴别鱼皮胶原蛋白来源的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)取冻干胶原蛋白用0.3～0.5mol/L的醋酸溶解，浓度为2～4mg/mL；

2)将胶原蛋白溶液用0.1mol/L NH4HCO3溶液调节pH值为7.0～7.8，在40～50℃条件下处理1.5～2.5h，然后12000×g离心15～25min；

3)取400～1000μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液，于37℃下酶解18～

24h；

4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，用Zip 微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；

5)液相色谱-串联质谱检测分析，分析条件如下：流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；

流速：0.3mL/min；

进样量：40μL；

TOF扫描范围：350-1500Da；

正离子反应模式；

将待测样本的质谱结果对比权利要求1所述的SEQ ID NO.1～7的各条特异性多肽，同时出现上述7条特异性多肽序列时，即可判定该样本为太平洋鳕鱼皮胶原蛋白。

说明书

一种鉴别太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的方法

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白分析技术领域，具体涉及一种鉴别太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的方法。

背景技术

[0002] 胶原蛋白是多细胞生物中含量最丰富、分布最广泛的蛋白质种类之一。胶原蛋白独特的分子结构、氨基酸组成以及良好的生物相容性和促细胞增殖能力使其在功能食品、化妆品、生物材料以及医学组织工程等领域中得以广泛应用。太平洋鳕鱼(Gadus macrocephalus)属于冷水性底层鱼类,为北方沿海出产的海洋经济鱼类之一,其皮肤胶原蛋白含有多种活性肽段，如促钙吸收活性、抗光老化活性以及提高免疫活性等。因此，其开发应用前景十分广阔。

[0003] 不同来源的鱼皮胶原蛋白相比较，有的热稳定性好、机械强度高，有的生物相容性好，抗原性低，有的含有多种活性肽段，如抗光老化活性，增加骨密度活性，降血压活性等，使得应用方向各有差异。因此对相关产品的区分和鉴别就显得十分重要。

[0004] 目前由于采用传统的电泳、氨基酸分析、红外光谱以及X-射线衍射等分析方法都无法区别不同来源的胶原蛋白，对相关产品的快速检测缺乏技术水平的支持，导致不少不良商人以次充好，欺骗消费者，因此需要一种高效准确的鉴定不同来源胶原蛋白的方法。

发明内容

[0005] 本发明对太平洋鳕鱼(Gadus macrocephalus)鱼皮胶原蛋白进行了研究，建立了从多肽水平对太平洋鳕鱼皮胶原蛋白来源进行鉴别的技术，从而有效的弥补现有技术的不足。

[0006] 本发明首先提供用于检测太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的多肽组合，包含有如下序列的多肽：

[0007] SEQ ID NO.1:EGPSGAAGQDGR、

[0008] SEQ ID NO.2:GESGPAGPSGFAGPPGADGQTGPR、

[0009] SEQ ID NO.3:GAMGPAGPDGQQGSR、

[0010] SEQ ID NO.4:VGSPGPYGVGPSGIEGR、

[0011] SEQ ID NO.5:GESGDTGPK、

[0012] SEQ ID NO.6:GKPGLPGMPGSDGPPGHPGK、

[0013] SEQ ID NO.7:GPQGPAGPAGPK；

[0014] 上述的肽段组用于检测太平洋鳕鱼皮胶原蛋白。

[0015] 本发明还提供一种鉴别于太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的方法，包括如下步骤：

[0016] 1)取冻干胶原蛋白用0.3～0.5mol/L的醋酸溶解，浓度为2～4mg/mL；

[0017] 2)将胶原蛋白溶液用0.1mol/L NH4HCO3溶液调节pH值为7.0～7.8，在40～50℃条件下处理1.5～2.5h，然后12000×g离心15～25min；

[0018] 3)取400～1000μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:25～50，w/w)，于37℃下酶解18～24h；

[0019] 4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，用Zip  微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；

[0020] 5)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：

[0021] 流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；

[0022] 流速：0.3mL/min；

[0023] 进样量：40μL；

[0024] TOF扫描范围：350-1500Da；

[0025] 正离子反应模式；

[0026] 将待测样本的质谱结果对比SEQ ID NO.1～7的各条特异性多肽的序列，同时出现上述7条特异性多肽序列时，即可判定该样本为太平洋鳕鱼皮胶原蛋白。

[0027] 本发明通过对胶原蛋白进行前处理，进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，得到酶解后肽段的序列。多次实验结果表明，SEQ ID NO.1～7肽段序列存在于太平洋鳕鱼皮胶原蛋白中，且其它来源胶原蛋白中不会存在其中的任意5条及以上的肽段。因此，本发明得到了太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的专属性肽段组，解决了以往胶原蛋白来源难以鉴别的问题。

具体实施方式

[0028] 胶原蛋白来源广泛，采用传统的电泳、氨基酸分析、红外光谱以及X-射线衍射等分析方法都无法区别不同来源的胶原蛋白。而本发明通过筛选胶原蛋白特异的多肽组合，可以有效的鉴定所判定的多肽是否为太平洋鳕鱼皮胶原蛋白。

[0029] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

[0030] 实施例1太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的专属性肽段组的获得

[0031] 1)取冻干胶原蛋白用0.3mol/L的醋酸溶解，浓度为4mg/mL；

[0032] 2)将胶原蛋白溶液用0.1mol/L NH4HCO3溶液调节pH值为7.8，在50℃条件下处理2.5h，然后12000×g离心15min；

[0033] 3)取400μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:25，w/w)，于37℃下酶解18h；

[0034] 4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，用Zip  微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；

[0035] 5)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：

[0036] 流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；

[0037] 洗脱条件：梯度洗脱，0～39min(乙腈:5％～80％)-42min(乙腈:80％)-42.5min(乙腈:80％～5％)-46min(乙腈:5％)；

[0038] 流速：0.3mL/min；

[0039] 进样量：40μL；

[0040] TOF扫描范围：350-1500Da；

[0041] 正离子反应模式。

[0042] 将质谱采集得到的wiff图谱文件采用AB SCIEX公司的ProteinPilotTM Software 5.0.1软件进行数据的处理和分析，选用uniprot的胶原蛋白数据库(uniport‐COLLAGEN.fasta)进行数据的检索。ProteinPilot软件参数设置如下：搜库方法：Paragon method；消化：Trypsin；仪器：TripleTOF 5600；物种：None；ID Focus：Amino acid Subtitutions，Biological modifications；Search Effort：Thorough ID；检测蛋白质阈值(Unused Protscore(conf))：>0.05％(10.0％)；提交错误发现率(False Discovery rate analysis，FDR)分析报告。筛选得到的多肽必须在每次实验结果分析中都出现，且置信区间在95％，将筛选得到的多肽序列使用BLAST‐NCBI进行序列比对。SEQ ID NO.1～7的各条肽段存在于太平洋鳕皮胶原蛋白中，且其它来源胶原蛋白中不会同时存在这7条肽段，因此，这7条肽段组成了太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的专属性肽段组。

[0043] 实施例2太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的检测分析

[0044] (1)取3份太平洋鳕鱼皮胶原蛋白分别进行实验，将冻干胶原蛋白用0.5mol/L的醋酸溶解，浓度为2mg/mL；

[0045] (2)将胶原蛋白溶液用0.1mol/L NH4HCO3溶液调节pH值为7.8，在50℃条件下处理2.5h，然后12000×g离心25min；

[0046] (3)取500μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:50，w/w)，于37℃下酶解19h；

[0047] (4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，用Zip  微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；

[0048] (6)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：

[0049] 流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；

[0050] 洗脱条件：梯度洗脱，0～39min(乙腈:5％～80％)-42min(乙腈:80％)-42.5min(乙腈:80％～5％)-46min(乙腈:5％)；

[0051] 流速：0.3mL/min；

[0052] 进样量：40μL；

[0053] TOF扫描范围：350-1500Da；

[0054] 正离子反应模式。

[0055] 将3份太平洋鳕鱼皮胶原蛋白检测分析得到的多肽序列与SEQ ID NO.1～7中的各条特异性多肽的序列进行对比，都出现了上述特异性肽段组的多肽序列，经验证这7条多肽序列可用于太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的判定。

[0056] 实施例3罗非鱼皮胶原蛋白的检测分析

[0057] 1)取冻干罗非鱼皮胶原蛋白用0.4mol/L的醋酸溶解，浓度为4mg/mL；

[0058] 2)将胶原蛋白溶液用0.1mol/L NH4HCO3溶液调节pH值为7.5，在45℃条件下处理2h，然后12000×g离心15min；

[0059] 3)取400～1000μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:50，w/w)，于37℃下酶解20h；

[0060] 4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，用Zip  微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；

[0061] 5)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：

[0062] 流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；

[0063] 洗脱条件：梯度洗脱，0～39min(乙腈:5％～80％)-42min(乙腈:80％)-42.5min(乙腈:80％～5％)-46min(乙腈:5％)；

[0064] 流速：0.3mL/min；

[0065] 进样量：40μL；

[0066] TOF扫描范围：350-1500Da；

[0067] 正离子反应模式。

[0068] 将分析得到的多肽序列与SEQ ID NO.1～7中的各条特异性多肽的序列进行对比，未出现上述的肽段组的序列，判定该样本不是太平洋鳕鱼皮来源胶原蛋白。