一种增加间充质干细胞外泌体产生及分泌的方法

摘要

本发明公开了一种增加间充质干细胞胞外囊泡产生及分泌的方法。本发明提供的方法包括，为诱导间充质干细胞肌动蛋白解聚或抑制间充质干细胞肌动蛋白聚合，实现促进间充质干细胞分泌胞外囊泡。本发明的实验证明，通过3D(维)细胞培养条件的实施(悬滴、悬浮培养)，整合素(integrin)功能阻断(包括使用功能阻断抗体及RGD短肽)，肌动蛋白解聚剂或聚合抑制剂的使用，诱导细胞肌动蛋白(actin)解聚或抑制细胞肌动蛋白聚合，从而实现促进间充质干细胞分泌胞外囊泡。该方法简单，方便应用。

权利要求

1.一种促进细胞分泌胞外囊泡的方法，为诱导细胞肌动蛋白解聚或抑制细胞肌动蛋白聚合，实现促进细胞分泌胞外囊泡。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述诱导细胞肌动蛋白解聚的方法为悬滴培养细胞或悬浮培养细胞；

或所述抑制细胞肌动蛋白聚合的方法为用integrinβ1抑制剂抑制细胞肌动蛋白聚合；

或所述抑制细胞肌动蛋白聚合的方法为用肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂抑制细胞肌动蛋白聚合。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述用integrinβ1抑制剂抑制细胞肌动蛋白聚合为在含有所述integrinβ1抑制剂的体系中培养所述细胞；

所述用肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂抑制细胞肌动蛋白聚合为在含有所述肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂的培养基中培养所述细胞。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述integrinβ1抑制剂为integrinβ1功能阻断抗体或RGD短肽；

所述肌动蛋白聚合抑制剂为细胞松弛素Cytochalasin D。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述细胞为离体细胞；

所述离体细胞为离体干细胞；

或所述细胞为离体间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述integrinβ1抑制剂和所述间充质干细胞的配比为1μg：1万个；

或所述肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂和所述间充质干细胞的配比为32ng：100万个。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述悬滴培养间充质干细胞或悬浮培养间充质干细胞的时间为60小时；

所述在含有所述integrinβ1抑制剂的体系中培养所述间充质干细胞的时间为1.5小时；

所述在含有所述肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂的培养基中培养所述间充质干细胞的时间为8小时。

8.一种促进间充质干细胞分泌胞外囊泡的方法，为如下1)-3)中任一种：

1)权利要求2-7任一中的所述悬滴培养或悬浮培养间充质干细胞；

2)权利要求2-7任一中的所述用integrinβ1抑制剂抑制间充质干细胞肌动蛋白聚合；

3)权利要求2-7任一中的所述用肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂抑制间充质干细胞肌动蛋白聚合。

9.诱导间充质干细胞肌动蛋白解聚或抑制间充质干细胞肌动蛋白聚合在促进细胞分泌胞外囊泡中的应用；

或悬滴培养或悬浮培养在促进细胞分泌胞外囊泡中的应用；

或，integrinβ1抑制剂、肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂在促进细胞分泌胞外囊泡中的应用；

或一种促进细胞分泌胞外囊泡的试剂盒，包括悬滴培养试剂及设备、悬浮培养试剂及设备、integrinβ1抑制剂、肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂。

10.根据权利要求9所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述细胞为离体细胞；

所述离体细胞为离体干细胞；

或所述细胞为离体间充质干细胞。

说明书

一种增加间充质干细胞外泌体产生及分泌的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学应用领域，具体涉及增加间充质干细胞外泌体产生及分泌的方法。更具体地，涉及通过引起细胞肌动蛋白解聚增加间充质干细胞外泌体产生及分泌。

背景技术

[0002] 胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是指由脂质双层包裹形成的亚细胞结构。几乎所有的细胞都分泌胞外囊泡，包括间充质干细胞。间充质干细胞来源的胞外囊泡含有与母细胞相似的成分，如细胞因子、生长因子、脂类、mRNAs及调控型miRNAs等。他们主要参与细胞与细胞间的交流通讯及改变组织的微环境等，在免疫调控，组织损伤修复等方面起着不可低估的作用。研究认为，间充质干细胞对于多种疾病的治疗效果主要通过释放胞外囊泡实现的。另外，胞外囊泡具有脂质双层结构，容易穿透细胞膜，不易引起免疫反应，并且可防止内部RNA和蛋白质降解，有着更强的药物增强渗透滞留效应，是一种理想的潜在的药物天然载体。所以间充质干细胞来源的胞外囊泡作为无细胞药剂及天然载药系统在再生医学领域有着很大的发展前景。

[0003] 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)作为一种成体多能干细胞，具有多种组织来源，能够分化为多种细胞系并有强大的旁分泌因子效应。间充质干细胞具有免疫原性低，组织修复再生的高的优点；研究发现，间充质干细胞的治疗作用主要通过其旁分泌作用。间充质干细胞不仅能分泌一些可溶性生物活性因子，亦可分泌胞外微囊泡，促进血管再生，抑制细胞凋亡及纤维化，进而促进损伤组织修复再生。越来越多的研究表明，间充质干细胞来源的胞外囊泡在组织损伤修复和器官功能恢复过程中起着非常重要的作用；另外，胞外囊泡不含有DNA成分，避免了不同个体间使用胞外囊泡传递遗传信息的风险，较细胞移植更加安全。因此，胞外囊泡有望取代细胞治疗，成为一种安全有效的无细胞治疗药剂。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供一种促进细胞分泌胞外囊泡的方法。

[0005] 本发明提供的方法，为诱导细胞肌动蛋白解聚或抑制细胞肌动蛋白聚合，实现促进细胞分泌胞外囊泡。

[0006] 上述方法中，所述诱导细胞肌动蛋白解聚的方法为悬滴培养细胞或悬浮培养细胞；

[0007] 或所述抑制细胞肌动蛋白聚合的方法为用integrinβ1抑制剂抑制细胞肌动蛋白聚合；

[0008] 或所述抑制细胞肌动蛋白聚合的方法为用肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂抑制细胞肌动蛋白聚合。

[0009] 上述方法中，所述用integrinβ1抑制剂抑制细胞肌动蛋白聚合为在含有所述integrinβ1抑制剂的体系中培养所述细胞；

[0010] 所述用肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂抑制细胞肌动蛋白聚合为在含有所述肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂的培养基中培养所述细胞。

[0011] 上述方法中，所述integrinβ1抑制剂为integrinβ1功能阻断抗体或RGD短肽；

[0012] 所述肌动蛋白聚合抑制剂为细胞松弛素Cytochalasin D。

[0013] 上述方法中，所述细胞为离体细胞；

[0014] 所述离体细胞为离体干细胞；

[0015] 或所述细胞为离体间充质干细胞。

[0016] 上述方法中，所述integrinβ1抑制剂和所述间充质干细胞的配比为1μg：1万个；

[0017] 或所述肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂和所述间充质干细胞的配比为32ng：100万个。

[0018] 上述方法中，所述悬滴培养间充质干细胞或悬浮培养间充质干细胞的时间为60小时；

[0019] 所述在含有所述integrinβ1抑制剂的体系中培养所述间充质干细胞的时间为1.5小时；

[0020] 所述在含有所述肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂的培养基中培养所述间充质干细胞的时间为8小时。

[0021] 本发明另一个目的是提供一种促进间充质干细胞分泌胞外囊泡的方法。

[0022] 本发明提供的方法，为如下1)-3)中任一种：

[0023] 1)上述悬滴培养或悬浮培养间充质干细胞；

[0024] 2)上述用integrinβ1抑制剂抑制间充质干细胞肌动蛋白聚合；

[0025] 3)上述用肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂抑制间充质干细胞肌动蛋白聚合。

[0026] 诱导间充质干细胞肌动蛋白解聚或抑制间充质干细胞肌动蛋白聚合在促进细胞分泌胞外囊泡中的应用也是本发明保护的范围。

[0027] 或悬滴培养或悬浮培养在促进细胞分泌胞外囊泡中的应用也是本发明保护的范围。

[0028] 或，integrinβ1抑制剂、肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂在促进细胞分泌胞外囊泡中的应用也是本发明保护的范围。

[0029] 或一种促进细胞分泌胞外囊泡的试剂盒，包括悬滴培养试剂及设备、悬浮培养试剂及设备、integrinβ1抑制剂、肌动蛋白细胞骨架解聚剂或肌动蛋白细胞聚合骨架抑制剂。

[0030] 上述中，所述细胞为离体细胞；

[0031] 所述离体细胞为离体干细胞；

[0032] 或所述细胞为离体间充质干细胞。

[0033] 发明人发现肌动蛋白细胞骨架在胞外囊泡产生及释放中有着重要的调控作用，肌动蛋白聚合抑制胞外囊泡的释放，而肌动蛋白解聚或皮质肌动蛋白受到干扰或失稳将促进胞外囊泡的释放。Integrin(整合素)是一种跨膜受体，作为细胞外基质和细胞骨架的连接桥梁，一旦处于激活状态，与细胞外基质分子连接，就会诱导细胞内单体肌动蛋白的组装，从而形成聚合态肌动蛋白(F-actin)。

[0034] 本发明的实验证明，通过3D(维)细胞培养条件的实施(悬滴、悬浮培养)，整合素(integrin)功能阻断(包括使用功能阻断抗体及RGD短肽)，肌动蛋白解聚剂或聚合抑制剂的使用，诱导细胞肌动蛋白(actin)解聚或抑制细胞肌动蛋白聚合，从而实现促进间充质干细胞分泌胞外囊泡。该方法简单，方便应用，可以增加间充质干细胞胞外囊泡的产生量，用于组织损伤的治疗。

附图说明

[0035] 图1为在2D和3D培养条件下间充质干细胞肌动蛋白纤维束检测结果。

[0036] 图2为在2D和3D培养条件间充质干细胞上清液胞外囊泡的分泌量。

[0037] 图3为细胞骨架松弛素(Cytochalasin D)处理后间充质干细胞肌动蛋白聚合情况。

[0038] 图4为细胞骨架松弛素(Cytochalasin D)处理后间充质干细胞上清液胞外囊泡的分泌量。

[0039] 图5为integrinβ1功能阻断抗体处理后间充质干细胞肌动蛋白聚合情况。

[0040] 图6为integrinβ1功能阻断抗体处理后间充质干细胞表面胞外囊泡的分布情况。

具体实施方式

[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0043] 下述实施例中的细胞培养培养箱的条件为37℃、5％CO2。

[0044] 下面实施例的人间充质干细胞为如商品化人骨髓来源的间充质干细胞，Lonza，PT-2501；也可用胎盘来源的间充质干细胞，分离和培养方法见Li等，PLoS ONE2011；6:e20526。

[0045] 磷酸缓冲液(PBS，成分为：NaCl 80g，Na2HPO4·12H2O 32.3g,NaH2PO4·2H2O 4.5g,加双蒸水900mL,用HCl/NaOH调pH至7.0，最后定容为1000mL)中)

[0046] 含去除外泌体的血清培养基：DMEM基础培养基+10％去除外泌体的胎牛血清(FBS，FBS于4℃,100,000×g离心18小时去除外泌体)。

[0047] 实施例1、通过3D培养诱导细胞肌动蛋白(actin)解聚实现促进间充质干细胞分泌胞外囊泡

[0048] 本实施例通过间充质干细胞进行3D培养(悬滴、悬浮培养)后收集培养上清囊泡，并验证了相对于2D培养(普通细胞贴壁培养)，间充质干细胞3D培养上清的胞外囊泡数量显著增加，具体实验步骤如下：

[0049] 1、传代培养人间充质干细胞，培养至第5代，0.25％胰酶/EDTA(0.25g胰酶，0.02g EDTA溶解于100ml磷酸缓冲液消化细胞2-3分钟，1300rpm离心5分钟后弃掉上清。将细胞沉淀用含去除外泌体的血清培养基重悬，至细胞浓度为60万/ml，即得细胞悬液，备用。

[0050] 2、实验根据培养方式设置为3组，分别是传统2D培养组，悬滴培养组及悬浮培养组(均为3D培养)。每组细胞数保持一致，各500万/组。实验均使用Corning 15cm非贴壁(non-treated)培养皿。

[0051] 1)传统2D培养组

[0052] 采用15cm贴壁培养皿(Corning，treated)，加入30ml含200万细胞的上述1得到的细胞悬液，培养箱培养60小时。

[0053] 2)悬浮培养组

[0054] 首先，采用15cm非贴壁培养皿(Corning,non-treated)，加入30ml含500万细胞的上述1得到的细胞悬液，培养箱培养60小时。

[0055] 3)悬滴培养组

[0056] 将上述1得到的细胞悬液按35μl每滴，隔开适当距离依次滴于细胞培养皿皿盖上(盖内面)，然后轻轻翻转皿盖(使液滴下垂)，盖在盛有适量PBS的培养皿上(防止液滴干燥挥发)，置于培养箱内培养60小时。

[0057] 3、收集上述各组培养上清，分别进行梯度离心分离胞外囊泡，具体步骤如下：

[0058] 首先，来自各组不同培养条件下的间充质干细胞培养上清收集至50ml离心管，300×g离心10分钟以去除脱落的完整细胞，弃沉淀取上清；其后，上清继续2,000×g离心30分钟以去除细胞碎片，弃沉淀取上清；然后上清继续100,000×g离心2小时，获得胞外囊泡沉淀；PBS重悬再100,000×g离心2小时，重复PBS洗涤2次后获得各组纯化的胞外囊泡。

[0059] 4、检测

[0060] 1)将上述3得到的各组纯化的胞外囊泡用可控电阻式脉冲传感(TRPS)微囊泡定量技术检测总囊泡数及囊泡直径分布情况。

[0061] 由于2D和3D培养条件下的间充质干细胞的增殖速率不同，为标准化胞外囊泡以进行分析比较，在收集培养上清的同时，将不同培养条件下的间充质干细胞进行消化收集，并利用血球计数板进行细胞计数。将每组条件下梯度离心获得的纯化胞外囊泡按细胞数目比例用相应的PBS重悬为每组单位体积的细胞数相同，以比较单位体积相同细胞数下分泌的胞外囊泡数的异同。

[0062] 2)检测间充质干细胞肌动蛋白纤维束情况

[0063] a)将上述传统2D培养组和悬滴培养组培养60h得到的细胞悬液吸除培养上清，PBS洗2次后，加入4％多聚甲醛(4g多聚甲醛溶解于100ml PBS中)室温固定20分钟，PBS洗2次后加入0.1％Triton X-100(体积百分比，PBS配制)透膜2-5分钟，PBS洗2次。

[0064] b)3％BSA(牛血清白蛋白，PBS配制)室温封闭1小时，然后加入罗丹明-DNase I(Invitrogen,D12372)室温孵育2小时以标记细胞中的单体肌动蛋白G-actin,Alexa-Fluor 488-鬼比环肽(Sigma,P5282)室温孵育2小时以标记细胞中的多聚体肌动蛋白F-actin。

[0065] c)样品准备好后用荧光共聚焦显微镜(FV1000；Olympus；Tokyo,Japan)拍照。

[0066] 既往研究已证明，间充质干细胞在3D培养条件下(包括悬滴、悬浮培养)，其integrin的表达量减少，肌动蛋白纤维束(F-actin)的含量显著减少(见Wang等，STEM CELLS 2015；33:3315–3326；Zhou等，J.Cell.Mol.Med.2017；21：1073-1084)。

[0067] 本发明的研究结果显示，相比于传统的2D培养，3D培养(悬滴培养组)的间充质干细胞肌动蛋白纤维束显著减少(见图1)，培养上清检测到3-4倍多的胞外囊泡(图2)。

[0068] 实施例2、通过使用肌动蛋白细胞骨架解聚剂或聚合抑制剂干扰细胞肌动蛋白聚合成束实现促进间充质干细胞分泌胞外囊泡

[0069] 本实施例通过将间充质干细胞用含0.1％DMSO培养基和含细胞松弛素Cytochalasin D培养基培养后收集培养上清囊泡，并验证了相对于0.1％DMSO培养基对照组，细胞松弛素Cytochalasin D处理组的间充质干细胞培养上清总囊泡数显著增加，具体实验步骤如下：

[0070] 1、取第5代间充质干细胞按7,000细胞数/cm2种于Corning 15cm贴壁(treated)培养皿，加入30ml含去除外泌体的10％的血清培养基培养至80％密度。

[0071] 2、弃除培养基，PBS清洗2次，取2个培养皿设置2组：

[0072] 肌动蛋白细胞骨架聚合抑制剂组：培养皿中加入20ml含0.8μg/ml终浓度的细胞松弛素Cytochalasin D(EMD chemicals,250255)的培养基(DMEM+10％FBS；DMEM,Corning,10-014-CVR；FBS；BI,04-001-1A)，于37℃、5％CO2培养箱孵育培养8h。

[0073] 肌动蛋白聚合抑制剂和间充质干细胞的配比为32ng/100万细胞。

[0074] 对照组：培养皿中加入20ml含0.1％(体积百分比)DMSO的上述含去除外泌体的血清培养基，于37℃、5％CO2培养箱孵育培养8h。

[0075] 3、收集的各组培养上清进行梯度离心分离胞外囊泡，具体步骤如下：

[0076] 首先，来自各组不同培养条件下的间充质干细胞培养上清收集至50ml离心管，300×g离心10分钟以去除脱落的完整细胞，弃沉淀取上清；其后，上清继续2,000×g离心30分钟以去除细胞碎片，弃沉淀取上清；然后上清继续100,000×g离心2小时，获得胞外囊泡沉淀；PBS重悬再行100,000×g离心2小时，重复PBS洗涤2次后获得各组纯化的胞外囊泡。

[0077] 4、检测

[0078] 1)将上述3得到的各组不同培养条件下获得的胞外囊泡用可控电阻式脉冲传感(TRPS)微囊泡定量技术检测总囊泡数及囊泡直径分布情况。

[0079] 为标准化胞外囊泡以进行分析比较，在收集培养上清的同时，将不同培养条件下的间充质干细胞进行消化收集，并利用血球计数板进行细胞计数。将每组条件下梯度离心获得的纯化胞外囊泡按细胞数目比例用相应的PBS重悬为每组单位体积的细胞数相同，以比较单位体积相同细胞数下分泌的胞外囊泡数的异同。

[0080] 2)肌动蛋白细胞骨架解聚剂或聚合抑制剂干扰细胞肌动蛋白聚合成束情况的具体实施方法如下：

[0081] a)将上述2培养8h后细胞悬液去除上清，PBS洗2次后，加入4％多聚甲醛(4g多聚甲醛溶解于100mlPBS中)室温固定20分钟，PBS洗2次后加入0.1％Triton X-100(体积百分比，PBS配制)透膜2-5分钟，PBS洗2次。

[0082] b)3％BSA(牛血清白蛋白，PBS配制，w/v)室温封闭1小时，然后加入罗丹明-DNaseI(Invitrogen,D12372)室温孵育2小时标记细胞中的单体肌动蛋白G-actin,Alexa-Fluor 488-鬼比环肽(Sigma,P5282)室温孵育2小时标记细胞中的多聚体肌动蛋白F-actin。

[0083] c)样品准备好后用荧光共聚焦显微镜(FV1000；Olympus；Tokyo,Japan)拍照。

[0084] 结果如图3和图4所示，可以看出，相比于0.1％DMSO对照组，肌动蛋白细胞骨架聚合抑制剂细胞骨架松弛素(Cytochalasin D)抑制细胞肌动蛋白聚合(图3)，显著增加间充质干细胞培养上清胞外囊泡的分泌量(图4)。

[0085] 实施例3、通过阻断整合素(integrin)功能抑制细胞肌动蛋白(actin)聚合实现促进间充质干细胞分泌胞外囊泡

[0086] 本实施例通过将间充质干细胞用同型IgG对照(无阻断功能)和integrinβ1功能阻断抗体(anti-CD29)处理后，扫描电镜分析验证了相对于同型IgG对照组，integrinβ1功能阻断抗体(anti-CD29)组的间充质干细胞表面囊泡数显著增加，具体实验步骤如下：

[0087] 1、integrinβ1功能阻断抗体阻断处理

[0088] 取培养至第5代的间充质干细胞悬浮液500微升(10万细胞/毫升)，接种于盖玻片上，分为2组：

[0089] 实验组：再向盖玻片上加入10μg/ml终浓度integrinβ1功能阻断抗体(Millipore,MAB1987Z)；integrinβ1抑制剂和间充质干细胞的配比为1μg/万细胞；

[0090] 对照组：再向盖玻片上加入10μg/ml终浓度的同型IgG(EMD Millipore，CBL101)对照，IgG和间充质干细胞的配比为1μg/万细胞；

[0091] 各组于37℃、5％CO2培养箱孵育1.5小时。

[0092] 2、检测：分别用荧光共聚焦显微镜观察肌动蛋白聚合情况，用扫描电镜观察细胞表面囊泡情况，方法具体如下：

[0093] A、肌动蛋白聚合成束检测

[0094] 1)将上述1处理的各组培养1.5小时后细胞悬液去除上清，PBS洗2次后，加入4％多聚甲醛(4g多聚甲醛溶解于100mlPBS中)室温固定20分钟，PBS洗2次后加入0.1％Triton X-100(体积百分比，PBS配制)透膜2-5分钟，PBS洗2次。

[0095] 2)3％BSA(牛血清白蛋白，PBS配制，W/V)室温封闭1小时，然后加入罗丹明-DNaseI(Invitrogen,D12372)室温孵育2小时标记细胞中的单体肌动蛋白G-actin,Alexa-Fluor 488-鬼比环肽(Sigma,P5282)室温孵育2小时标记细胞中的多聚体肌动蛋白F-actin。

[0096] 3)样品准备好后用荧光共聚焦显微镜(FV1000；Olympus；Tokyo,Japan)拍照。

[0097] B、胞外囊泡检测

[0098] 1)将上述1处理的各组培养1.5小时后细胞悬液去除上清，PBS轻轻清洗2次，然后2.5％的戊二醛溶液(体积百分比，PBS配制)中4℃固定过夜。

[0099] 2)倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的PBS漂洗样品三次，每次15min；

[0100] 3)然后用1％的锇酸溶液(0.01g锇酸溶解于上述0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液)固定样品1-2h；

[0101] 4)倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；

[0102] 5)用梯度浓度(包括30％，50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇水溶液对样品依次进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理两次，每次20min。

[0103] 6)用乙醇与醋酸异戊酯的混合液(体积比为1:1)处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。

[0104] 7)临界点干燥。

[0105] 8)镀膜，然后将处理好的样品在日立SU-8010型场发射扫描电镜中观察拍照。

[0106] 上述结果如图5和图6所示，可以看出，相比于同型IgG对照组(无阻断功能)，integrinβ1功能阻断抗体减少细胞肌动蛋白聚合(图5)，显著增加间充质干细胞细胞表面胞外囊泡的数量(图6)。