一个来源于玉米的转录因子ZmNLP9及其用途

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一个来源于玉米的转录因子ZmNLP9及其用途，该转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用该转录因子转入后的拟南芥与受体拟南芥相比，其鲜重明显增加、体内氨基酸含量和总氮含量增加、主根长度明显增加。

权利要求

1.一个来源于玉米的转录因子ZmNLP9，其特征在于：该转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.过表达转录因子ZmNLP9在提高植物氮素利用效率上的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：包含转录因子ZmNLP9的表达盒或核酸载体在提高植物氮素利用效率上的用途。

说明书

一个来源于玉米的转录因子ZmNLP9及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一个来源于玉米的转录因子ZmNLP9及其用途。

背景技术

[0002] 氮素是维持植物生长和生物产量的重要矿质营养元素之一，并且在生物体内参与核酸、蛋白质、脂类、叶绿素等多种生物大分子的合成。氮素缺乏显著限制植物的生长发育(Krouk et al.,2010,Current Opinion in Plant Biology 13,265 272)。所以在农业生产中广泛大量使用氮肥提高作物产量，使农业生产成本不断提高。每年全球施用到土壤中的氮肥约8.5-9.0千万吨，但是其中50-70％都未能被植物吸收而流失到环境中，造成了富营养化、土壤酸性化等严重的生态和环境问题。为了促进农业的可持续发展、保护生态环境和减少氮肥投入，就必须要提高植物氮素的利用效率，这已经成为当今植物营养研究的热点。

[0003] 多数作物如小麦、玉米等都是以吸收硝态氮为主，硝态氮既是植物生长发育所需要的重要营养物质，又是重要的信号分子能调控植物对于硝酸盐的吸收利用。但是土壤中硝酸盐的浓度变化范围很大，为了更好的适应环境，植物进化出了低亲和硝酸盐转运蛋白(NRT1家族)和高亲和硝酸盐转运蛋白(NRT2家族)。在模式植物拟南芥中，NRT1家族有53个成员，NRT2家族有7个成员。其中NRT1.1和NRT1.2在根中表达，主要负责高浓度硝酸盐条件下的吸收；NRT1.5-NRT1.12等成员则主要参与硝态氮在体内的分配过程(不同器官与组织之间的分配)。另外，AtNRT1.1是一个双亲和的硝酸盐转运蛋白，并被证明是硝态氮的感受器(Transceptor)，它能适应环境中硝酸盐的浓度而进行高亲和性和低亲和性的转换，这种转变主要是依赖CBL-CIPK蛋白激酶系统对其蛋白质的第101位的苏氨酸(thereonine,Thr)的磷酸化状态调控来实现的，这使得植物能够迅速适应硝酸盐浓度的变化而调整吸收硝酸盐的方式。当环境中硝酸盐浓度较低时，很多NRT2成员在根部被特异诱导表达，从而提高植物对硝态氮的吸收能力。硝酸盐在体内可暂时储藏在根细胞液泡内，也可以随蒸腾流由木质部导管输送到地上部；进入体内的硝酸根可在硝酸还原酶(NR)的作用下还原为亚硝酸根，再进入叶绿体或者质体中还原为NH4+，最终进入谷氨酰胺合成反应，并通过转氨基作用合成植物所需的氨基酸。

[0004] 在模式植物拟南芥中，硝酸盐的吸收、转运和同化过程以及对根系对硝酸盐的响应受到精细而严格的调控，这些过程主要是有硝酸盐信号转导过程中的调控基因完成的。已经证明AtNRT1.1作为调控基因调控了硝酸盐转运基因、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的转录，从而调控氮素利用；并且AtNRT1.1通过影响AtANR1调控硝态氮条件下侧根发生；AtNRG2位于AtNRT1.1的上游，通过调控AtNRT1.1影响硝态氮的利用；AtNGR2还能与AtNLP7互作影响在存在铵根离子时硝态氮的调控信号，以上证明硝态氮调控基因能够显著影响硝态氮的利用和植物对硝态氮的响应。

[0005] 玉米是我国第三大粮食作物，也是一种重要的饲料、经济及生物能源作物，其需求量与日俱增。但是在我国玉米生产过程中大量施用氮肥，导致玉米对氮肥的利用率很低(Juetal.,2009,Proc Natl Acad Sci USA,106:3041-3046)。培育高氮效的玉米新品种，是解决该问题的关键和有效途径，也是农业可持续发展和增强产品国际竞争力的基本要求。但传统遗传育种需要一个长期的过程，一定程度上无法短时间内解决该问题。而当今利用基因工程手段，特别是随着玉米转基因技术的成熟，使得我们有可能通过基因工程的手段快速的获得氮高效品种。而利用基因工程手段能否快速有效地获得转基因氮高效新品种在很大程度上取决于良好的功能基因的利用。

发明内容

[0006] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个来源于玉米的转录因子ZmNLP9及其用途，该转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用该转录因子转入后的拟南芥与受体拟南芥相比，其生物鲜重明显增加、体内氨基酸含量和总氮含量增加、主根长度明显增加。

[0007] 本本发明的具体技术方案如下：

[0008] 一个来源于玉米的转录因子ZmNLP9，该转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，上述转录因子ZmNLP9是发明人通过聚合酶链式反应(PCR)方法，以三叶期玉米幼苗叶片提取RNA并将其反转录成cDNA为模板，利用下述引物扩增获得的：

[0009] 上游引物：5’-GGGTCGACGCAGCAGCAAGGTTTCATCCCAT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

[0010] 下游引物：5’-GGGGTACCACCAGAGCTTCCACAAGAACTGC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

[0011] 在获得上述转录因子之后发明人将其通过多种方式转入受体植物，结果发现过表达玉米ZmNLP9基因能够明显提高植物氮素利用效率：

[0012] 在以硝态氮(NO3-)为唯一氮源的条件下，转入ZmNLP9基因的拟南芥与受体拟南芥相比，其植物鲜重明显增加、体内氨基酸含量和总氮含量增加、主根长度明显增加。

[0013] 以该发现为基础，发明人将本发明所提供的转录因子转入受体植物并过表达后可以获得包含以下至少一种优势的植物：

[0014] A、植株生物量高于所述受体植物；

[0015] B、植株氨基酸含量、全氮含量高于所述受体植物；

[0016] C、主根长度长于所述受体植物；

[0017] 以上述转录因子ZmNLP9为基础，还可以继续对其进行修饰再导入受体植物中，以期望达到更好的表达效果：

[0018] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述ZmNLP9基因的氨基酸序列的同时改变核苷酸序列以更好适应受体植物的偏爱性；

[0019] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因5’端序列，以增加翻译效率；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

[0020] 3)与各种植物表达启动子的连接，以实现ZmNLP9基因转录强度的调节；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于受体物种要求；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在特定组织或器官中表达所述ZmNLP9基因；选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

[0021] 4)与适合的转录终止子连接，以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

[0022] 5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

[0023] 而发明人发现除了上述转录因子之外，包含该转录因子的核酸分子的表达盒或核酸载体也具备同样的功能，其中：

[0024] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0025] 所述ZmNLP9基因表达盒均指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.2所示的ZmNLP9的DNA，该DNA不但可包括启动所述ZmNLP9基因转录的启动子，还可包括终止所述ZmNLP9基因转录的终止子。进一步，所述ZmNLP9基因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol,120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy et al,(1985)EMBO J.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell et al,(1985)Nature,313:810；Rosenberg et al,(1987)Gene,56:125；Guerineau et al,(1991)Molecualr Genomics and Genetics,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；
Sanfacon et al,Gene and Development,5:141；Mogen et al,(1990)Plant Cell,2:
1261；Munroe et al,(1990)Gene,91:151；Ballad et al,(1989)Nucleic Acids Research,17:7891；Joshi et al,(1987)Nucleic Acids Research,15:9627)。

[0026] 可用现有的植物表达载体构建含有所述ZmNLP9基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

[0027] 所述ZmNLP9基因表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒栽体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method forPlantMolecular Biology VIII,Academy Press,NewYork,pp.411-463；Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

[0028] 所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。上述方法还包括在所述向受体植物中导入ZmNLP9基因后从导入所述ZmNLP9基因的植株中筛选表达ZmNLP9基因的植株得到所述转基因植物的步骤。

[0029] 所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

[0030] 以其为基础，导入上述ZmNLP9基因表达盒的重组微生物或导入上文所述ZmNLP9基因表达载体的重组微生物也属于本发明的保护范围：

[0031] 其中，所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。

[0032] 综上所述，利用本发明所提供的转录因子及其衍生产品转入拟南芥后，与受体拟南芥相比，其鲜重明显增加、体内氨基酸含量和总氮含量增加、主根长度显著增加。

附图说明

[0033] 图1为表达ZmNLP9基因的转基因拟南芥植株的RT-PCR分子验证结果，其中WT:野生型，nlp7-4:突变体，C9 1-8，C9 11-9,C9 12-5:将ZmNLP9序列转到nlp7-4突变体中的转基因株系，实验结果可以看出ZmNLP9可以在转基因株系中表达；

[0034] 图2为在0.2mM，2.5mM，5mM的KNO3条件下转ZmNLP9基因的转基因拟南芥根系生长照片，其中WT:野生型，nlp7-4:突变体，C1：ZmNLP9/nlp7-4-1转基因株系,C12：ZmNLP9/nlp7-4-8转基因株系，实验结果可以看出转基因株系根部主根长度长于对照植株；

[0035] 图3为在0.2mM，2.5mM，5mM的KNO3条件下转ZmNLP9基因的转基因拟南芥根系的主根长度和鲜重统计结果，其中WT:野生型，nlp7-4:突变体，ZmNLP9/nlp7-4-1和ZmNLP9/nlp7-4-12为转ZmNLP9基因的转基因拟南芥转基因株系，实验结果可以看出转基因株系的主根长度和鲜重明显高于野生型；

[0036] 图4为在1/2MS液体培养7天转ZmNLP9基因的转基因拟南芥体内氨基酸含量和总氮含量测定结果，其中WT:野生型，nlp7-4:突变体，C1：ZmNLP9/nlp7-4-1转基因株系,C12：ZmNLP9/nlp7-4-12转基因株系，实验结果可以看出转基因株系中氨基酸含量和总氮含量可以恢复至野生型水平。

具体实施方式

[0037] 以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

[0038] 在本发明的实施例中，所述ZmNLP9基因表达盒中启动所述ZmNLP9基因转录的启动子为花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，终止所述ZmNLP9基因转录的终止子为NOS。

[0039] 在本发明的实施例中，所述选择标记基因为赋予对抗生素潮霉素抗性的潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因hyg。所述ZmNLP9基因通过含有所述ZmNLP9基因表达盒的ZmNLP9基因表达载体导入目的植物。所述ZmNLP基因表达载体是在pCAMBIA1300的SalI和KpnI位点插入SEQ ID No.1所示的ZmNLP9编码序列得到的重组表达载体。

[0040] 实施例1转录因子ZmNLP9的获得

[0041] 取三叶期玉米幼苗叶片提取RNA并将其反转录成cDNA。以cDNA为模板，用[0042] 上游引物：5’-GGGTCGACGCAGCAGCAAGGTTTCATCCCAT’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

[0043] 下游引物：5’-GGGGTACCTCAACCAGAGCTTCCACAAGAACTGC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

[0044] 对ZmNLP9的核酸序列利用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火20s,72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸8min。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段得到SEQ ID NO.1所示的目的基因片段；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0045] 实施例2构建超表达拟南芥载体及其应用

[0046] 以pBI121载体为模板，利用引物35S_F(5’-AAGCTTatggtggagcacgacactctcga-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；)和35S_R：(5’-AAGCTTagagatagatttgtagagagagactgg-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；)，用Pfu高保真酶扩增35S启动子序列，PCR反应条件：98℃预变性4min；然后98℃30s，58℃30s，72℃1min，25个循环；72℃终延伸8min；由于在引物35S_F和35S_R中加入了HindIII酶切位点，PCR扩增产物经HindIII酶切后，连入同样经HindIII酶切后的植物表达载体pCAMBIA1300，经酶切和测序鉴定35S启动子以正确方向连入的克隆，构建成含35S启动子的植物过表达载体；再以pBI121载体为模板，利用引物Ter_F(5’-GAATTCgatctgtcgatcgacaagctcga-3’，其核苷酸序列如SEQID NO.7所示；)和Ter_R：
(5’-GAATTCtaattcgggggatctggatttta-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；)，用Pfu高保真酶扩增Ter终止子序列，PCR反应条件：98℃预变性4分钟；然后98℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，25个循环；由于在引物Ter_F和Ter_R中加入了EcoRI酶切位点，PCR扩增产物经EcoRI酶切后，连入同样经EcoRI酶切后的刚完成35S启动子插入的新的植物表达载体pCAMBIA1300，经酶切和测序鉴定Ter终止子序列以正确方向连入的克隆，构建成含35S启动子和Ter终止子的植物过表达载体pCAMBIA1300-35S-Ter。

[0047] 将实施例1中扩增得到的产物切胶，用Omiga公司的胶回收试剂盒进行胶回收。将回收到的片段用限制性内切酶SalI和KpnI酶切，并与用SalI和KpnI酶切的pCAMBIA1300-35S-Ter载体通过T4连接酶进行连接，然后转化March I大肠杆菌感受态细胞，将获得的阳性单克隆送测序，经过序列比对正确无误后，提质粒。

[0048] 将ZmNLP9的ORF片段连在载体的SalI和KpnI位点之间，构建超表达拟南芥载体。载体有植物转化筛选标记潮霉素基因。载体上的ZmNLP9ORF片段经测序正确后转入农杆菌GV3101，用花序侵染法侵染拟南芥nlp7-4突变体。T0代种子经过70％乙醇室温5min，26％次氯酸钠室温10min消毒，用无菌水清洗5遍后，均匀涂布在MS平板上(含潮霉素25mg/L)。4℃处理3天后转移至22℃培养箱生长。由于植物表达载体pCAMBIA1300中带有抗潮霉素的抗性基因，它在转化时能随目的基因一起转入植物体，因此在潮霉素培养基中，萌发约7-10天后，转基因植株的叶深绿，根较长；非转化的植株叶浅绿，根短，不能长期存活。将转化体移入营养土中生长直到收T1代种子。T1代种子按上述方法筛选，收T2代种子(每个株系收多个单株)。T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合，因此会有一部分无潮霉素抗性的种子出现；只有T2代为纯合体转基因株系的种子能全部在含潮霉素抗性的MS培养基中存活。每个T2代单株种子分别筛选，种植，收集每个单株的T3代种子，筛选每个单株的T3代种子，后代不分离的(均对潮霉素有抗性)进行RT-PCR鉴定(图1)。

[0049] 实施例3功能验证

[0050] 将实施例2中获得的转入ZmNLP9基因的转基因植物的种子为基础进行培养的株系在KNO3浓度为0.2mM，2.5mM，5mM的MS植物固体培养基上生长的表型进行分析。从结果中(图2)可以看出，表达ZmNLP9基因的转基因拟南芥植株的主根长度和鲜重较受体植物显著增加；1/2MS培养条件下，表达ZmNLP9基因的转基因拟南芥植株中氨基酸含量和总氮含量较受体植物都显著增加。