修饰的交联葡聚糖微球及其制备方法以及含此微球的医用组合物

摘要

本发明公开了一种阳离子修饰的交联葡聚糖微球及其制备方法以及含此微球的医用组合物，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被阳离子基团取代。所述的医用组合物由以下组分组成：修饰的交联葡聚糖微球，交联透明质酸钠，PBS缓冲液余量。组合物以注射剂的形式注入体内相应位置，交联透明质酸钠作为载体将交联葡聚糖微球输送至注射部位,随着交联透明质酸钠被组织吸收，交联葡聚糖微球在靶位逐渐被机体自身的结缔组织包围，并促进微球间成纤细胞和胶原蛋白的生成，从而稳定植入物的体积，达到持久的填充效果。本发明的医用组合物是一种理想的用于治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁的三类医疗器械。

权利要求

1.一种修饰的交联葡聚糖微球，其特征在于：是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代。

2.根据权利要求1所述的修饰的交联葡聚糖微球，其特征在于：修饰的交联葡聚糖的含氮量为0.5%～2.0%。

3.根据权利要求1或2所述的修饰的交联葡聚糖微球，其特征在于：修饰的交联葡聚糖干燥微球的粒径为80μm～250μm。

4.一种修饰的交联葡聚糖微球的制备方法，其特征在于所述修饰的交联葡聚糖微球是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代；制备时先制得交联葡聚糖微球，然后将交联葡聚糖微球与阳离子修饰剂进行反应，得到修饰的交联葡聚糖微球，包括以下步骤：①将葡聚糖和还原剂溶解于氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相；所述还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、VC中的一种；

②将表面活性剂溶解于有机溶剂中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中；

③开启搅拌，将步骤①得到的水相加入到步骤②已加入有机相的反应容器中，进行乳化，机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在20℃～50℃；

④向步骤③平衡的乳化体系中滴加交联剂，待交联剂滴加完成后，继续反应12h～36后反应完毕，交联反应温度为30℃～80℃；

⑤交联反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球先用有机溶剂洗涤以除去微球表面残留的表面活性剂和交联剂，接着用乙醇洗涤微球以除去微球表面残留的有机溶剂，再接着用蒸馏水对微球进行洗涤，除去其他水溶性杂质；水洗后的微球脱水、干燥后得到干燥交联葡聚糖微球；

⑥将步骤⑤得到的干燥交联葡聚糖微球加入氢氧化钠水溶液中，混匀；继续向氢氧化钠溶液中加入阳离子修饰剂，加毕在50℃～90℃下搅拌反应6～10h，得到阳离子修饰的交联葡聚糖微球；反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球洗涤、干燥。

5.根据权利要求4所述的修饰的交联葡聚糖微球的制备方法，其特征在于：步骤①的葡聚糖碱性水溶液中葡聚糖的浓度为0.11g/mL～0.67g/mL，葡聚糖中的葡萄糖单体与还原剂的物质的量比为9～25:1；步骤②有机相中表面活性剂的浓度为0.01～0.1g/mL；步骤④的交联剂为环氧氯丙烷或1,4丁二醇二缩水甘油醚，交联剂与葡聚糖的质量比为1～8:10。

6.根据权利要求4所述的修饰的交联葡聚糖微球的制备方法，其特征在于：步骤⑥中加入的阳离子修饰剂为2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二乙氨基溴乙烷盐酸盐、二乙氨基氯甲烷盐酸盐、二乙氨基溴甲烷盐酸盐、2-二羟乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二羟乙氨基溴乙烷盐酸盐中的一种。

7.一种修饰的交联葡聚糖微球的制备方法，其特征在于所述修饰的交联葡聚糖微球是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代；制备时先制得阳离子修饰的葡聚糖，然后交联成球得到微球，包括以下步骤：①将葡聚糖溶解于氢氧化钠水溶液中，混匀；继续向氢氧化钠溶液中加入阳离子修饰剂，加毕在50℃～90℃下搅拌反应6～10h，反应完毕后，向反应后溶液中加入乙醇，析出沉淀，过滤得到的沉淀为阳离子修饰的葡聚糖；

②将步骤①得到的阳离子修饰的葡聚糖、还原剂溶解于氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相；所述还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、VC中的一种；

③将表面活性剂溶解于有机溶剂中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中；表面活性剂为聚乙二醇双硬脂酸酯、聚乙二醇双油酸酯、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种；

④开启搅拌，将步骤②得到的水相加入到步骤③已加入有机相的反应容器中，进行乳化，机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在20℃～50℃；

⑤向步骤④平衡的乳化体系中滴加交联剂，此时开始进行交联反应，待交联剂滴加完成后，继续反应12h～36h后反应完毕，交联反应温度为30℃～80℃；交联剂为环氧氯丙烷或

1,4丁二醇二缩水甘油醚，交联剂与葡聚糖的质量比为1～8:10；

⑥步骤⑤交联反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的阳离子修饰的交联葡聚糖微球洗涤、干燥。

8.根据权利要求7所述的修饰的交联葡聚糖微球的制备方法，其特征在于：步骤①中加入的阳离子修饰剂为2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二乙氨基溴乙烷盐酸盐、二乙氨基氯甲烷盐酸盐、二乙氨基溴甲烷盐酸盐、2-二羟乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二羟乙氨基溴乙烷盐酸盐中的一种。

9.一种修饰的交联葡聚糖微球的制备方法，其特征在于所述修饰的交联葡聚糖微球是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代；制备时采用一锅反应，交联成球和阳离子修饰同时进行，包括以下步骤：①将葡聚糖和还原剂溶解于氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相；所述还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、VC中的一种；

②将表面活性剂溶解于有机溶剂中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中；

③开启搅拌，将步骤①得到的水相加入到步骤②已加入有机相的反应容器中，进行乳化，机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在20℃～50℃；

④向步骤③平衡的乳化体系中滴加交联剂，待交联剂滴加完成后，在30℃～80℃下先反应6～8小时，然后向反应体系中加入阳离子修饰剂，加毕在50℃～90℃下搅拌反应15～

20h得到修饰的交联葡聚糖微球；阳离子修饰剂为2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二乙氨基溴乙烷盐酸盐、二乙氨基氯甲烷盐酸盐、二乙氨基溴甲烷盐酸盐、2-二羟乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二羟乙氨基溴乙烷盐酸盐中的一种；

⑤交联、修饰反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球洗涤、干燥。

10.一种含有修饰的交联葡聚糖微球的医用组合物，其特征在于：按重量百分比该组合物由以下组分组成：修饰的交联葡聚糖微球4%～6 %，交联透明质酸钠1%～2 %，PBS缓冲液余量；其中的修饰的交联葡聚糖微球是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代。

11.根据权利要求10所述的含有修饰的交联葡聚糖微球的医用组合物，其特征在于：组合物中阳离子修饰的交联葡聚糖微球均匀分散在交联透明质酸钠凝胶中；组合物中阳离子修饰的交联葡聚糖的含氮量为0.5%～2.0%。

12.根据权利要求10或11所述的含有修饰的交联葡聚糖微球的医用组合物，其特征在于：组合物是治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁的组合物，组合物的剂型为注射剂。

13.一种修饰的交联葡聚糖微球的含氮量的检测方法，其特征在于所述修饰的交联葡聚糖微球是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交+ +联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-NH-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N H-(CH3)2取代；该检测方法适用于以交联葡聚糖微球作为原料，经阳离子修饰得到的微球中含氮量的检测；

含氮量的检测方法包括以下步骤：

首先检测阳离子修饰的交联葡聚糖微球的交联度X1和作为原料的交联葡聚糖微球的交联度X2；然后代入计算式（M葡+M交*X2）*[100/（ X1- X2）]=A；A+M修饰=B；含氮量=14/B*100%；

其中M葡是葡聚糖的相对原子质量，M交是使用的交联剂的相对原子质量，M修饰是修饰基团-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2或-CH2-CH2-N+H-(CH3)2的相对原子质量；

其中微球的交联度的检测方法如下：

用电子天平精密称取质量为m、单位g的受试微球，将其转移至容量为Va mL容量瓶中，用移液管量取高碘酸钠溶液并转移至上述容量瓶中，摇匀，容量瓶外周用锡纸包好避光，在2℃～10℃下进行氧化还原反应，高碘酸钠溶液的加入量保证能完全氧化交联葡聚糖微球；

反应过程中隔时间吸取进行氧化反应的容量瓶中的溶液至容量瓶中，用水稀释后摇匀，测定溶液的吸光值；

待吸光值达到稳定，认定反应结束，此时从容量瓶中吸取Vb mL上清液到锥形瓶中，向锥形瓶中加入Vb/10 mL乙二醇，摇匀，在室温、黑暗条件下静置后，向锥形瓶中加入2～3滴酚酞试剂，摇匀，然后用浓度为c、单位mol/L的氢氧化钠溶液进行滴定，记录下消耗的体积V1；

以相同体积Vb mL蒸馏水加Vb/10 mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V0；

代入交联度计算公式 交联度= X 100% 中计算得

到交联度。

说明书

修饰的交联葡聚糖微球及其制备方法以及含此微球的医用组

合物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种可降解的高分子微球，具体涉及一种修饰的交联葡聚糖微球及其制备方法以及含此微球的治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁的组合物。

背景技术

[0002] 膀胱输尿管反流（VUR）是指排尿时尿液从膀胱反流至输尿管和肾盂。反流性肾病（RN）是由于VUR和肾内反流（IRR）伴反复尿路感染，导致肾脏形成瘢痕、萎缩、肾功能异常的综合征，如不及时治疗和纠正可发展到慢性肾衰竭。VUR不仅发生在小儿，而且在反复UTI（尿路感染）基础上持续到成年，导致肾功能损害。

[0003] 大便失禁是指肛管括约肌失去对粪便及气体排出的控制能力，属于排便功能紊乱的一种。普通人群大便失禁的发生率为l％ ～2.2％。随着年龄的增加，大便失禁的发生率增加，65岁以上大便失禁的发病率为青年人的5倍。大便失禁易造成多种并发症（会阴部、骶尾部皮炎及压力性溃疡），不仅给患者带来了极大的痛苦，而且也给护理工作带来了诸多困难。治疗手段包括药物治疗和手术治疗，药物治疗目前主要采用的是洛哌丁胺和地芬诺酯，但效果并不显著，且伴有较大的副作用，如血压升高等；对于手术治疗，很多老年患者已经无法承受手术治疗，手术过程和术后恢复过程也会给患者带来极大的痛苦。

[0004] 压力性尿失禁（Stress Urinary Incontinence，SUI）是指喷嚏或咳嗽等腹压增高时出现不自主的尿液自尿道外口渗漏。目前，全球有2亿人遭受不同程度的尿失禁困扰，其中成人女性尿失禁发生率为25%～45％，7%左右有明显的尿失禁症状，其中约50%为压力性尿失禁。我国一项多区域调查表明，中国女性尿失禁发生率为30.9％，中国男性尿失禁发生率为3%～10％。到2030年，中国60岁及以上的老年人口将达到4.2亿左右。由于老年人中的尿失禁比例更高，因此受尿失禁困扰的人数将越来越多。严重的尿失禁可用手术治疗，但一般轻中度的尿失禁尚未有有效的治疗手段，只能被动使用成人用纸尿裤，患者的难言之隐痛苦不堪。

[0005] 交联葡聚糖微球的组合物凝胶注射于紧挨输尿管开口的膀胱粘膜下层，注射形成的凝胶组织在膀胱充盈和收缩过程中附着在远端输尿管，逐渐被机体自身结缔组织包围；再加上注入体内作为植入物后，交联葡聚糖微球能促进微球间成纤细胞和胶原蛋白的生成，从而稳定植入物的位置和体积，达到持久的填充效果。因此可以利用这一生理学性能来治疗膀胱输尿管返流、压力性尿失禁和大便失禁。

[0006] 关于交联葡聚糖的制备方法，中国专利文献CN  101182380（申请号 200610107398.4）公开了一种反相交联葡聚糖凝胶的合成方法，称取葡聚糖100g，氢氧化钠
10g溶解于75ml的蒸馏水中配置成葡聚糖碱液，称取聚醋酸乙烯脂25-60g，在搅拌条件下溶解于500-900ml的环氧氯丙烷中，配置成聚醋酸乙烯脂环氧氯丙烷溶液，在搅速为500rpm的条件下，将葡聚糖碱液倒入聚醋酸乙烯脂与环氧氯丙烷溶液中，进行交联反应，温度为50℃，反应5小时；反应产物依次用3倍量乙醇和蒸馏水洗涤3次，再经50℃烘干2小时，即可得产品。按照上述方法可制得不规则的交联葡聚糖凝胶，但不能获得交联葡聚糖微球，更不能得到修饰的交联葡聚糖微球。

[0007] 申请人于2017年4月14日递交了名称为《治疗膀胱输尿管返流、压力性尿失禁和大便失禁的组合物及其制备方法》和《交联葡聚糖微球的交联度检测方法》的发明专利申请，申请人现将进一步的研发成果申报本专利申请。

发明内容

[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种可生物降解的修饰的交联葡聚糖微球及其制备方法以及含此微球的治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁的组合物。实现本发明第一目的的技术方案是一种修饰的交联葡聚糖微球，是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-+ +CH2-NH-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-NH-(CH3)2取代。

[0009] 所述修饰的交联葡聚糖的含氮量为0.5%～2.0%。

[0010] 所述修饰的交联葡聚糖干燥微球的粒径为80μm～250μm。

[0011] 实现本发明第二目的的技术方案是一种修饰的交联葡聚糖微球的制备方法，所述修饰的交联葡聚糖微球是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代。

[0012] 第一种制备路线制备时先制得交联葡聚糖微球，然后将交联葡聚糖微球与阳离子修饰剂进行反应，得到修饰的交联葡聚糖微球，包括以下步骤：①将葡聚糖和还原剂溶解于氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相；所述还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、VC中的一种。

[0013] ②将表面活性剂溶解于有机溶剂中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中。

[0014] ③开启搅拌，将步骤①得到的水相加入到步骤②已加入有机相的反应容器中，进行乳化，机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在20℃～50℃。

[0015] ④向步骤③平衡的乳化体系中滴加交联剂，待交联剂滴加完成后，继续反应12h～36后反应完毕，交联反应温度为30℃～80℃。

[0016] ⑤交联反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球先用有机溶剂洗涤以除去微球表面残留的表面活性剂和交联剂，接着用乙醇洗涤微球以除去微球表面残留的有机溶剂，再接着用蒸馏水对微球进行洗涤，除去其他水溶性杂质；水洗后的微球脱水、干燥后得到干燥交联葡聚糖微球。

[0017] ⑥将步骤⑤得到的干燥交联葡聚糖微球加入氢氧化钠水溶液中，混匀；继续向氢氧化钠溶液中加入阳离子修饰剂，加毕在50℃～90℃下搅拌反应6～10h，得到阳离子修饰的交联葡聚糖微球；反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球洗涤、干燥。

[0018] 上述步骤①的葡聚糖碱性水溶液中葡聚糖的浓度为0.11g/mL～0.67g/mL，葡聚糖中的葡萄糖单体与还原剂的物质的量比为9～25:1；步骤②有机相中表面活性剂的浓度为0.01～0.1g/mL；步骤④的交联剂为环氧氯丙烷或1,4丁二醇二缩水甘油醚，交联剂与葡聚糖的质量比为1～8:10。

[0019] 上述步骤⑥中加入的阳离子修饰剂为2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二乙氨基溴乙烷盐酸盐、二乙氨基氯甲烷盐酸盐、二乙氨基溴甲烷盐酸盐、2-二羟乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二羟乙氨基溴乙烷盐酸盐中的一种。

[0020] 第二种制备路线制备时先制得阳离子修饰的葡聚糖，然后交联成球得到微球，包括以下步骤：①将葡聚糖溶解于氢氧化钠水溶液中，混匀；继续向氢氧化钠溶液中加入阳离子修饰剂，加毕在50℃～90℃下搅拌反应6～10h，反应完毕后，向反应后溶液中加入乙醇，析出沉淀，过滤得到的沉淀为阳离子修饰的葡聚糖。

[0021] ②将步骤①得到的阳离子修饰的葡聚糖、还原剂溶解于氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相；所述还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、VC中的一种。

[0022] ③将表面活性剂溶解于有机溶剂中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中；表面活性剂为聚乙二醇双硬脂酸酯、聚乙二醇双油酸酯、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。

[0023] ④开启搅拌，将步骤②得到的水相加入到步骤③已加入有机相的反应容器中，进行乳化，机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在20℃～50℃。

[0024] ⑤向步骤④平衡的乳化体系中滴加交联剂，此时开始进行交联反应，待交联剂滴加完成后，继续反应12h～36h后反应完毕，交联反应温度为30℃～80℃；交联剂为环氧氯丙烷或1,4丁二醇二缩水甘油醚，交联剂与葡聚糖的质量比为1～8:10。

[0025] ⑥步骤⑤交联反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的阳离子修饰的交联葡聚糖微球洗涤、干燥。

[0026] 上述步骤①中加入的阳离子修饰剂为2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二乙氨基溴乙烷盐酸盐、二乙氨基氯甲烷盐酸盐、二乙氨基溴甲烷盐酸盐、2-二羟乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二羟乙氨基溴乙烷盐酸盐中的一种。

[0027] 第三种制备路线制备时制备时采用一锅反应，交联成球和阳离子修饰同时进行，包括以下步骤：①将葡聚糖和还原剂溶解于氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相；所述还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、VC中的一种。

[0028] ②将表面活性剂溶解于有机溶剂中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中。

[0029] ③开启搅拌，将步骤①得到的水相加入到步骤②已加入有机相的反应容器中，进行乳化，机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在20℃～50℃。

[0030] ④向步骤③平衡的乳化体系中滴加交联剂，待交联剂滴加完成后，在30℃～80℃下先反应6～8小时，然后向反应体系中加入阳离子修饰剂，加毕在50℃～90℃下搅拌反应15～20h得到修饰的交联葡聚糖微球；阳离子修饰剂为2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二乙氨基溴乙烷盐酸盐、二乙氨基氯甲烷盐酸盐、二乙氨基溴甲烷盐酸盐、2-二羟乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二羟乙氨基溴乙烷盐酸盐中的一种。

[0031] ⑤交联、修饰反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球洗涤、干燥。

[0032] 实现本发明第三目的的技术方案是一种含有修饰的交联葡聚糖微球的医用组合物，按重量百分比该组合物由以下组分组成：修饰的交联葡聚糖微球4%～6 %，交联透明质酸钠1%～2 %，PBS缓冲液余量；其中的修饰的交联葡聚糖微球是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代。

[0033] 上述组合物中阳离子修饰的交联葡聚糖微球均匀分散在交联透明质酸钠凝胶中；组合物中阳离子修饰的交联葡聚糖的含氮量为0.5%～2.0%。

[0034] 上述组合物是治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁的组合物，组合物的剂型为注射剂。

[0035] 实现本发明第四目的的技术方案是一种修饰的交联葡聚糖微球的含氮量的检测方法，所述修饰的交联葡聚糖微球是微球状的、阳离子修饰的交联葡聚糖，所述的阳离子修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代；该检测方法适用于以交联葡聚糖微球作为原料，经阳离子修饰得到的微球中含氮量的检测；含氮量的检测方法包括以下步骤：
首先检测阳离子修饰的交联葡聚糖微球的交联度X1和作为原料的交联葡聚糖微球的交联度X2；然后代入计算式（M葡+M交*X2）*[100/（ X1- X2）]=A；A+M修饰=B；含氮量=14/B*100%；
其中M葡是葡聚糖的相对原子质量，M交是使用的交联剂的相对原子质量，M修饰是修饰基团-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2或-CH2-CH2-N+H-(CH3)2的相对原子质量。

[0036] 其中微球的交联度的检测方法如下。

[0037] 用电子天平精密称取质量为m、单位g的受试微球，将其转移至容量为Va mL容量瓶中，用移液管量取高碘酸钠溶液并转移至上述容量瓶中，摇匀，容量瓶外周用锡纸包好避光，在2℃～10℃下进行氧化还原反应，高碘酸钠溶液的加入量保证能完全氧化交联葡聚糖微球。

[0038] 反应过程中隔时间吸取进行氧化反应的容量瓶中的溶液至容量瓶中，用水稀释后摇匀，测定溶液的吸光值。

[0039] 待吸光值达到稳定，认定反应结束，此时从容量瓶中吸取Vb mL上清液到锥形瓶中，向锥形瓶中加入Vb/10 mL乙二醇，摇匀，在室温、黑暗条件下静置后，向锥形瓶中加入2～3滴酚酞试剂，摇匀，然后用浓度为c、单位mol/L的氢氧化钠溶液进行滴定，记录下消耗的体积V1。

[0040] 以相同体积Vb mL蒸馏水加Vb/10 mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V0。

[0041] 代入交联度计算公式 交联度= X100% 中计算得到交联度。

[0042] 本发明具有积极的效果：（1）本发明的修饰的交联葡聚糖微球为阳离子微球，由于化学结构中有阳离子修饰基团，提高了微球的抑菌率，也提高了微球和水的亲和性以及与生物体的结合率和粘附性。

[0043] （2）本发明制备修饰的交联葡聚糖微球的方法有三种，第一种方法是先制得交联葡聚糖微球，然后对交联葡聚糖微球进行修饰得到阳离子微球；第二种方法是先制得修饰的葡聚糖，然后交联成球得到阳离子微球；第三种方法是一锅反应，交联成球和修饰同时进行。上述三种制备方法的原料可控，得到的产物中无溶剂甲苯残留，产品的安全性高，可用于处方；显微照片显示修饰的交联葡聚糖用PBS缓冲溶液溶胀后为光滑圆润的球状，杂质含量低，具有良好的生物相容性。

[0044] （3）本发明的组合物是由作为填充剂的亲水性的阳离子修饰交联葡聚糖微球和作为载体的非动物源性的交联透明质酸钠组成的无免疫原性、无致敏风险、无细胞毒性、生物可相容性的无菌凝胶制剂。

[0045] 本发明的组合物以注射剂的形式注入体内相应位置后，可用于治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁。

[0046] 组合物中修饰的交联葡聚糖微球均匀分散在交联透明质酸钠凝胶中，交联透明质酸钠作为组合物的分散介质，并作为载体将修饰的交联葡聚糖微球输送至注射部位；随着交联透明质酸钠被组织吸收，修饰的交联葡聚糖微球在靶位逐渐被机体自身的结缔组织包围，并促进微球间成纤细胞和胶原蛋白的生成，从而稳定植入物的体积，达到持久的填充效果。

[0047] 以膀胱输尿管反流为例，膀胱输尿管反流及其症状病因是输尿管阻止尿液反流的瓣膜机械性损伤，此时需要一种物质充当填充剂，在注射部位增加组织厚度从而在肌肉正常收缩时帮助尿道完全关闭阻止反流。本发明的组合物注射后即能起到填充作用，消除膀胱输尿管反流症状。

[0048] （4）本发明的组合物中作为载体的交联透明质酸钠凝胶是一种聚合多糖，它注射在机体内后会在几个月到一年的时间内被机体吸收，填充剂阳离子修饰的交联葡聚糖干燥微球的大小为80μm～250μm，不会破裂，因此消除了迁移的风险，通过水解缓慢地生物降解。

附图说明

[0049] 图1为本发明的阳离子修饰的交联葡聚糖微球的化学结构示意式；图2a为实施例2制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球的显微照片，图2b为实施例2制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球溶胀后的显微照片；
图3为实施例2制备的修饰的交联葡聚糖微球溶胀后的粒度分布图；
图4为实施例2制备的修饰的交联葡聚糖微球中残留阳离子修饰剂的气相色谱图；
图5a为实施例3制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球的显微照片，图5b为实施例3制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球溶胀后的显微照片；
图6为实施例3制备的修饰的交联葡聚糖微球溶胀后的粒度分布图；
图7为实施例3制备的修饰的交联葡聚糖微球中残留阳离子修饰剂的气相色谱图；
图8a为实施例4制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球的显微照片，图8b为实施例4制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球溶胀后的显微照片；
图9为实施例4制备的修饰的交联葡聚糖微球溶胀后的粒度分布图；
图10为实施例4制备的修饰的交联葡聚糖微球中残留阳离子修饰剂的气相色谱图；
图11a为实施例5制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球的显微照片，图11b为实施例5制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球溶胀后的显微照片；
图12为实施例5制备的修饰的交联葡聚糖微球溶胀后的粒度分布图；
图13为实施例5制备的修饰的交联葡聚糖微球中残留阳离子修饰剂的气相色谱图；
图14a为实施例6制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球的显微照片，图14b为实施例6制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球溶胀后的显微照片；
图15为实施例6制备的修饰的交联葡聚糖微球溶胀后的粒度分布图；
图16为实施例6制备的修饰的交联葡聚糖微球中残留阳离子修饰剂的气相色谱图。

具体实施方式

[0050] （实施例1、修饰的交联葡聚糖微球）本发明的修饰的交联葡聚糖微球是干燥的、微球状的阳离子修饰的交联葡聚糖，所述+
的修饰的交联葡聚糖是指交联葡聚糖化学结构中的部分-OH的H被-CH2-CH2-NH-(C2H5)2取代或者被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代，从而得到阳离子修饰的微球。

[0051] 修饰的交联葡聚糖的化学结构示意式见图1，图1中交联葡聚糖的部分-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代，图1仅仅是示意取代基，并不作具体的修饰点位限定。如果取代基+ + +是-CH2-CH2-NH-(CH3)2，将图1中的-CH2-CH2-NH-(C2H5)2改为-CH2-CH2-NH-(CH3)2即可。

[0052] 交联葡聚糖中有多少-OH的H被取代基取代的程度，用最终产品的含氮量数值表现，含氮量越高，表示交联葡聚糖中被取代的少-OH的H越多；反之含氮量越低，表示交联葡聚糖中被取代的少-OH的H越少。

[0053] 含氮量采用凯氏定氮法测定。

[0054] 本发明的修饰的交联葡聚糖的含氮量为0.5%～2.0%。

[0055] 修饰的交联葡聚糖干燥微球的粒径为80μm～250μm。

[0056] 修饰的交联葡聚糖微球的制备方法有三种，第一种方法是先制得交联葡聚糖微球，然后对交联葡聚糖微球进行修饰得到阳离子微球；第二种方法是先制得修饰的葡聚糖，然后交联成球得到阳离子微球；第三种方法是一锅反应，交联成球和修饰同时进行。对于采用第一种方法制得的修饰的交联葡聚糖微球，含氮量还可以采用交联度差值法测定。

[0057] 所述的交联度差值法的检测依据是相比于未修饰的交联葡聚糖微球，修饰后的微球中增加了取代基团 -CH2-CH2-N+H-(C2H5)2或-CH2-CH2-N+H-(CH3)2。对于交联度检测方法而言，交联度的定义是微球中交联剂修饰部分的质量占整个微球质量的百分比，其中修饰部分质量包括交联修饰的葡聚糖质量、单取代修饰的葡聚糖质量和交联剂片段质量之和。而对于修饰的交联葡聚糖微球，在交联度检测时将阳离子修饰基团-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2或-CH2-CH2-N+H-(CH3)2也当做了单取代修饰部分，从而也贡献了部分交联度。将修饰的交联葡聚糖微球的交联度和原料交联葡聚糖微球的交联度分别检测出来，通过系列换算得到含氮量。

[0058] 具体的检测方法如下：先检测阳离子修饰的交联葡聚糖微球的交联度X1和交联葡聚糖微球的交联度X2；（M葡+M交*X2）*[100/（ X1- X2）]=A；A+M修饰=B；含氮量=14/B*100%。其中M葡是葡聚糖的相对原子质量，M交是使用的交联剂的相对原子质量，M修饰是修饰基团-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2或-CH2-CH2-N+H-(CH3)2的相对原子质量。

[0059] 其中微球的交联度检测方法如下：用电子天平精密称取质量为m、单位g的受试交联葡聚糖微球（修饰的或没有修饰的微球），将其转移至容量为Va mL容量瓶中，用移液管量取高碘酸钠溶液并转移至上述容量瓶中，摇匀，容量瓶外周用锡纸包好避光，在2℃～10℃下进行氧化还原反应；高碘酸钠溶液的加入量保证能完全氧化交联葡聚糖微球。高碘酸钠溶液的浓度为0.03mol/L～0.1 mol/L。

[0060] 反应过程中隔时间吸取进行氧化反应的容量瓶中的溶液至容量瓶中，用水稀释后摇匀，测定溶液的吸光值。

[0061] 待吸光值达到稳定，认定反应结束，此时从容量瓶中吸取Vb mL上清液到锥形瓶中，向锥形瓶中加入Vb/10 mL乙二醇，摇匀，在室温、黑暗条件下静置后，向锥形瓶中加入2～3滴酚酞试剂，摇匀，然后用浓度为c、单位mol/L的氢氧化钠溶液进行滴定，记录下消耗的体积V1。滴定用的氢氧化钠溶液的浓度为0.005 mol/L～0.1 mol/L。

[0062] 以相同体积Vb mL蒸馏水加Vb/10 mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V0。

[0063] 代入交联度计算公式 交联度=  X100% 中计算得到交联度。

[0064] 对于第一种方法制得的修饰的交联葡聚糖微球，含氮量可以采用两种方法测定，若两种方法测定出的含氮量误差在20%以内，认为两种方法的测量值均有效；对于只采用凯氏定氮法测量的第二种和第三种方法制备的微球，检测时设三个以上平行试验组。

[0065] （实施例2、修饰的交联葡聚糖微球的制备方法）本实施例制备的是葡聚糖的-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代的阳离子微球。

[0066] 本实施例的工艺路线是先制得交联葡聚糖微球，然后将交联葡聚糖微球与阳离子修饰剂进行反应，得到修饰的交联葡聚糖微球，即交联葡聚糖阳离子微球。

[0067] 本实施例的修饰的交联葡聚糖微球的制备方法具体包括以下步骤：①将葡聚糖、硼氢化钠溶解于3mol/L的氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相。葡聚糖碱性水溶液中葡聚糖的浓度为0.65g/mL，葡聚糖中的葡萄糖单体与硼氢化钠的物质的量之比为15:1。选择VE作为还原剂时，将VE溶解在步骤②的有机溶剂中。

[0068] 还原剂除了上述提及的硼氢化钠，还可以是亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、VC、VE中的一种，葡聚糖中的葡萄糖单体与还原剂的物质的量比为9～25:1。

[0069] ②将作为表面活性剂的聚乙二醇400双硬脂酸酯（PEG400DS）溶解于有机溶剂甲苯中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中。有机相中表面活性剂的浓度为0.07g/mL。

[0070] 除了上述提及的聚乙二醇双硬脂酸酯，表面活性剂还可以选择聚乙二醇双油酸酯（如PEG400DO）、脂肪醇聚氧乙烯醚（例如脂肪醇聚氧乙烯醚MOA-3）中的一种。

[0071] 有机溶剂除了甲苯，还可以选择液状的芳香烃（除甲苯外的）、脂肪烃、卤代脂肪烃、卤代芳香烃中的一种；具体的，例如可以是正辛烷、正壬烷、二氯甲烷、1,2-二氯（溴）乙烷、邻二氯苯中的一种。

[0072] ③开启搅拌，调节转速为380r/min（搅拌器变频调速300～2000rpm），将步骤①得到的水相加入到步骤②已加入有机相的反应容器中，水相和有机相的体积比为1:2，进行乳化，经30min～90min（本实施例中为45min）机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在20℃～50℃（本实施例中为40℃）。

[0073] ④向步骤③平衡的乳化体系中滴加交联剂环氧氯丙烷，控制滴加速度为1～10s/滴加入，此时开始进行交联反应，待交联剂滴加完成后，继续反应12h～36h（本实施例中为18h）后反应完毕，交联反应温度为30℃～80℃（本实施例中为50℃）。环氧氯丙烷与葡聚糖的质量比为1～8:10（本实施例中为4:10）。

[0074] ⑤步骤④交联反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球先用有机溶剂甲苯洗涤以除去微球表面残留的表面活性剂和交联剂，重复甲苯洗涤操作，直至经气相色谱检测微球表面残留的表面活性剂和交联剂量达到10ug/g以下。

[0075] 接着用95%乙醇洗涤微球以除去微球表面残留的甲苯，重复乙醇洗涤操作，直至经气相色谱检测微球表面甲苯残留量达到10ug/g以下。

[0076] 再接着用蒸馏水对微球进行洗涤，并调节蒸馏水和微球混合物料的pH值为6～7.5，重复水洗操作，除去其他水溶性杂质如未交联的葡聚糖。

[0077] 水洗后的微球先用95%乙醇脱水3～5次（95%乙醇的用量保证能浸没微球），再用无水乙醇继续脱水3～5次（无水乙醇的用量保证能浸没微球）；将脱水后的微球在60℃～100℃条件下干燥8～24h得到干燥交联葡聚糖微球。

[0078] ⑥将步骤⑤得到的5g干燥交联葡聚糖微球加入50ml的4 mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀；继续向氢氧化钠溶液中加入6.07g阳离子修饰剂2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐（CAS NO.869-24-9），加毕在65℃下搅拌反应8h，得到阳离子修饰的交联葡聚糖微球。

[0079] 除了上述使用的2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐，阳离子修饰剂还可以选择2-二乙氨基溴乙烷盐酸盐、二乙氨基氯甲烷盐酸盐、二乙氨基溴甲烷盐酸盐、2-二羟乙氨基氯乙烷盐酸盐、2-二羟乙氨基溴乙烷盐酸盐中的一种。

[0080] 若要制得被-CH2-CH2-N+H-(CH3)2取代的交联葡聚糖，将阳离子修饰剂选择2-二甲氨基氯乙烷盐酸盐、2-二甲氨基溴乙烷盐酸盐、二甲氨基氯甲烷盐酸盐、二甲氨基溴甲烷盐酸盐、2-二羟甲氨基氯乙烷盐酸盐、2-二羟甲氨基溴乙烷盐酸盐中的一种。

[0081] 反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球先用蒸馏水洗涤，并调节蒸馏水和微球混合物料的pH值为6～7.5，重复水洗操作，除去其他水溶性杂质。

[0082] 水洗后的微球先用95%乙醇脱水3～5次（95%乙醇的用量保证能浸没微球），再用无水乙醇继续脱水3～5次（无水乙醇的用量保证能浸没微球）；将脱水后的微球在60℃～100℃条件下干燥8～24h得到干燥、修饰的交联葡聚糖微球。

[0083] ⑦将步骤⑥得到的修饰的交联葡聚糖微球先经过孔径为250μm的筛网，取筛网下方的微球，再用孔径为80μm的筛网进行筛分，取筛网上方的微球，得到粒径为80μm～250μm的修饰交联葡聚糖干燥微球，优选经过筛分的微球用于配置组合物，筛分后干燥微球的显微照片见图2a。将该粒径范围的微球用PBS缓冲溶液溶胀后，溶胀微球的显微照片见图2b，溶胀后微球的粒度分布图见图3，溶胀微球的平均粒径为195.215μm。

[0084] 进一步，用气相色谱检测干燥微球中阳离子修饰剂的残留，见图4，图4为步骤⑥处理得到的干燥微球的气相色谱图，气相色谱图显示干燥微球中阳离子修饰剂未检出。

[0085] 采用凯氏定氮法检测，本实施例制得的修饰的交联葡聚糖微球的含氮量为0.96%。

[0086] 再采用交联度差值法测定含氮量，具体步骤如下：首先，分别检测步骤⑤得到的干燥交联葡聚糖微球的交联度和步骤⑥得到的修饰的交联葡聚糖微球的交联度。

[0087] 步骤⑤交联葡聚糖微球的交联度检测方法如下：用电子天平精密称取0.20006g的受试交联葡聚糖微球，将其转移至50mL容量瓶中，用移液管量取 50mM的高碘酸钠溶液50.00mL并转移至上述50mL容量瓶中，摇匀，容量瓶外周用锡纸包好避光，在4℃下进行氧化还原反应，反应过程中每隔24h充分振摇容量瓶一次。

[0088] 反应过程中每隔24h吸取0.1mL容量瓶中的溶液至100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，于223nm处测定溶液的吸光值。

[0089] 吸光值达到稳定后，从容量瓶中吸取20.00mL上清液到锥形瓶中，向锥形瓶中加入2mL乙二醇，摇匀，在室温、黑暗条件下静置 20min后，向锥形瓶中加入2～3滴酚酞试剂，摇匀，然后用0.01M的氢氧化钠溶液进行滴定，记录下消耗的体积V1为17.46mL。

[0090] 以相同体积20mL蒸馏水加2mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V0 为0.05ml。

[0091] 代入交联度计算公式：交联度=  X100%=64.8%。

[0092] 按照上述方法测得步骤⑥得到的修饰的交联葡聚糖微球的交联度为85.5%。

[0093] 按照实施例1的换算方法，含氮量=1.06%。两次检测结果的误差在15%以内。

[0094] 本实施例制得的修饰的交联葡聚糖微球纯度高，无免疫原性、无致敏风险；微球的球形状态好不破裂。

[0095] 上述制备过程所用的带搅拌装置的反应容器的结构参见申请号为2017200920968，专利名称为一种多功能复合搅拌反应器的中国专利文献。

[0096] 步骤⑦两步筛分所用的装置结构参见申请号为2017200921496，专利名称为一种用于制备微球的振荡筛的中国专利文献，震荡筛上的筛网根据筛分情况选择。

[0097] （实施例3、修饰的交联葡聚糖微球的制备方法）本实施例的修饰的交联葡聚糖微球的制备方法其余与实施例2相同，不同之处在于：
步骤⑥中，将步骤⑤得到的5g干燥交联葡聚糖微球加入50ml的4 mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀；继续向氢氧化钠溶液中加入10.6g阳离子修饰剂2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐（CAS NO.869-24-9），加毕在65℃下搅拌反应8h，得到阳离子修饰的交联葡聚糖微球。

[0098] 采用凯氏定氮法检测，本实施例制得的修饰的交联葡聚糖微球的含氮量为1.71%。

[0099] 本实施例的微球经两次筛分得到粒径为80μm～250μm的修饰交联葡聚糖干燥微球后，干燥微球的显微照片见图5a；将该粒径范围的微球用PBS缓冲溶液溶胀后，溶胀微球的显微照片见图5b，溶胀后微球的粒度分布图见图6，溶胀微球的平均粒径为348.465μm。

[0100] 进一步，用气相色谱检测干燥微球中阳离子修饰剂的残留，见图7，图7为步骤⑥处理得到的干燥微球的气相色谱图，气相色谱图显示干燥微球中阳离子修饰剂残留量6.6μg/g。

[0101] （实施例4、修饰的交联葡聚糖微球的制备方法）本实施例的修饰的交联葡聚糖微球的制备方法其余与实施例2相同，不同之处在于：
步骤⑥中，将步骤⑤得到的5g干燥交联葡聚糖微球加入50ml的4 mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀；继续向氢氧化钠溶液中加入5.03g阳离子修饰剂2-二甲氨基氯乙烷盐酸盐，加毕在65℃下搅拌反应8h，得到阳离子修饰的交联葡聚糖微球。

[0102] 采用凯氏定氮法检测，本实施例制得的修饰的交联葡聚糖微球的含氮量为0.64%。

[0103] 本实施例的微球经两次筛分得到粒径为80μm～250μm的修饰交联葡聚糖干燥微球后，干燥微球的显微照片见图8a；将该粒径范围的微球用PBS缓冲溶液溶胀后，溶胀微球的显微照片见图8b，溶胀后微球的粒度分布图见图9，溶胀微球的平均粒径为112.501μm。

[0104] 进一步，用气相色谱检测干燥微球中阳离子修饰剂的残留，见图10，图10为步骤⑥处理得到的干燥微球的气相色谱图，气相色谱图显示干燥微球中阳离子修饰剂残留量22μg/g。

[0105] （实施例5、修饰的交联葡聚糖微球的制备方法）本实施例制备的是葡聚糖的-OH的H被-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2取代的阳离子微球。

[0106] 本实施例的工艺路线是先制得阳离子修饰的葡聚糖，然后交联成球得到微球。

[0107] 本实施例的修饰的交联葡聚糖微球的制备方法具体包括以下步骤：①将20g干燥葡聚糖加入50ml的4 mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀；继续向氢氧化钠溶液中加入17g阳离子修饰剂2-二乙氨基溴乙烷盐酸盐，加毕在65℃下搅拌反应8h，反应完毕后，向反应后溶液中加入500mL95%乙醇，析出沉淀，过滤得到的沉淀为阳离子修饰的葡聚糖。

[0108] ②将步骤①得到的阳离子修饰的葡聚糖、作为还原剂的硼氢化钠溶解于3mol/L的氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相。葡聚糖碱性水溶液中葡聚糖的浓度为0.4g/mL，葡聚糖中的葡萄糖单体与硼氢化钠的物质的量之比为10:1。

[0109] ③将作为表面活性剂的聚乙二醇400双硬脂酸酯（PEG400DS）溶解于有机溶剂甲苯中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中。有机相中表面活性剂的浓度为0.07g/mL。

[0110] 除了上述提及的聚乙二醇双硬脂酸酯，表面活性剂还可以选择聚乙二醇双油酸酯（如PEG400DO）、脂肪醇聚氧乙烯醚（例如脂肪醇聚氧乙烯醚MOA-3）中的一种。

[0111] 有机溶剂除了甲苯，还可以选择液状的芳香烃（除甲苯外的）、脂肪烃、卤代脂肪烃、卤代芳香烃中的一种；具体的，例如可以是正辛烷、正壬烷、二氯甲烷、1,2-二氯（溴）乙烷、邻二氯苯中的一种。

[0112] ④开启搅拌，调节转速为380r/min（搅拌器变频调速300～2000rpm），将步骤②得到的水相加入到步骤③已加入有机相的反应容器中，水相和有机相的体积比为1:2，进行乳化，经30min～90min（本实施例中为45min）机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在20℃～50℃（本实施例中为40℃）。

[0113] ⑤向步骤④平衡的乳化体系中滴加交联剂环氧氯丙烷，控制滴加速度为1～10s/滴加入，此时开始进行交联反应，待交联剂滴加完成后，继续反应12h～36h（本实施例中为18h）后反应完毕，交联反应温度为30℃～80℃（本实施例中为50℃）。环氧氯丙烷与葡聚糖的质量比为1～8:10（本实施例中为4:10）。

[0114] ⑥步骤⑤交联反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球先用有机溶剂甲苯洗涤以除去微球表面残留的表面活性剂和交联剂，重复甲苯洗涤操作，直至经气相色谱检测微球表面残留的表面活性剂和交联剂量达到10ug/g以下。

[0115] 接着用95%乙醇洗涤微球以除去微球表面残留的甲苯，重复乙醇洗涤操作，直至经气相色谱检测微球表面甲苯残留量达到10ug/g以下。

[0116] 再接着用蒸馏水对微球进行洗涤，并调节蒸馏水和微球混合物料的pH值为6～7.5，重复水洗操作，除去其他水溶性杂质如未交联的葡聚糖。

[0117] 水洗后的微球先用95%乙醇脱水3～5次（95%乙醇的用量保证能浸没微球），再用无水乙醇继续脱水3～5次（无水乙醇的用量保证能浸没微球）；将脱水后的微球在60℃～100℃条件下干燥8～24h得到干燥、修饰的交联葡聚糖微球。

[0118] ⑦将步骤⑥得到的修饰的交联葡聚糖微球筛分，得到粒径为80μm～250μm的修饰交联葡聚糖干燥微球，筛分后干燥微球的显微照片见图11a，将该粒径范围的微球用PBS缓冲溶液溶胀后，溶胀微球的显微照片见图11b，溶胀后微球的粒度分布图见图12，溶胀微球的平均粒径为601.424μm。

[0119] 进一步，用气相色谱检测干燥微球中阳离子修饰剂的残留，见图13，图13为步骤⑥处理得到的干燥微球的气相色谱图，气相色谱图显示干燥微球中阳离子修饰剂残留量23μg/g。

[0120] 根据凯氏定氮法，本实施例制得的修饰的交联葡聚糖微球的含氮量为1.84%。

[0121] （实施例6、修饰的交联葡聚糖微球的制备方法）本实施例的工艺路线是一锅反应，交联成球和阳离子修饰同时进行。

[0122] 本实施例的修饰的交联葡聚糖微球的制备方法具体包括以下步骤：①将20g葡聚糖、作为还原剂的硼氢化钠溶解于30mL的8mol/L的氢氧化钠水溶液中，混匀得到葡聚糖碱性水溶液，作为水相。葡聚糖碱性水溶液中葡聚糖的浓度为0.65g/mL，葡聚糖中的葡萄糖单体与硼氢化钠的物质的量之比为15:1。

[0123] 还原剂除了上述提及的硼氢化钠，还可以是亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、VC、VE中的一种，葡聚糖中的葡萄糖单体与还原剂的物质的量比为9～25:1。

[0124] ②将作为表面活性剂的聚乙二醇400双硬脂酸酯（PEG400DS）溶解于有机溶剂甲苯中，得到含有表面活性剂的有机相，并将配好的有机相转移至带搅拌装置的反应容器中。有机相中表面活性剂的浓度为0.07g/mL。

[0125] 除了上述提及的聚乙二醇双硬脂酸酯，表面活性剂还可以选择聚乙二醇双油酸酯（如PEG400DO）、脂肪醇聚氧乙烯醚（例如脂肪醇聚氧乙烯醚MOA-3）中的一种。

[0126] 有机溶剂除了甲苯，还可以选择液状的芳香烃（除甲苯外的）、脂肪烃、卤代脂肪烃、卤代芳香烃中的一种；具体的，例如可以是正辛烷、正壬烷、二氯甲烷、1,2-二氯（溴）乙烷、邻二氯苯中的一种。

[0127] ③开启搅拌，调节转速为380r/min（搅拌器变频调速300～2000rpm），将步骤①得到的水相加入到步骤②已加入有机相的反应容器中，水相和有机相的体积比为1:2，进行乳化，经45min机械搅拌后形成平衡的w/o型乳化体系，乳化过程温度控制在40℃。

[0128] ④向步骤③平衡的乳化体系中滴加交联剂环氧氯丙烷，环氧氯丙烷与葡聚糖的质量比为1～8:10，控制滴加速度为1～10s/滴加入，此时开始进行交联反应，待交联剂滴加完成后，在30℃～80℃（本实施例中为50℃）下先反应7h；然后向反应体系中加入20g阳离子修饰剂2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐（CAS NO.869-24-9），加毕在65℃下搅拌反应17h，得到修饰的交联葡聚糖微球。

[0129] ⑤步骤④交联、修饰反应结束后，将反应容器中的物料全部倒出，过滤滤除反应液，收集得到的微球先用有机溶剂甲苯洗涤以除去微球表面残留的表面活性剂、交联剂和修饰剂，重复甲苯洗涤操作，直至经气相色谱检测微球表面残留的表面活性剂、交联剂和修饰剂量达到10ug/g以下。

[0130] 接着用95%乙醇洗涤微球以除去微球表面残留的甲苯，重复乙醇洗涤操作，直至经气相色谱检测微球表面甲苯残留量达到10ug/g以下。

[0131] 再接着用蒸馏水对微球进行洗涤，并调节蒸馏水和微球混合物料的pH值为6～7.5，重复水洗操作，除去其他水溶性杂质如未交联的葡聚糖。

[0132] 水洗后的微球先用95%乙醇脱水3～5次（95%乙醇的用量保证能浸没微球），再用无水乙醇继续脱水3～5次（无水乙醇的用量保证能浸没微球）；将脱水后的微球在60℃～100℃条件下干燥8～24h得到干燥、修饰的交联葡聚糖微球。

[0133] ⑥将步骤⑤得到的修饰的交联葡聚糖微球先经过孔径为250μm的筛网，取筛网下方的微球，再用孔径为80μm的筛网进行筛分，取筛网上方的微球，得到粒径为80μm～250μm的修饰交联葡聚糖干燥微球，筛分后干燥微球的显微照片见图14a，将该粒径范围的微球用PBS缓冲溶液溶胀后，溶胀微球的显微照片见图14b，溶胀后微球的粒度分布图见图15，溶胀微球的平均粒径为383.489μm。

[0134] 进一步，用气相色谱检测干燥微球中阳离子修饰剂的残留，见图16，图16为步骤⑥处理得到的干燥微球的气相色谱图,气相色谱图显示干燥微球中阳离子修饰剂残留量155μg/g。

[0135] 根据凯氏定氮法，本实施例制得的修饰的交联葡聚糖微球的含氮量为1.96%。

[0136] （实施例7、治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁的组合物）本实施例的治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁的组合物按重量百分比由以下组分组成：修饰的交联葡聚糖微球4%～6 %（本实施例中为4.5%），交联透明质酸钠1%～2 %（本实施例中为1.5%），PBS缓冲液余量；其中的PBS缓冲液根据药典配置。其中修饰的交联葡聚糖微球以干燥的微球计重量分数，交联透明质酸钠以交联透明质酸钠干粉计质量分数。

[0137] 交联透明质酸钠在PBS缓冲液中溶胀成凝胶，修饰的交联葡聚糖微球在PBS缓冲液中溶胀成凝胶微球，因此组合物的实际形态是交联葡聚糖凝胶微球均匀分散在交联透明质酸钠凝胶中。

[0138] 组合物配置使用的修饰的交联葡聚糖干燥微球的粒径为80μm～250μm。

[0139] 配置上述组合物使用的交联透明质酸钠干粉是先采用发明名称为《高质量交联透明质酸钠凝胶及其制备方法》的中国专利文献CN 103923328A（申请号 201410153564.9）所公开的方法制备得到交联透明质酸钠凝胶，然后将凝胶在低于30℃的条件下真空干燥得到干粉备用。

[0140] 组合物中使用的修饰的交联葡聚糖微球可选择实施例2至实施例6中任何一种路线制备，优选实施例2、3、4采用的制备路线；且组合物中使用的修饰的交联葡聚糖微球的含氮量在0.5%～2.0%，优选0.8%～1.2%。

[0141] 组合物的制备方法如下：称取按照实施例2至6之一的方法制备的修饰的交联葡聚糖干燥微球和交联透明质酸钠干粉，然后向修饰的交联葡聚糖干燥微球和交联透明质酸钠干粉中加入PBS缓冲液，修饰的交联葡聚糖干燥微球和交联透明质酸钠干粉溶胀完全后、混匀得到治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁的组合物组合物。组合物中交联葡聚糖凝胶微球均匀分散在交联透明质酸钠凝胶中。

[0142] 组合物的剂型为注射剂剂，本实施例配置每一支针剂使用50mg交联葡聚糖干燥微球、15mg交联透明质酸钠干粉和1mLPBS缓冲溶液。

[0143] 组合物以注射的方式使用以治疗膀胱输尿管返流、尿失禁和大便失禁。

[0144] 治疗膀胱输尿管返流和尿失禁时，将组合物注射于紧挨输尿管开口的膀胱粘膜下层，注射形成的凝胶组织在膀胱充盈和收缩的过程中附着在远端输尿管，交联葡聚糖凝胶微球逐渐被机体自身的结缔组织包围，从而达到最终的阻断效果。

[0145] 治疗大便失禁时，将组合物针剂注射于最接近肛管高压部位粘膜下层处，每次注射需在距离齿状线大约5mm处，分别在间隔相等的四处各打入一针，每针含1mL左右的组合物。通过注射组合物，可以增大最接近肛管处的粘膜下层，从而加强肠控能力。

[0146] （试验例1）组合物注入大鼠体内后的组织学反应试验
一、试验材料和方法
将24只重量为225g～275mg的大鼠分为2组，其中对照组8只，实验组16只。

[0147] 对于实验组的16只大鼠，在吸入麻醉状态下，将每只大鼠置于仰卧位进行皮肤消毒，然后在腹部的标记位置皮下注射0.35mL实施例1所述的组合物，每只大鼠仅接受一次注射。

[0148] 对于对照组的8只大鼠，在吸入麻醉状态下，将每只大鼠置于仰卧位进行皮肤消毒，然后在腹部的标记位置皮下注射0.35mL的PBS缓冲液。

[0149] 麻醉过量导致实验组4只大鼠及对照组2只大鼠死亡。

[0150] 在注射后满1个月、6个月和12个月，分批次、分别在放大镜下将试验组大鼠植入的填充物质（即注射的组合物，下称植入物）小心地切除，切除时不带有任何周边组织，一旦获取植入物，就将植入物周围10mm的组织切下来进行组织病理学检查。

[0151] 选取边缘组织是为了探究在植入部位及其周边部位发生的组织学反应，在切除植入物和周边组织后，我们将每只大鼠的腹部切开，仔细检查腹腔和腹腔器官（如肝脏、脾脏）以观察是否有任何宏观变化或者是否出现植入物迁移。

[0152] 二、组织病理学评价方法将切除得到的植入物和周边组织放入10%甲醛缓冲液中固定24小时，随后嵌入石蜡中做成4微米厚的切片，接着用苏木精-伊红（hematoxyline-cosin）染色剂对植入物和周边组织进行着色，采用单盲法，即不了解受试被注射何种植入物的情况下由一位泌尿病理学家对样本进行组织病理学分析。随后通过显微镜检查样本中炎症反应、纤维化及成纤细胞入侵植入物和相邻组织的程度。对纤维化、成纤细胞入侵和炎症反应按如下标准进行半定量分析：0级=无反应，1级=轻度反应，2级=中度反应，3级=中度反应。

[0153] 三、结果1、实验组注射后并未出现任何并发症，而且研究期间无一动物死亡（排除麻醉过量）。

[0154] 2、在实验组大鼠的注射部位能轻易触摸到植入的填充剂，并能感知其未发生远端迁移。

[0155] 3、实验组在注射处未出现诸如红斑或肿胀的过敏反应症状，各注射部位及其周围组织中未观察到肿瘤。

[0156] 4、实验组大鼠注入的填充物被很好地包裹住，且容易被切除下来。

[0157] 5、对于实验组大鼠，注射后第一个月，周边组织的平均纤维化程度为1.21±1.04，有轻度异物反应；注射后第六个月，周边组织的平均纤维化程度为1.15±0.54，有轻度异物反应；注射后第十二个月，周边组织的平均纤维化程度为0.68±0.41，肉芽炎症反应，炎症最轻，已被纤维化取代。与对照组存在统计意义上的差异。