极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因及其编码蛋白

摘要

本发明公开了极端耐干植物齿肋赤藓醛脱氢酶基因及其编码蛋白，所述基因ScALDH2B2，ScALDH10A1和ScALDH11A1的cDNA序列为SEQ ID NO：1-3所示，及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4-6；其基因编码区长度分别是ScALDH2B2为1584bp，ScALDH10A1为1521bp，ScALDH11A1为1491bp；ScALDH基因均为脱落酸依赖型，并且对干旱、高盐和低温三种非生物胁迫有响应，但响应模式不尽相同。通过转化原核细胞和拟南芥进行功能验证，结果显示：ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A基因系与野生型相比均出现抗旱和耐盐增强的特性。本发明为应用基因工程技术培育抗非生物胁迫农作物新品种提供重要基因资源。

权利要求

1.一种极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因，其特征在于所述基因分别命名为ScALDH2B2、ScALDH10A1和ScALDH11A1；

所述的醛脱氢酶基因ScALDH2B2，编码区长度为1584bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.1，编码527个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:4；

所述的醛脱氢酶基因ScALDH10A1，编码区长度为1521bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.2， 编码506个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:5；

所述的醛脱氢酶基因ScALDH11A1, 编码区长度为1491bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.3, 编码496个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:6。

2.根据权利要求1所述极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因的原核体系功能测试体，其特征在于将所示的核苷酸序列SEQ ID NO.1-3按照常规方法分别进行原核表达载体构建，转导至原核细胞DE3，分别得到三种具有抗逆功能的转ScALDH2B2、ScALDH10A1和ScALDH11A1的原核转化体。

3.根据权利要求1所述极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因的转基因植物功能测试体，其特征在于将所示的核苷酸序列SEQ ID NO.1-3按照常规方法分别进行植物表达载体的构建，转化至拟南芥植物中，分别得到三种具有抗逆功能的转ScALDH2B2、ScALDH10A1和ScALDH11A1的植物转化体。

4.根据权利要求1所述极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因，其特征在于所述重组蛋白ScALDH2B2、 ScALDH10A1和ScALDH11A1中ScALDH2B2和ScALDH11A1作为脂肪醛脱氢酶/还原酶家族的酶，ScALDH10A1作为芳香醛的脱氢酶/还原酶。

5.根据权利要求1所述的极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因在制备植物抗逆性育种和改良中的用途。

说明书

极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因及其编码蛋白

技术领域

[0001] 本发明涉及一种极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因及其编码蛋白，属于分子生物学技术领域。

背景技术

[0002] 水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，如何推进农业可持续发展已经成为现代植物育种工作急需解决的关键问题之一，因此提高植物的抗逆性一直是植物学家追求的目标。鉴定和研究植物抗逆基因是从分子水平上揭示植物抗逆机理的基础研究。植物的抗逆性属于数量性状，涉及大量基因的作用(Cushman and Bohnert 2000)。传统育种周期长；某些优良性状难以继承，为改良植物单一性状带来困难。在高盐、干旱、冷害、重金属、机械伤害、营养缺乏、病原体等多种胁迫条件下植物会产生过量ROS，对植物细胞造成毒害(Bartels and Sunkar 2005)。许多生物在长期进化过程中获得了一些适应极端环境条件的性状，能有效清除或抵御ROS毒害。醛脱氢酶活性的提高正是清除ROS的一种重要方式(Rodrigues et al.2006)。在拟南芥、葡萄等植物中已鉴定出很多抵御盐害和缺水等逆境上调表达的醛脱氢酶基因，证明醛脱氢酶基因在植物抵抗逆境胁迫中具有重要功能。因此，利用基因工程手段，可以将控制这些性状的基因导入植物，从而提高其抗逆性，达到常规育种难以达到的预期目标。

[0003] 在逆境条件下植物体内不断产生活性氧(ROS)导致氧化压力升高和细胞损伤。这个过程产生了超过200种的醛类，过量的醛类物质使植物机体代谢紊乱，使脂质过氧化，而ALDH是脂质过氧化过程中的“醛清道夫”(Wei et al,2009；Surendra et al,2013)。ALDH作为一种重要的功能蛋白，参与了植物生长发育、多种防御反应等不同重要生理过程，在抗旱、耐盐过程中起重要作用(Kotchoni and D.Bartels.2003)。但目前为止，只对少部分植物ALDH家族成员进行了研究(Chad et al.2013)。

[0004] 尽管从不同植物基因组中克隆得到了ALDH基因，但在蛋白结构和酶活性方面研究较少；对植物ALDH基因家族的生理功能研究主要集中在单、双子叶植物中ALDH家族基因的表达模式。对于许多植物ALDH基因的生理功能及生物学意义仍不清楚。齿肋赤藓广泛分布在古尔班通古特沙漠中，能适应沙漠中的水分迅速变化，是沙漠生物结皮中的优势种(Zhang et al,2007)。齿肋赤藓在极端干燥状态下，似一层灰黑色的“壳”覆盖在沙漠表面，呈休眠状态；一旦遇到降水，齿肋赤藓迅速通过再水化过程而“复原”呈鲜活的绿色，并恢复光合作用。本研究室对该种的分布(Zhang et al,2007)、生态作用(Zhang et al,2007；Zhang et al,2009)，复水过程中的形态(魏美丽等，2009)、超微结构(魏美丽等，2009；
Zheng et al,2011)、光合生理(Li et al,2010；Zheng et al，2011)等进行了研究，明确了该种耐脱水胁迫的形态结构及生理生化基础。本课题组通过对齿勒赤藓转录组的分析，进一步对齿肋赤藓抗逆基因进行初步挖掘。通过分析该基因结构、干旱响应模式以及不同逆境(盐、干旱、PEG)胁迫下基因抗逆性能，表明ScALDH21具有优异的抗旱、耐盐功能，暗示齿肋赤藓植物的抗逆机制与高等植物相似，预示醛脱氢酶(ALDH)家族具有优秀的分子抗逆育种基因资源。

[0005] 因此，解析ScALDHs家族基因的抗逆功能，对齿肋赤藓抗逆机制的研究，以及定向培育植物新品种具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的第一个目的在于，针对荒漠抗逆植物齿肋赤藓抗逆基因开发研究的局限性，提供3种来源于极端耐干的齿肋赤藓的醛脱氢酶基因，分别命名为ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-3所示。

[0007] 本发明的第二个目的在于，提供极端耐干齿勒赤藓植物3个ScALDH基因编码的醛脱氢酶蛋白ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示。

[0008] 本发明的第三个目的在于，所述3个齿勒赤藓ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1基因在培育抗逆生物，尤其是在抗非生物胁迫生物品种中的应用。

[0009] 本发明所述的一种极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因，所述基因分别命名为ScALDH2B2、ScALDH10A1和ScALDH11A1；

[0010] 所述的醛脱氢酶基因ScALDH2B2，编码区长度为1584bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.1，编码527个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:4；

[0011] 所述的醛脱氢酶基因ScALDH10A1，编码区长度为1521bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.2，编码506个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:5；

[0012] 所述的醛脱氢酶基因ScALDH11A1,编码区长度为1491bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.3,编码496个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:6。

[0013] 将所示的核苷酸序列SEQ ID NO.1-3按照常规方法分别进行原核表达载体构建，转导至原核细胞DE3，分别得到三种具有抗逆功能的转ScALDH2B2、ScALDH10A1和ScALDH11A1的原核转化体。

[0014] 将所示的核苷酸序列SEQ ID NO.1-3按照常规方法分别进行植物表达载体的构建，转化至拟南芥植物中，分别得到三种具有抗逆功能的转ScALDH2B2、ScALDH10A1和ScALDH11A1的植物转化体。

[0015] 所述重组蛋白ScALDH2B2、ScALDH10A1和ScALDH11A1中ScALDH2B2和ScALDH11A1作为脂肪醛脱氢酶/还原酶家族的酶，ScALDH10A1作为芳香醛的脱氢酶/还原酶。

[0016] 所述的极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因在制备植物抗逆性育种和改良中的用途。

[0017] 本发明所述的一种极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因及其编码蛋白，分别命名为ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1基因，编码区长度分别为1584bp，1521bp和1491bp，其编码区特征序列如SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸序列为：

[0018] SEQ ID NO.1:ScALDH2B2核苷酸序列

[0019] ATGGCGATGAGGGCGATGAGCAGGAAGCTCCTGTCGCGGGCGCTGCGACCTGCAGCGGTTAGTCGAAGCTACGGCGCGGCAGCGGCAGCCGCGGAGGAGCTGGGGAGCCCCATGAAGGCGCCAGTGGACGTGAAGCTCACCCAGCTGCTGATCGACGGGGAGTTCGTGGACGCCGCGTCGGGGAAGACGTTCGGGGTCATCGACCCCAGAAGCGAGCAAGTCATCGCGGAGGTCGCCGAGGGCGACGCGGAGGACGTCAACCGCGCGGTGCGCGCTGCAAGGAAGGCGTTCGACCATGGGCCGTGGCCGAAAATGCCCGCCCACAAGCGCGGCGAGATTCTCCTCAGGTATGCGGACTTGTTGGACCAGCACGCGGATGAGCTCGCGGCGCTGGAGACGATGGACTCTGGGAAGCCGTACGAGCAAGCGCGCTACGGGGAGGTGCCGATGGTGTCGCGGCAGTTCCGATACTACGCGGGGTGGGCGGACAAGATATACGGCACGACGGGGCCGTCTGATGGAAGCCACGCGGTGCACACGCTCCACGAGCCGTTGGGTGTGGTGGGGCAGATCATCCCCTGGAACTTCCCCATCGTCATGTACTGCTGGAAGGTGGCGCCTGCGCTGGCAACGGGGAACTGCGTCGTGCTAAAGACCGCGGAGCAGACGCCGCTGTCCGCCCTTCTGGCCGGGAAGCTGGCGTTGGAGGCCGGCATTCCCCCGGGCGTGCTCAACATCGTCTCCGGGTACGGCCCCACCGCGGGCGCCGCCATAGCCGAGCACATGGACGTCGACAAGGTCGCCTTCACGGGCTCCACCGAGGTCGGGAAGCTCGTCATGGGGGCGGCAGCGCGCAGCAACTTGAAGCCGGTGACGCTGGAGCTCGGAGGGAAGTCGCCCATGATCGTGTGCGAGGACGCGGACGTGGACGCTGCCGTGGAGCTGGCGCACTTCGCCATCTTCTTCAACCAGGGGCAGTGCTGCTGCGCGGGGTCGCGCACGTTTGTGCACGAGAGCATCTACGACGAGTTCGTGGAGAAGTCCAAGGCGCGCGCCCTGAAGCGCGTTGTGGGCGACCCTTTCAGGAGCGGCGTGGAGCAGGGCCCTCAGGTCAACAAGGAGCAGTTTAACAAGGTCCTCTCGTACATCGAGAGCGGGCAGCAGCAGGGCGCCAACCTCCTCACAGGTGGAGGTCGCTTGGGAAACGTAGGCTACTACATCAAGCCCACAATCTTCACTGACGTGAAAGACGGTATGAAGATCTTCGACGAGGAGATCTTCGGTCCTGTGCAGACGATTGCCAAGTTCAAAACCTTGGAAGATGTGGTGCAGCGGGCCAACAACACAGTGTACGGATTGGCAGCGGGCATTTTCAGCAACAACTTGAACACGGTGAACACGTTGAGCCGGGCACTGCGAGCGGGCACCGTGTGGGTGAACTGCTTCGACGTGTTCGACGCCACCATTCCGTTCGGGGGGTACAAGCAGAGCGGCATCGGGCGGGAGAAGGGCAAGGAGGCCCTGGACAACTACACGCAGGTGAAGGCGGTGGTGACGCCTATCCACAACCCCGCGTGGCTGTAA

[0020] SEQ ID NO.2:ScALDH10A1核苷酸序列

[0021] ATGGGTCTTCACGCTGAGATTGTGCCCCAGCGCCGCCTCTTCATCGACGGCGACTGGGTGCAGCCGCGCCAGGGCAAGCGCATTCCCATTGTCAATCCCACCACGGAGGAGAGCGTGGGGGACATTCCAGCTGCAACCTCGGAAGACGTCTATGCTGCAGTGAAGGCGGCTAAGGAAGCGTTACATCGCAACAATGGCAAGGACTGGTCTAAGGCCACTGGAAAGCACCGCGCAACCTACCTCCGAGCCATTGCCAAGAGGGTGGCTGAGAGAAAAGACGAGCTTGCGAAGCTGGAGTCCATCGACTGTGGCAAGCCTCTCGATGAAGCGGCGTGGGATATGGATGATGTATCAGGGTGTTTTGAGTACTACGCGGACCTGGCAGAGAAGTTGGATGAGAGGCAGTATGCTCCTCTGGAACTTCCCATGGAGCAATTCAAATGCAACATATTGCGACAGCCTGTTGGAGTTGTTGCTCTTATCACACCCTGGAATTACCCACTTTTGATGGCTACTTGGAAAGTTGCTCCAGCGCTTGCAGCTGGATGCACTGCCATTCTGAAACCATCTGAGATTGCCTCTGTCACTTGCTTGGAGTTGGCGAGTATTGCCAAAGAAGTTGGACTTCCGAACGGAGTCTTGAATGTGATCACTGGATATGGACAGGAAGCTGGTGCACCCTTGGCCTCACATCAGGATGTAAACAAGGTAGCTTTTACTGGAAGCACAGATACTGGCAGGTCTATCATGTCCGCGGCATCACAGCTCATCAAGCCAGTAACATTGGAATTGGGTGGAAAGAGCCCCATCATAGTTTTTGAAGATGCTGATATTGATAAAGCTGTTGAATGGGCTATGTTTGGAGCGTTCTGGACAAATGGCCAGATCTGCAGCGCCACATCACGACTATTATTGCAGGAGAGTATTGCTGATGAATTCTTAAAGAAGATAGCGTCATGGGCTTCATCCATCAAGGTCTCGGATCCACTGGAGAAAGACTGCCGATTGGGACCGCTTGTTAGTGAGAACCAGTACAAGAAGGTGAAAGAGTTCGTGAGAGTGGCGCAAGAAGAGGGAGCCACCCTTGTCTGCGGCGGCAAGAGACCAGATCATTTGTCAAAGGGGTACTTCCTTGCACCGACTGTTCTTTCCAACGTAAAACGCGACATGCAAATCTGGGCGGAGGAGGTGTTTGGTCCAGTCTTAGCTGTCTCCACTTTCAAAACGGAAGAGGAAGCGGTTCTAATGGCAAATGACACTCAGTATGGGCTTGGTGGTGCTGTTATCTCGAAGGATGACGAAAGGTGTAAGCGCGTCTCGGAGGCCTTAGAATGTGGCATTGTATGGATCAACTGTTCCCAACCCTGTTTCTGCCAAGCTCCCTGGGGTGGTAATAAGCGCAGTGGCTTTGGACGAGAGTTGGGAGAATGGGGTCTAGAGAACTATCTCACGGTGAAGCAGATCACCCGCTACATCTCAAACGATGATTGGGGCTGGTATCCCAAGCCCTCAAAACTGTAA

[0022] SEQ ID NO.3:ScALDH11A1核苷酸序列

[0023] ATGGCGGGCCAGGGGTTTTTCCAGGACATTCTGGACGGCGATGTGTTCAAGTTCTACGCCGATGGCGAGTGGAAGACGTCCACCTCCGGAAAGTCTGTCGGCATCACCAACCCTTCTACCTTGAAGACGGCATTCAAAGTGCAAGCGTGCACTCAGGATGAGGTGAACAAGGCCATTGAGAGTGCCAAGGTGGCGCAGAAGGCGTGGGCCAAGACGCCGCTGTGGAAGAGGGCGGAGGCGCTGCACCGGTTCGCAGGCATCCTCAAGGACCAGAAGAACGTCATCGCCGAGTGCCTAGTGAAGGAGGTCGCCAAGGCCCAGAAAGACTCGGTCACTGAGGTGGTGAGGTCTGGTGATTTGATCTCGTACTCAGCCGAGGAGGGCATCAGAATCATGGCCGAGGGCAAGTTCTTGGCCTCGGACAGCTTCCCAGGAAACGGCAGAAACAAGTACTGCCTTGCATCAAAGACTCCACTTGGGGTGGTTCTATGCATCCCTCCCTTCAACTACCCTGTGAACCTGGCTGTGTCCAAGATCGCTCCAGCTCTCATCACAGGAAACGCCGTCATTCTGAAGCCTCCCACTCAGGGTGCCGTGTCGGCCTTGCACATGGTACATTGCGCTCACATGGCTGGCTTTCCCAAGGGCTTGATTGCTGCCGTCACAGGGAAGGGCTCTGAAATCGGAGACCTGCTCACCATGCACCCGGGAATCGACTGCATCAGTTTCACAGGTGGTGACACGGGTATCGCGATTTCGAAGAAGGCAGGCATGATCCCACTTCAGATGGAGCTGGGAGGCAAAGATTGCTGCATTGTTCTGGAGGATGCGGACCTTGAACTTGCCGCCAACAACGTCATCAAGGGCGGATACTCCTACAGTGGGCAACGGTGCACGGCAATCAAGGTGATCTGTGTGATGGAGTCGGTGGCGGAGGAGCTGGTGAAGAACATTGTGGACAAGATGGCCAAGCTCAAGGTGGGAATGCCGGAGGACAACTGTGACATCACTCCCGTTGTCAGCCAGTCCTCCGCGAATTACATCCAGGGACTTGTGGAAGATGCCCAGGCCAAGGGCGCCAAGTTCCATCAGGAATGGAAGAGGGAGAACAACTTGATCCATCCACTTCTGATTGACAATGTGACCCCGGACATGCGAATTGCGTGGGAGGAGCCCTTTGGCCCTGTCATCCCCGTCATCCGCATCAAGACTGTGGAGGAGGGCATCCATCACTGCAATGCCAACAACTTCGCACTTCAGGGGTGCGTCTTCACAAAGGATATCAACAAGGCGATTTTGGTCAGTAACGCTATGGAGTCTGGAACTATTCAAATCAACGCCGCTCCTGCCCGAGGGCCTGACCATTTCCCGTTCCAGGGTCTGCGAGACAGTGGAATTGGCTCACAAGGAGTGACCAACAGTATTCTGATGATGACGAAGGTGAAGTCTACAGTGATCAACCTGCCTGTGGAATCATACACCATGGGTTAA

[0024] 所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列大小ScALDH2B2为527aa,ScALDH10A1为506aa，ScALDH11A1为496aa，对应蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4-6所述；

[0025] SEQ ID NO.4:ScALDH2B2蛋白的氨基酸序列

[0026] MAMRAMSRKLLSRALRPAAVSRSYGAAAAAAEELGSPMKAPVDVKLTQLLIDGEFVDAASGKTFGVIDPRSEQVIAEVAEGDAEDVNRAVRAARKAFDHGPWPKMPAHKRGEILLRYADLLDQHADELAALETMDSGKPYEQARYGEVPMVSRQFRYYAGWADKIYGTTGPSDGSHAVHTLHEPLGVVGQIIPWNFPIVMYCWKVAPALATGNCVVLKTAEQTPLSALLAGKLALEAGTPPGVLNIVSGYGPTAGAAIAEHMDVDKVAFTGSTEVGKLVMGAAARSNLKPVTLELGGKSPMIVCEDADVDAAVELAHFAIFFNQGQCCCAGSRTFVHESIYDEFVEKSKARALKRVVGDPFRSGVEQGPQVNKEQFNKVLSYIESGQQQGANLLTGGGRLGNVGYYIKPTIFTDVKDGMKIFDEEIFGPVQTIAKFKTLEDVVQRANNTVYGLAAGIFSNNLNTVNTLSRALRAGTVWVNCFDVFDATIPFGGYKQSGIGREKGKEALDNYTQVKAVVTPIHNPAWL[0027] SEQ ID NO.5:ScALDH10A1蛋白的氨基酸序列

[0028] MGLHAEIVPQRRLFIDGDWVQPRQGKRIPIVNPTTEESVGDIPAATSEDVYAAVKAAKEALHRNNGKDWSKATGKHRATYLRAIAKRVAERKDELAKLESIDCGKPLDEAAWDMDDVSGCFEYYADLAEKLDERQYAPLELPMEQFKCNILRQPVGVVALITPWNYPLLMATWKVAPALAAGCTAILKPSEIASVTCLELASIAKEVGLPNGVLNVITGYGQEAGAPLASHQDVNKVAFTGSTDTGRSIMSAASQLIKPVTLELGGKSPIIVFEDADIDKAVEWAMFGAFWTNGQICSATSRLLLQESIADEFLKKIASWASSIKVSDPLEKDCRLGPLVSENQYKKVKEFVRVAQEEGATLVCGGKRPDHLSKGYFLAPTVLSNVKRDMQIWAEEVFGPVLAVSTFKTEEEAVLMANDTQYGLGGAVISKDDERCKRVSEALECGIVWINCSQPCFCQAPWGGNKRSGFGRELGEWGLENYLTVKQITRYISNDDWGWYPKPSKL

[0029] SEQ ID NO.6:ScALDH11A1蛋白的氨基酸序列

[0030] MAGQGFFQDILDGDVFKFYADGEWKTSTSGKSVGITNPSTLKTAFKVQACTQDEVNKAIESAKVAQKAWAKTPLWKRAEALHRFAGILKDQKNVIAECLVKEVAKAQKDSVTEVVRSGDLISYSAEEGIRIMAEGKFLASDSFPGNGRNKYCLASKTPLGVVLCIPPFNYPVNLAVSKIAPALITGNAVILKPPTQGAVSALHMVHCAHMAGFPKGLIAAVTGKGSEIGDLLTMHPGIDCISFTGGDTGIAISKKAGMIPLQMELGGKDCCIVLEDADLELAANNVIKGGYSYSGQRCTAIKVICVMESVAEELVKNIVDKMAKLKVGMPEDNCDITPVVSQSSANYIQGLVEDAQAKGAKFHQEWKRENNLIHPLLIDNVTPDMRIAWEEPFGPVIPVIRIKTVEEGIHHCNANNFALQGCVFTKDINKAILVSNAMESGTIQINAAPARGPDHFPFQGLRDSGIGSQGVTNSILMMTKVKSTVINLPVESYTMG

[0031] 本发明所述的一种极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因及其编码蛋白，所述基因为ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1，具体方法为：

[0032] 取野外采集的齿勒赤藓的健壮植株，在实验室内用蒸馏水浸湿(但不浸没整个植株)，复苏24小时，然后冲洗干净，切除假根，去除植株表明多余水分，样品保存于-80℃冰箱，用于RNA提取。依据齿勒赤藓转录组数据库，通过RACE技术克隆ScALDH2，ScALDH10基因编码区，同源克隆ScALDH11基因；分别命名为ScALDH2B2，ScALDH10A1和ScALDH11A1；其基因编码区长度分别为1584bp，1521bp和1491bp；

[0033] 取复水24小时后的野外采集的齿勒赤藓植株，用100μM脱落酸(ABA)处理，利用荧光定量RT-PCR技术检测3个ALDH基因均对脱落酸有响应，属于ABA依赖型；

[0034] 取复水24小时后的野外采集的齿勒赤藓植株，用硅胶干燥、250mM NaCl、4℃低温处理，利用荧光定量RT-PCR技术检测得出3个ALDH基因对干旱、高盐和低温三种非生物胁迫有响应，但响应模式不尽相同。

[0035] 本发明所述的一种极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因及其编码蛋白，ScALDH2B2，ScALDH10A1和ScALDH11A1的基因分别构建至原核表达载体pET26，转化原核细胞DE3，用原核表达体系证明所述3个醛脱氢酶基因具有抗旱耐盐功能。

[0036] 本发明所述的一种极端耐干齿肋赤藓醛脱氢酶基因及其编码蛋白，三个蛋白ScALDH2B2为527aa,ScALDH10A1为506aa，ScALDH11A1为496aa，经过原核表达纯化，所述重组蛋白底物酶活实验证明ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1作为脂肪醛脱氢酶/还原酶家族的酶，ScALDH10A1还可为芳香醛的脱氢酶/还原酶。

[0037] 所述的转ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1基因的拟南芥功能与受体植物相比，其抗旱耐盐性能提高。

[0038] 本发明首次克隆了极端耐干齿勒赤藓醛脱氢酶家族基因ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1三个基因，这三个基因的表达都可以被ABA、干旱、高盐和低温诱导，但它们的酶学底物存在异同。当它们在原核系统和拟南芥中大量表达时，可以特异性地增强转化体的抗旱耐盐功能。因此，这三个基因将具有极大的潜力应用于培育具有抗非生物胁迫的转基因作物中，从而提高农作物的产量。

[0039] 本发明的实施例部分，阐述了ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1三个基因的克隆、功能验证和应用研究过程以及该基因的特点。

附图说明

[0040] 图1为本发明齿肋赤藓总RNA(a)、齿肋赤藓醛脱氢酶基因RACE-PCR(b)及全长ORF克隆图(c)，Lane M,DL2000marker；Lane1,2,6ScALDH2；Lane 3,4,7ScALDH10；Lane 8,ScALDH11。

[0041] 图2为本发明齿肋赤藓醛脱氢酶与几种不同物种来源的ALDH蛋白同源比较，其中：At：拟南芥；Zm：玉米；Hv：大麦；Os：水稻；Pp：小立碗藓；Cr：莱茵衣藻；EH：盐芥；Sp：菠菜；Sl：
番茄；Md：苹果；Sc：齿肋赤藓。

[0042] 图3为本发明齿肋赤藓在脱落酸ABA、硅胶干燥、250mM NaCl、4℃低温处理0h,0.5h,2h,6h,12h,24h条件下，3个齿肋赤藓ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1基因转录水平响应图。

[0043] 图4为本发明甘露醇和高盐对pET-ScALDH/DE3生长的影响，其中(a)500mM甘露醇胁迫培养；(b)500mM NaCl胁迫培养。

[0044] 图5为本发明ScALDH比酶活分析(底物：己醛、辛醛、反式己烯醛、己醛和壬醛)。

[0045] 图6为本发明转ScALDH拟南芥载体构建及转基因株鉴定，其中(a)pCAMBIA1301-ScALDH/DH5α菌液PCR鉴定，(b)双酶切鉴定pCAMBIA1301-ScALDH质粒，(c)T0转基因拟南芥潮霉素筛选(箭头和圆圈分别指示转化株的真叶和根)，(d)转基因株基因组PCR和(e)RT-PCR鉴定；泳道M,DL2000marker；泳道1,4为pCAMBIA1301-ScALDH2B2；泳道2,5为pCAMBIA1301-ScALDH10A1；泳道为3,6pCAMBIA1301-ScALDH11A1；泳道7为pCAMBIA1301；泳道8-10为ScALDH2B2转化株；泳道11-13为ScALDH10A1转化株；泳道14-16为ScALDH11A1转化株；泳道17为野生型拟南芥对照。

[0046] 图7为本发明转ScALDH基因拟南芥2个株系在含0(a)、150mM NaCl(b)和200mM甘露醇(c)的1/2MS培养基表型图，WT+A2,转ScALDH2B2株；WT+A10,转ScALDH10A1株；WT+A11,转ScALDH1A1株；WT,野生型。

[0047] 图8为本发明土培条件下400mM甘露醇胁迫转基因拟南芥表型图，A2,转ScALDH2B2株；A10,转ScALDH10A1株；A11,转ScALDH1A1株；WT,野生型对照。

具体实施方式

[0048] 下面的实施案例中将本发明做进一步的阐述，但本发明不限于此。

[0049] 下列实施案例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规实验操作进行，如《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW,Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)所述的方法进行，或按照制造厂商所建议的条件。

[0050] 实施例1

[0051] 齿肋赤藓中3个基因ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1的克隆和序列分析：

[0052] 1.1齿肋赤藓RNA提取及引物设计：利用齿肋赤藓转录组数据库中的醛脱氢酶EST序列信息，对靶定基因序列(ScALDH2B2，ScALDH10A1，ScALDH11A1)在NCBI中比对搜索，结合NCBI和文献中提供的ALDH基因ORF，推测ORF缺失方向及缺失片段大小(缺失片段信息见1)；

[0053] ScALDH家族基因引物设计：根据齿肋赤藓转录组中获得的醛脱氢酶基因序列信息，用引物设计软件Primer Primier5.0分别设计ScALDH11A1基因的ORF引物，ScALDH2B2和ScALDH10A1的5'引物(各两条)引物来获得全序列，引物序列如下(表1)：

[0054] 表1齿肋赤藓醛脱氢酶基因克隆所用引物列表

[0055]

[0056] 注：N表示不需要RACE克隆，其基因具备完整ORF。

[0057] 齿肋赤藓RNA提取：采集的齿肋赤藓材料给予充足的水分使样品保持鲜活状态，洗净沙土，并用蒸馏水冲洗，吸干表面水分，液氮速冻，保存于温度-80℃待用；RNA提取用的研钵、烧杯、量筒、三角瓶等玻璃器皿用温度180℃高温灭菌6h，所用的枪头，EP管和PCR管均为无RNA酶产品，取出0.05g样品，经液氮研磨后，加入适量提取液，操作步骤按照说明书进行(OMEGA，货号为R6827)；

[0058] 提取的RNA经过凝胶电泳初步判断RNA的完整性，同时用核酸定量仪NanoDrop 2000(Thermo)检测RNA的纯度和含量，当OD260/OD280＝2.0±1，OD260/OD230>2.0时，RNA样品用于后续的反转录；

[0059] 齿肋赤藓cDNA合成(用于全长ORF克隆)：用1μg总RNA进行反转录，温度37℃反转录45min；温度85℃，5s；温度4℃，∞，反应体系如下(PrimerScript RT-PCR,TAKARA)：

[0060]

[0061]

[0062] 齿肋赤藓5'和3'RACE cDNA合成(用于克隆ORF缺失基因)：5'和3'RACE cDNA第一链的合成方法和步骤参照产品说明书(Clontech,货号为PT4096)进行；cDNA产物于温度-20℃保存备用；

[0063] 1.2目的片段克隆及序列分析：

[0064] 普通RT-PCR及RACE PCR扩增方法分别参照TAKARA的PrimerScript RT-PCR说明书和SMARTer RACE cDNA Amplification kit说明书进行；琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收预期大小的PCR产物；对产物进行纯化后，连接至PMD19-T载体上(按照说明书方法操作)；转化大肠杆菌DH5α感受态，通过蓝白斑和Amp抗生素LB固体平板筛选阳性克隆；通过液体LB+Amp培养基活化阳性单克隆，提取质粒，进行质粒PCR鉴定，PCR体系如下：

[0065]

[0066] PCR反应条件为温度94℃预变性4min；温度94℃30s，温度58℃30s，温度72℃90s，共运行30个循环；最后72℃延伸10min；对PCR鉴定为阳性的质粒，送至北京华大公司测序，同时把相应的菌液保存至含50％无菌甘油的LB+Amp液体培养基中，液氮速冻后，存于-80℃冰箱。根据获得的完整ORF序列信息，设计引物，并通过RT-PCR技术扩增出基因的全长(如图1所示)，测序结果分析表明：ScALDH2B2(Unigene 80258)ORF为1584bp，ScALDH10A1为
1521bp，ScALDH11A1为1491bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-3所示；

[0067] SEQ ID NO.1:ScALDH2B2核苷酸序列

[0068] ATGGCGATGAGGGCGATGAGCAGGAAGCTCCTGTCGCGGGCGCTGCGACCTGCAGCGGTTAGTCGAAGCTACGGCGCGGCAGCGGCAGCCGCGGAGGAGCTGGGGAGCCCCATGAAGGCGCCAGTGGACGTGAAGCTCACCCAGCTGCTGATCGACGGGGAGTTCGTGGACGCCGCGTCGGGGAAGACGTTCGGGGTCATCGACCCCAGAAGCGAGCAAGTCATCGCGGAGGTCGCCGAGGGCGACGCGGAGGACGTCAACCGCGCGGTGCGCGCTGCAAGGAAGGCGTTCGACCATGGGCCGTGGCCGAAAATGCCCGCCCACAAGCGCGGCGAGATTCTCCTCAGGTATGCGGACTTGTTGGACCAGCACGCGGATGAGCTCGCGGCGCTGGAGACGATGGACTCTGGGAAGCCGTACGAGCAAGCGCGCTACGGGGAGGTGCCGATGGTGTCGCGGCAGTTCCGATACTACGCGGGGTGGGCGGACAAGATATACGGCACGACGGGGCCGTCTGATGGAAGCCACGCGGTGCACACGCTCCACGAGCCGTTGGGTGTGGTGGGGCAGATCATCCCCTGGAACTTCCCCATCGTCATGTACTGCTGGAAGGTGGCGCCTGCGCTGGCAACGGGGAACTGCGTCGTGCTAAAGACCGCGGAGCAGACGCCGCTGTCCGCCCTTCTGGCCGGGAAGCTGGCGTTGGAGGCCGGCATTCCCCCGGGCGTGCTCAACATCGTCTCCGGGTACGGCCCCACCGCGGGCGCCGCCATAGCCGAGCACATGGACGTCGACAAGGTCGCCTTCACGGGCTCCACCGAGGTCGGGAAGCTCGTCATGGGGGCGGCAGCGCGCAGCAACTTGAAGCCGGTGACGCTGGAGCTCGGAGGGAAGTCGCCCATGATCGTGTGCGAGGACGCGGACGTGGACGCTGCCGTGGAGCTGGCGCACTTCGCCATCTTCTTCAACCAGGGGCAGTGCTGCTGCGCGGGGTCGCGCACGTTTGTGCACGAGAGCATCTACGACGAGTTCGTGGAGAAGTCCAAGGCGCGCGCCCTGAAGCGCGTTGTGGGCGACCCTTTCAGGAGCGGCGTGGAGCAGGGCCCTCAGGTCAACAAGGAGCAGTTTAACAAGGTCCTCTCGTACATCGAGAGCGGGCAGCAGCAGGGCGCCAACCTCCTCACAGGTGGAGGTCGCTTGGGAAACGTAGGCTACTACATCAAGCCCACAATCTTCACTGACGTGAAAGACGGTATGAAGATCTTCGACGAGGAGATCTTCGGTCCTGTGCAGACGATTGCCAAGTTCAAAACCTTGGAAGATGTGGTGCAGCGGGCCAACAACACAGTGTACGGATTGGCAGCGGGCATTTTCAGCAACAACTTGAACACGGTGAACACGTTGAGCCGGGCACTGCGAGCGGGCACCGTGTGGGTGAACTGCTTCGACGTGTTCGACGCCACCATTCCGTTCGGGGGGTACAAGCAGAGCGGCATCGGGCGGGAGAAGGGCAAGGAGGCCCTGGACAACTACACGCAGGTGAAGGCGGTGGTGACGCCTATCCACAACCCCGCGTGGCTGTAA

[0069] SEQ ID NO.2:ScALDH10A1核苷酸序列

[0070] ATGGGTCTTCACGCTGAGATTGTGCCCCAGCGCCGCCTCTTCATCGACGGCGACTGGGTGCAGCCGCGCCAGGGCAAGCGCATTCCCATTGTCAATCCCACCACGGAGGAGAGCGTGGGGGACATTCCAGCTGCAACCTCGGAAGACGTCTATGCTGCAGTGAAGGCGGCTAAGGAAGCGTTACATCGCAACAATGGCAAGGACTGGTCTAAGGCCACTGGAAAGCACCGCGCAACCTACCTCCGAGCCATTGCCAAGAGGGTGGCTGAGAGAAAAGACGAGCTTGCGAAGCTGGAGTCCATCGACTGTGGCAAGCCTCTCGATGAAGCGGCGTGGGATATGGATGATGTATCAGGGTGTTTTGAGTACTACGCGGACCTGGCAGAGAAGTTGGATGAGAGGCAGTATGCTCCTCTGGAACTTCCCATGGAGCAATTCAAATGCAACATATTGCGACAGCCTGTTGGAGTTGTTGCTCTTATCACACCCTGGAATTACCCACTTTTGATGGCTACTTGGAAAGTTGCTCCAGCGCTTGCAGCTGGATGCACTGCCATTCTGAAACCATCTGAGATTGCCTCTGTCACTTGCTTGGAGTTGGCGAGTATTGCCAAAGAAGTTGGACTTCCGAACGGAGTCTTGAATGTGATCACTGGATATGGACAGGAAGCTGGTGCACCCTTGGCCTCACATCAGGATGTAAACAAGGTAGCTTTTACTGGAAGCACAGATACTGGCAGGTCTATCATGTCCGCGGCATCACAGCTCATCAAGCCAGTAACATTGGAATTGGGTGGAAAGAGCCCCATCATAGTTTTTGAAGATGCTGATATTGATAAAGCTGTTGAATGGGCTATGTTTGGAGCGTTCTGGACAAATGGCCAGATCTGCAGCGCCACATCACGACTATTATTGCAGGAGAGTATTGCTGATGAATTCTTAAAGAAGATAGCGTCATGGGCTTCATCCATCAAGGTCTCGGATCCACTGGAGAAAGACTGCCGATTGGGACCGCTTGTTAGTGAGAACCAGTACAAGAAGGTGAAAGAGTTCGTGAGAGTGGCGCAAGAAGAGGGAGCCACCCTTGTCTGCGGCGGCAAGAGACCAGATCATTTGTCAAAGGGGTACTTCCTTGCACCGACTGTTCTTTCCAACGTAAAACGCGACATGCAAATCTGGGCGGAGGAGGTGTTTGGTCCAGTCTTAGCTGTCTCCACTTTCAAAACGGAAGAGGAAGCGGTTCTAATGGCAAATGACACTCAGTATGGGCTTGGTGGTGCTGTTATCTCGAAGGATGACGAAAGGTGTAAGCGCGTCTCGGAGGCCTTAGAATGTGGCATTGTATGGATCAACTGTTCCCAACCCTGTTTCTGCCAAGCTCCCTGGGGTGGTAATAAGCGCAGTGGCTTTGGACGAGAGTTGGGAGAATGGGGTCTAGAGAACTATCTCACGGTGAAGCAGATCACCCGCTACATCTCAAACGATGATTGGGGCTGGTATCCCAAGCCCTCAAAACTGTAA

[0071] SEQ ID NO.3:ScALDH11A1核苷酸序列

[0072] ATGGCGGGCCAGGGGTTTTTCCAGGACATTCTGGACGGCGATGTGTTCAAGTTCTACGCCGATGGCGAGTGGAAGACGTCCACCTCCGGAAAGTCTGTCGGCATCACCAACCCTTCTACCTTGAAGACGGCATTCAAAGTGCAAGCGTGCACTCAGGATGAGGTGAACAAGGCCATTGAGAGTGCCAAGGTGGCGCAGAAGGCGTGGGCCAAGACGCCGCTGTGGAAGAGGGCGGAGGCGCTGCACCGGTTCGCAGGCATCCTCAAGGACCAGAAGAACGTCATCGCCGAGTGCCTAGTGAAGGAGGTCGCCAAGGCCCAGAAAGACTCGGTCACTGAGGTGGTGAGGTCTGGTGATTTGATCTCGTACTCAGCCGAGGAGGGCATCAGAATCATGGCCGAGGGCAAGTTCTTGGCCTCGGACAGCTTCCCAGGAAACGGCAGAAACAAGTACTGCCTTGCATCAAAGACTCCACTTGGGGTGGTTCTATGCATCCCTCCCTTCAACTACCCTGTGAACCTGGCTGTGTCCAAGATCGCTCCAGCTCTCATCACAGGAAACGCCGTCATTCTGAAGCCTCCCACTCAGGGTGCCGTGTCGGCCTTGCACATGGTACATTGCGCTCACATGGCTGGCTTTCCCAAGGGCTTGATTGCTGCCGTCACAGGGAAGGGCTCTGAAATCGGAGACCTGCTCACCATGCACCCGGGAATCGACTGCATCAGTTTCACAGGTGGTGACACGGGTATCGCGATTTCGAAGAAGGCAGGCATGATCCCACTTCAGATGGAGCTGGGAGGCAAAGATTGCTGCATTGTTCTGGAGGATGCGGACCTTGAACTTGCCGCCAACAACGTCATCAAGGGCGGATACTCCTACAGTGGGCAACGGTGCACGGCAATCAAGGTGATCTGTGTGATGGAGTCGGTGGCGGAGGAGCTGGTGAAGAACATTGTGGACAAGATGGCCAAGCTCAAGGTGGGAATGCCGGAGGACAACTGTGACATCACTCCCGTTGTCAGCCAGTCCTCCGCGAATTACATCCAGGGACTTGTGGAAGATGCCCAGGCCAAGGGCGCCAAGTTCCATCAGGAATGGAAGAGGGAGAACAACTTGATCCATCCACTTCTGATTGACAATGTGACCCCGGACATGCGAATTGCGTGGGAGGAGCCCTTTGGCCCTGTCATCCCCGTCATCCGCATCAAGACTGTGGAGGAGGGCATCCATCACTGCAATGCCAACAACTTCGCACTTCAGGGGTGCGTCTTCACAAAGGATATCAACAAGGCGATTTTGGTCAGTAACGCTATGGAGTCTGGAACTATTCAAATCAACGCCGCTCCTGCCCGAGGGCCTGACCATTTCCCGTTCCAGGGTCTGCGAGACAGTGGAATTGGCTCACAAGGAGTGACCAACAGTATTCTGATGATGACGAAGGTGAAGTCTACAGTGATCAACCTGCCTGTGGAATCATACACCATGGGTTAA

[0073] 其氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示；

[0074] SEQ ID NO.4:ScALDH2B2蛋白的氨基酸序列

[0075] MAMRAMSRKLLSRALRPAAVSRSYGAAAAAAEELGSPMKAPVDVKLTQLLIDGEFVDAASGKTFGVIDPRSEQVIAEVAEGDAEDVNRAVRAARKAFDHGPWPKMPAHKRGEILLRYADLLDQHADELAALETMDSGKPYEQARYGEVPMVSRQFRYYAGWADKIYGTTGPSDGSHAVHTLHEPLGVVGQIIPWNFPIVMYCWKVAPALATGNCVVLKTAEQTPLSALLAGKLALEAGTPPGVLNIVSGYGPTAGAAIAEHMDVDKVAFTGSTEVGKLVMGAAARSNLKPVTLELGGKSPMIVCEDADVDAAVELAHFAIFFNQGQCCCAGSRTFVHESIYDEFVEKSKARALKRVVGDPFRSGVEQGPQVNKEQFNKVLSYIESGQQQGANLLTGGGRLGNVGYYIKPTIFTDVKDGMKIFDEEIFGPVQTIAKFKTLEDVVQRANNTVYGLAAGIFSNNLNTVNTLSRALRAGTVWVNCFDVFDATIPFGGYKQSGIGREKGKEALDNYTQVKAVVTPIHNPAWL[0076] SEQ ID NO.5:ScALDH10A1蛋白的氨基酸序列

[0077] MGLHAEIVPQRRLFIDGDWVQPRQGKRIPIVNPTTEESVGDIPAATSEDVYAAVKAAKEALHRNNGKDWSKATGKHRATYLRAIAKRVAERKDELAKLESIDCGKPLDEAAWDMDDVSGCFEYYADLAEKLDERQYAPLELPMEQFKCNILRQPVGVVALITPWNYPLLMATWKVAPALAAGCTAILKPSEIASVTCLELASIAKEVGLPNGVLNVITGYGQEAGAPLASHQDVNKVAFTGSTDTGRSIMSAASQLIKPVTLELGGKSPIIVFEDADIDKAVEWAMFGAFWTNGQICSATSRLLLQESIADEFLKKIASWASSIKVSDPLEKDCRLGPLVSENQYKKVKEFVRVAQEEGATLVCGGKRPDHLSKGYFLAPTVLSNVKRDMQIWAEEVFGPVLAVSTFKTEEEAVLMANDTQYGLGGAVISKDDERCKRVSEALECGIVWINCSQPCFCQAPWGGNKRSGFGRELGEWGLENYLTVKQITRYISNDDWGWYPKPSKL

[0078] SEQ ID NO.6:ScALDH11A1蛋白的氨基酸序列

[0079] MAGQGFFQDILDGDVFKFYADGEWKTSTSGKSVGITNPSTLKTAFKVQACTQDEVNKAIESAKVAQKAWAKTPLWKRAEALHRFAGILKDQKNVIAECLVKEVAKAQKDSVTEVVRSGDLISYSAEEGIRIMAEGKFLASDSFPGNGRNKYCLASKTPLGVVLCIPPFNYPVNLAVSKIAPALITGNAVILKPPTQGAVSALHMVHCAHMAGFPKGLIAAVTGKGSEIGDLLTMHPGIDCISFTGGDTGIAISKKAGMIPLQMELGGKDCCIVLEDADLELAANNVIKGGYSYSGQRCTAIKVICVMESVAEELVKNIVDKMAKLKVGMPEDNCDITPVVSQSSANYIQGLVEDAQAKGAKFHQEWKRENNLIHPLLIDNVTPDMRIAWEEPFGPVIPVIRIKTVEEGIHHCNANNFALQGCVFTKDINKAILVSNAMESGTIQINAAPARGPDHFPFQGLRDSGIGSQGVTNSILMMTKVKSTVINLPVESYTMG

[0080] 对测序序列进行生物信息分析。所用软件为：DNAMAN和PrimierPrimer 5.0进行序列校对拼接，获得全长cDNA序列；NCBI/Blast、NCBI/ORF finder评估基因ORF；EBI多序列在线比对程序ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)和MEGA6进行多序列比对分析。所用数据库为：GenBank序列数据库(GenBank+EMBL+DDBJ+PDBsequences)进行蛋白家族校对。结果表明(如图2所示)：多数齿肋赤藓ScALDH与同是苔藓植物的小立碗藓ALDH亲缘关系最近，苔藓间的亲缘关系相对其他植物较近，与它们分歧源自于一个共同祖先的事实相符。

[0081] 实施例2

[0082] 3个ALDH家族基因表达模式分析：

[0083] 在室温条件下(25±2℃)，齿肋赤藓结皮经过完全复水(24h)后，分离齿肋赤藓配子体，洗净，用ddH2O冲洗3-4遍后；吸取表层水分，进行非生物胁迫和ABA胁迫后取样；取样时，去除假根，保留绿色的茎叶体(约1cm)用于提取RNA，样品存于温度-80℃冰箱保存备用；

[0084] 干旱处理：0.5g完全水合的苔藓均匀置于培养皿，放入硅胶密闭容器中，10min,0.5h,2h,6h,12h和24h分别取样；

[0085] 盐处理：0.5g完全水合的苔藓均匀置于250mM NaCl预处理的滤纸上，放入盛有250mMNaCl溶液的平皿中(苔藓配子体不能浸没，且处理期间保持滤纸浸入溶液)，0h,0.5h,
2h,6h,12h和24h分别取样；

[0086] 冷处理：0.5g完全水合的苔藓均匀置于平皿中，放入温度4℃层析柜中，0h，10min，0.5h，2h，6h和12h分别取样；

[0087] ABA处理：0.5g完全水合的苔藓均匀置于100μM ABA预处理的滤纸上，放入盛100μM ABA溶液的平皿中(苔藓配子体不能浸没，且处理期间保持滤纸浸入溶液)，0h，0.5h，2h，6h，12h和24h分别取样；

[0088] 总RNA提取：

[0089] 总RNA的提取用RNAiso reagent试剂(TAKARA公司，大连)，具体步骤按照说明书步骤进行；经过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性，核酸分析仪(Nanodrop 2000,Thermo公司)分析总RNA的纯度和浓度。完整性和纯度较好的总RNA样品可用于下游反转录实验；

[0090] 植物RNA反转录成cDNA釆用TaKaRa公司的反转录试剂盒；齿肋赤藓cDNA合成：总RNA用1μg进行反转录，反应体系如下(PrimerScript RT-PCR,TAKARA)：

[0091]

[0092] 反转录条件：温度37℃，30min；温度85℃，5s；温度4℃，∞；

[0093] 引物设计：

[0094] 采用Primer 5.0软件进行引物设计，扩增片段长度在100-300bp之间，退火温度在60±2℃，遵循RT-qPCR引物设计一般原则。本实验室筛选出α-tublin基因为齿肋赤藓最适内参基因，通过qPCR溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳判断引物的特异性，标准曲线判断引物的扩增效率和确定引物的退火温度，所用qPCR引物序列如下(表2)；

[0095] 表2齿肋赤藓醛脱氢酶家族基因定量引物序列

[0096]

[0097] 实时定量RT-PCR分析：

[0098] 实时定量RT-PCR采用TaKaRa公司的SYBR Premix ExTaqTMII(perfect Real Time)试剂盒。实验步骤按试剂盒说明书进行，qPCR体系为20μL，进行3次重复；CFX96实时荧光定量仪(Bio-Rad,USA)进行PCR扩增；PCR程序为：温度95℃，30s；温度95℃，5s；温度60℃，30s循环40次；随后加入溶解曲线分析：温度65℃-95℃(30s逐步升至95℃，每0.5℃收集一次荧光信号)；用荧光定量仪自带分析软件处理以上荧光定量数据，按照Normalized Expression(ΔΔCT)方法进行计算，以完全复水样品为对照，用内参基因α-tublin表达校准后计算处理后不同时间点的ScALDHs基因相对表达量，用Sigmaplot 10.0软件作图；

[0099] 在冷胁迫下(4℃)，ScALDH10A1上调表达，均在冷胁迫0.5h和24h有表达量的累积高峰，其表达量为对照的10倍左右；ScALDH2B2在冷胁迫0.5h左右快速上调响应，表达量为对照的5倍左右，随后表达量降低；在冷胁迫中ScALDH11A1响应很弱(图3)；在盐胁迫下，ScALDH11A1表达量是对照的5倍左右(图3)；在干旱胁迫下，ScALDH2B2其表达量为对照的6倍以上；ScALDH2B2在胁迫12h响应，较滞后；其余基因均有较弱的上调表达(图3)；ABA对植物抵御非生物胁迫至关重要，在激素ABA处理下，ScALDH11A1上调响应ABA诱导，表达量为对照的4倍以上，以上结果表明ALDH基因调控路径存在差异(图3)。

[0100] 实施例3

[0101] 原核表达ScALDH及其对大肠杆菌抗旱耐盐功能的影响：

[0102] 载体构建及转化：

[0103] 根据前期获得的醛脱氢酶基因ORF全长(ScALDH2B2,ScALDH7B1,ScALDH10A1,ScALDH11A1,ScALDH21A1)设计带酶切位点的引物，上游引物考虑正确读码框，下游引物去掉终止密码子，使其与His标签融合；引物序列如下(表3)：

[0104] 表3齿肋赤藓醛脱氢酶基因原核表达引物

[0105]

[0106] 注：下划线部分为限制性内切酶位点序列。

[0107] 以前期保存的带目的基因测序正确的克隆菌株为模版进行PCR扩增，扩增产物连接至pMD18-T载体，随机挑取阳性克隆测序；通过双酶切测序正确的目的基因片段和PET26b(+)质粒，回收酶切产物；通过T4DNA连接酶连接目的片段和载体，获得融合原核表达载体；转化至DH5α感受态后，挑取阳性克隆进行测序，然后对测序正确的质粒采用热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得带有醛脱氢酶基因的原核融合表达菌株；

[0108] ScALDH基因对大肠杆菌抗逆性的影响：

[0109] 挑取带有醛脱氢酶基因的原核融合表达菌株单克隆加至5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，温度37℃过夜振荡培养后提取质粒，菌液PCR检出阳性克隆；按1:100比例稀释接菌至新鲜LB培养基中，温度37℃振荡培养至OD600为0.6左右，加入1mM IPTG诱导目的蛋白表达，继续振荡培养2.5h；取1mL菌液，12000rpm离心5min，弃上清后用30μL新鲜配制的电泳上样缓冲液重悬菌体，煮沸10min，12000rpm离心10min，取20μL上清进行SDS-PAGE电泳，验证3个ScALDH基因在原核细胞中成功表达的蛋白条带；

[0110] 从温度-80℃冰箱取出冻存的醛脱氢酶原核表达菌株，在固体LB+Kan平板中画线接种，温度37℃培养过夜；挑取单菌落接种至LB+Kan液体培养基中震荡过夜培养，按1:100接种至新鲜LB+Kan液体培养基中，温度37℃震荡活化培养3h至OD600＝0.6-0.8，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)继续诱导培养2.5h；

[0111] 固体培养基中胁迫：经过梯度稀释后取5μL菌液，分别点板于非胁迫和胁迫培养基中(NaCl盐胁迫，甘露醇旱胁迫)，温度37℃培养，观察菌斑大小，实验重复3次；

[0112] 采用渗透胁迫和盐胁迫的方法，通过检测大肠杆菌菌落数和菌斑大小来判断ScALDH基因对大肠杆菌抗逆性的影响，如图4所示，在含500mM甘露醇和NaCl的LB培养基上，可以看出分别在稀释10-3和10-4倍的条件下对照pET26/DE3仅见零星菌斑，但表达醛脱氢酶基因的大肠杆菌仍可见明显菌落；这说明原核表达醛脱氢酶可以提高大肠杆菌抗渗透胁迫和耐盐能力。但不同醛脱氢酶的改善效果明显不同。

[0113] 实施例4

[0114] ScALDH家族蛋白纯化及酶活分析：

[0115] ScALDH蛋白粗酶液制备：

[0116] 为了获得具有蛋白活性，且保证蛋白产量，经优化后的ScALDH-His蛋白表达条件为：在温度18℃过夜培养菌株(1:100接菌)后，按照1:50接菌活化菌株至OD600为诱导起始菌浓度为OD600＝0.6，IPTG浓度为0.25mM条件下，温度18℃诱导培养15h(OD600值1.3左右)；温度4℃，5000rpm离心15min收集菌体；用磷酸缓冲液PBS重悬菌体(250mL菌液的菌体用10mLPBS重悬)；菌置于冰上，超声波破壁(超声3s,间隔3s)30min，保持低温条件(冰水混合温度，阻止菌液发热)；温度4℃，13000rpm离心，收集上清，即为初酶液，通过SDS-PAGE电泳判断粗酶液中的目的蛋白表达量；

[0117] ScALDH蛋白粗酶液纯化：

[0118] GE公司的Ni SepharoseTM 6Fast Flow蛋白纯化介质保存在20％乙醇中，混匀后，直接取用1.0mL的至2mL离心管中，500×g离心5min；弃上清，加入2mL去离子水，轻柔震荡混匀后，离心；弃上清，加入2mL结合缓冲液，混匀后，离心。弃上清，加入1mL结合缓冲液，混匀后转移至蛋白纯化柱中；

[0119] 用5-10倍柱体积PBS溶液平衡柱子，粗蛋白样品加入处理好的镍柱中，蛋白过柱纯化在温度4℃层析柜中进行，样品柱子在多功能旋转摇床(360°)中充分混匀填料和蛋白(约4h或过夜)；待填料和蛋白充分结合，并自然沉降后，用10倍柱体积的不同浓度梯度咪唑的PBS洗脱杂蛋白(咪唑浓度梯度：20Mm，60mM，80mM，100mM，150mM，200mM)，分别收集流出液用于后续SDS-PAGE检测和确定目的蛋白的洗脱浓度；最后用含250mM的PBS溶液清洗填料中的残余蛋白，填料柱的再生方法按照说明书进行(用5倍体积的去离子水洗涤，再用5倍体积的洗脱缓冲液洗涤，最后用10倍体积的结合缓冲液洗涤)；

[0120] 对SDS-PAGE检测含有目的蛋白的流出液，将进行后续蛋白浓缩和缓冲液置换步骤，方法一：将10mL含目的蛋白的纯化溶液装入处理好的透析袋，固定悬于装有500mL Tris.Cl(0.1M,pH 8.0)的烧杯中磁力搅拌，在温度4℃层析柜中透析，每4-6h换一次透析缓冲液，重复3次；用超滤管浓缩换液后的蛋白纯化溶液，步骤按照超滤管产品说明书进行；获得的纯蛋白置于碎冰中保存，同时用SDS-PAGE检测目蛋白条带，用Bradford方法检测目的蛋白浓度；方法二：直接将10mL含目的蛋白的纯化液用酶反应缓冲液Tris.Cl(0.1M,pH 8.0)稀释至50mL后，按超滤管产品说明书中溶液置换步骤操作；

[0121] 3个ScALDH蛋白酶学性质：

[0122] 醛脱氢酶活性的测定：

[0123] 蛋白质含量测定：釆用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，标准品为牛血清白蛋白(BSA)，按产品说明书方法制作标准曲线，反应时间为5min，测定吸光值波长为595nm，绘制出标准曲线。

[0124] NADH标准曲线绘制：NADH溶液浓度为3mM，分别吸取0、1、3、5、7、9、11μL NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)溶液，用Tris.Cl稀释至200μL，测得OD340nm处的吸光值，从而绘制标准曲线；

[0125] 对ALDH活性的定义参照Sigma-aldrich网站(http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/1/mak082bul.pdf)，醛脱氢酶(ALDH)活性定义为温度30℃，pH 8.0,每分钟生成1μmol NADH的所用的酶量为一个酶活单位(U)；ALDH酶活公式:ALDH Activity＝B×Sample DilutionFactor/(Reaction Time)/V；B＝反应时间内NADH生成量(nmole)，Reaction Time＝Tfinal–Tinitial(minutes)；V＝样本测定体积(mL)，ALDH activity is reported as nmole/min/mL＝milliunit/mL，比酶活＝酶活/蛋白量。

[0126] 酶反应体系(200μL)：醛类底物0.2-5uL，1mmol/L NAD+,0.1mol/L Tris.Cl(pH 8.0),0.1μg纯化酶液，在温度25℃，340nm下测定吸光度的变化；

[0127] 用HPLC和质谱检测酶反应是否进行：对反应产物抽样分别进行HPLC和质谱分析反应混合液组分；

[0128] 酶的底物特异性：

[0129] 选取不同链长的脂肪醛(甲醛，正辛醛，反式-2-己烯-1-醛，己醛，壬醛，乙醛)和芳香醛类水杨醛(邻羟基苯甲醛)和肉桂醛(苯基丙烯醛)作为底物，以NAD+为辅酶，进行酶活测定；

[0130] 相对酶活性测定：醛类底物取用量为1μL，蛋白酶0.1μg，温度30℃，pH8.0，NAD+为1mM反应1min；以反式-2-己烯-1-醛为底物的酶活为100％计算；

[0131] 从图5中可以看出，在醛类底物取用量为1μL(甲醛、反式-2-己烯-1-醛、己醛、辛醛和壬醛)，蛋白酶0.1μg，30℃，pH8.0，NAD+为1mM反应1min条件下，三种蛋白的比酶活值表明：ScALDH10的比酶活值均最低。ScALDH2和ScALDH11差异不显著。

[0132] 实施例5

[0133] 3个ScALDH基因在拟南芥中抗旱耐盐分析：

[0134] 植物过表达载体的构建及转化农杆菌：

[0135] 依据目的基因序列和载体多克隆位点(MCS)设计带有合适酶切位点的引物，序列如下表所示(表7)，以前期获得的齿肋赤藓醛脱氢酶基因为模板，PCR程序为：温度95℃预变性3min；温度95℃30s,温度58℃30s,温度72℃90s,共30个循环；最后温度72℃延伸7min，扩增产物克隆至pMD19-T simple载体后转化至大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆送至华大基因公司测序，保存测序正确的克隆(pMD19-T simple/ScALDH/DH5α)，同时提取质粒，用如下表所述的限制性内切酶酶切pCAMBIA1301和pMD19-T simple/ScALDH质粒，回收目的片段，于温度16℃连接目的基因和载体；

[0136] 表4齿肋赤藓醛脱氢酶家族基因克隆引物序列

[0137]

[0138] T4DNA连接酶连接二者后，转化至大肠杆菌DH5α，经卡那霉素抗性筛选，挑单菌落摇菌，进行菌液PCR(图6a)，PCR阳性克隆提取质粒进行双酶切鉴定(图6b)，测序正确的阳性克隆质粒转化农杆菌EHA105，经链霉素和卡那霉素双抗性筛选，用特异引物进行菌液PCR扩增后得到预期大小的片段。表明pCAMBIA1301-ScALDH植物表达载体构建成功；

[0139] 制备农杆菌EHA105感受态，然后将上述构建的携带ScALDH目的基因的载体转化至农杆菌EHA105，抗性平板阳性克隆的转化菌株经过PCR验证带有外源ScALDH目的基因，保存农杆菌EHA105转化株待用；

[0140] 农杆菌介导法转化拟南芥：

[0141] 拟南芥培养：

[0142] 经过浓度为15％的次氯酸钠消毒5分钟，期间振荡悬浮种子，用无菌水洗涤4-6遍，稍微旋转离心使种子沉淀，弃上清，接种于MS或1/2MS固体培养基，温度4℃春化36h后，转入温度22℃，16h连续光照的人工气候室中培养；

[0143] 将在固体培养基上生长6天的幼苗移栽至人工土壤中，营养土：蛭石(3:1)，保鲜膜保持湿度一周后自然生长，每隔3天浇水保持土壤湿度；

[0144] 农杆菌介浸花法转化拟南芥：

[0145] 拟南芥转基因方法为农杆菌介导的花序浸染法，所采用的农杆菌菌株为EHA105，转化受体材料为哥伦比亚野生型拟南芥；采用花序浸泡法转化拟南芥，取抽苔后花序较多且生长状况良好的植株(选择含苞待放状态的花序)，剪去已经开花的花朵，转化前一天先浇水，将转基因农杆菌(pCAMBIA1301-ScALDH/EHA105菌株)于温度28℃过夜培养，至OD600值为1.2左右，5000rpm离心8min，菌体重新悬浮于新鲜配制的转化液中(转化缓冲液组分：5％Sugar+0.02％Silwet L-77(200μL/L)+100μL/L Triton X-100+100μM AS+2ng/L 6-BA+Agrobacterium，OD600值为0.8-1.0，转化时将拟南芥花序浸泡于菌液中30s，期间轻轻摇动，取出后放置在室内10min，再浸染一次；套袋避光保湿转化植株，横放于托盘中黑暗常温培养36h左右，第二天竖直正常培养，可根据苗的生长状态一周后再浸染一次，培养3-4周后收获种子(T0)，干燥条件下保存备用；

[0146] 收获T0代种子，经消毒后，播种在含70mg/L潮霉素的1/2MS培养基上。野生型在潮霉素培养基上只能萌发出两片子叶，随培养时间延长逐渐死亡，不能长出真叶和根系；而抗性苗10天左右能长出真叶及根系，表现出明显的卡那霉素抗性(图6c)；对获得的抗性苗提取基因组DNA，经PCR检测获得T1代ScALDH转基因拟南芥株系；图6d显示部分PCR阳性转基因拟南芥植株，进一步通过RT-PCR检测ScALDH表达情况，结果表明ScALDH在拟南芥中成功表达(图6e)；

[0147] 转ScALDHs基因拟南芥抗逆性分析：

[0148] 转基因植株检测及表达量分析：

[0149] T0代种子铺于含70μg/mL潮霉素的筛选培养基上，温度4℃春化36h，移至人工气候室，16h连续光照条件下，生长一周(22℃)，将筛选出的阳性苗(能在抗性培养基上长出真叶)移种至营养土中继续生长，保鲜膜保湿一周后，正常培养，收获种子(T1代)，将T1代种子接种于潮霉素抗性培养基中筛选，收获PCR为阳性的T2代种子，继代筛选至T3代植株用于抗逆性分析；

[0150] 单株收种：提取抗性植株的基因组DNA和未转化株基因组DNA对照，利用基因特异引物进行PCR反应，挑选T3阳性拟南芥提取幼苗的总RNA，利用RT-PCR方法分析转基因植株中外源基因的表达情况；

[0151] 转基因拟南芥的逆境处理：

[0152] 转基因植株在培养基中胁迫生长：将T2代种子和野生型种子在15％次氯酸钠中浸泡3min，灭菌水洗涤4-6次后播种在1/2MS培养基上，温度4℃春化2d后，温度22℃，16h/8h光/暗周期光照的人工气候室中垂直培养，生长5-7天后分别移至1/2MS(作对照)，含有1/2MS+300mM甘露醇,1/2MS+150mM NaCl固体培养基上，转入温度22℃,16h连续光照垂直培养；结果表明：(i)盐胁迫9d后转基因及WT幼苗生长均受到抑制，野生型幼苗根系生长完全受到抑制，而转基因株系根系仍能继续生长(图7b)，转基因植株根长是WT根系伸长量的37-
150％；(i i)甘露醇胁迫下，生长9d后转基因及野生型幼苗生长都受到抑制，野生型幼苗叶片数(见WT+A10植株)和鲜重受到影响(图7c)，转基因株系的鲜重比WT株重41-67％；

[0153] 转基因拟南芥在营养土中胁迫生长：为了确保实验的准确性，排除植物生长时期对逆境敏感性的影响，后续实验以一个月大的土培实生苗为材料，分析ScALDH转基因植株抗旱性；

[0154] 将T2代种子和野生型种子在15％次氯酸钠中浸泡3min，灭菌水洗涤4-6次后播种在1/2MS培养基上，温度4℃春化2d，取出垂直置于温度22℃，16h/8h光/暗周期光照的人工气候室中培养，生长7天后，种于营养土(营养土：蛭石为3:1)中于温度22-24℃、相对湿度60％，16h光照/8h黑暗的光照培养，第一周覆膜保湿；恢复生长三周后，用400mM的甘露醇溶液处理至野生型植株叶片开始萎蔫(4天)，如图8所示，正常条件下，转基因和野生型植株表型无明显差异，以400mM甘露醇溶液浇灌转基因及野生型拟南芥进行干旱处理时，4d后野生型拟南芥叶片变成褐色，甚至枯黄，而转基因植株叶片仍能保持绿色。

[0155] 以上结果表明：转ScALDHs基因植株对干旱胁迫和盐胁迫抗性增强，维持植株在盐胁迫下的生长发育过程的正常进行。