一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法

摘要

本发明提供了一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，首先对瞬时表达载体的构建，其次对质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养，最后将农杆菌菌株的介导瞬时表达，记录叶片的过敏反应情况。本发明通过直接接种新的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB来鉴定烟草品种对南方根结线虫的抗性，鉴定方法简单有效，适应大量育种材料鉴定的需求，且简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫（南方根结线虫）的抗性筛选鉴定。

权利要求

1.一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）瞬时表达载体的构建：人工合成PVY-NIB基因，其序列为SEQ ID NO.1，并克隆到空载体pCAMBIA2300-LIC中，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体；

（2）质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养：将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:

PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA分别转化农杆菌菌株，并将转化好的农杆菌菌株进行培养，得到农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液；

（3）农杆菌菌株的介导瞬时表达：烟草试验材料种植于光合培养箱中，试验选取6 8周~

的烟草真叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤（2）中的菌液，涂在叶片上，使叶片浸润，再放入光合培养箱中，连续观察叶片的过敏性反应情况并记录。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中构建的具体过程为：首先，将PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，分别在序列5’端加入克隆位点Pstl 和3’端加入克隆位点 Sacl，合成序列SEQ ID NO.1；其次，将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4 DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，步骤（2）中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法转化农杆菌菌株LBA4404，得到农杆菌LBA4404/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和LBA4404/ pCAMBIA2300-LIC菌液。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，步骤（2）中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法分别转化农杆菌C58C1，得到农杆菌C58C1/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和C58C1/ pCAMBIA2300-LIC菌液。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，所述步骤（3）中光合培养箱中的条件为白天温度设置为26℃，16个小时；夜晚温度设置为18℃，8个小时。

说明书

一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法。

背景技术

[0002] 烟草根结线虫病在上世纪80年代以后，其病害程度不断扩展，危害逐渐加大，已经成为了我国烟草的主要病虫害之一，造成的损失非常之大。其不仅会造成烟草质量变差，生长缓慢，并且会造成整株死亡情况的出现。因此，如何有效地防治根结线虫病已成为当前我国烟叶生产中急需解决的问题。由于受环境和经济水平的约束，大部分缺水旱作烟区无法开展防治效果较好的水旱轮作，从而多采用化学手段防治，虽然取得一些较好的效果，但也造成了农药高残留、高毒性、烟叶品质的下降和环境污染的结果，因此选育和推广抗病品种是防治烟草根结线虫病最经济有效的方法之一。我国烟草抗根结线虫鉴定主要通过田间病圃和人工接种鉴定，鉴定技术与结果不仅受环境影响较大，而且不能快速、大量的鉴定烟草种质资源和以及用于对杂种后代材料的筛选，限制了抗病育种的有效开展。可靠、快捷的烟草抗根结线虫鉴定技术是培育和利用抗病烟草品种控制根结线虫病的关键之一。以往的我国烟草抗根结线虫鉴定主要通过田间病圃和人工接种鉴定，耗时时间长，不适用于对大批材料进行快速鉴定。

[0003] 烟草品种抗根结线虫与感染PVY-MSNR产生枯斑是同一基因所致，具有一因多效性，同时，烟草品种抗根结线虫与感染PVY-MSNR产生枯斑对于温度和叶龄具有同一的敏感性。这种一因多效性被广泛地用于烟草抗根结线虫病育种，相关研究证明PVY-MSNR复制酶(PVY-NIB)是烟叶接种病毒后在抗线虫品种上产生枯斑反应的诱导因子。病毒接种鉴定法具体操作是在烟草苗期将PVY-MSNR病毒接种到叶片上，7～10天观察叶片是否产生枯斑反应，出现枯斑即为抗病品种，否则为感病品种，以此筛选烟草抗南方根结线虫品种。

发明内容

[0004] 本发明的目的就是鉴于上述理论建立一套更加完备且快速有效的抗性鉴定技术，通过此鉴定方法的运用能够有效对抗根结线虫病的烟草品种进行育种。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

[0006] 一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，包括以下步骤：

[0007] (1)瞬时表达载体的构建：人工合成PVY-NIB基因，其序列为SEQ ID NO.1，并克隆到空载体pCAMBIA2300-LIC中，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体；

[0008] (2)质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养：将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA分别转化农杆菌菌株，并将转化好的农杆菌菌株进行培养，得到农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液；

[0009] (3)农杆菌菌株的介导瞬时表达：烟草试验材料种植于光合培养箱中，试验选取6～8周的烟草真叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤(2)中的菌液，涂在叶片上，使叶片浸润，再放入光合培养箱中，连续观察叶片的过敏性反应情况并记录。

[0010] 进一步，所述步骤(1)中构建的具体过程为：首先，将PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，分别在序列5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，合成序列SEQ ID NO.1；其次，将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。

[0011] 进一步，步骤(2)中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法转化农杆菌菌株LBA4404，得到农杆菌LBA4404/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和LBA4404/pCAMBIA2300-LIC菌液。

[0012] 进一步，步骤(2)中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法分别转化农杆菌C58C1，得到农杆菌C58C1/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和C58C1/pCAMBIA2300-LIC菌液。

[0013] 进一步，所述步骤(3)中光合培养箱中的条件为白天温度设置为26℃，16个小时；夜晚温度设置为18℃，8个小时。

[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0015] 1、本发明构建新的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB，并优选利用C58C1感受态细胞进行转化，更好地对烟草抗根结线虫的抗性准确地鉴定。

[0016] 2、本发明的鉴定方法所选试验材料为苗龄6～8周的烟草叶片，克服了传统鉴定方法周期长、易受自然条件的影响等缺点，在很大程度上提高了品种抗根结线虫的鉴定速率。

[0017] 3、本发明通过直接接种新的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB来鉴定烟草品种对南方根结线虫的抗性，鉴定方法简单有效，适应大量育种材料鉴定的需求，且简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫(南方根结线虫)的抗性筛选鉴定。

具体实施方式

[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0019] 本发明一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，包括以下步骤：

[0020] (1)瞬时表达载体的构建：人工合成PVY-NIB基因，其序列为SEQ ID NO.1，并克隆到空载体pCAMBIA2300-LIC中，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体；

[0021] (2)质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养：将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA分别转化农杆菌菌株，并将转化好的农杆菌菌株进行培养，得到农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液；

[0022] (3)农杆菌菌株的介导瞬时表达：烟草试验材料种植于光合培养箱中，试验选取6～8周的烟草真叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤(2)中的菌液，涂在叶片上，使叶片浸润，再放入光合培养箱中，连续观察叶片的过敏性反应情况并记录。

[0023] 其中，所述步骤(1)中构建的具体过程为：首先，将PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，分别在序列5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，合成序列SEQ ID NO.1；其次，将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。

[0024] 所述步骤(2)中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法转化农杆菌菌株LBA4404，得到农杆菌LBA4404/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和LBA4404/pCAMBIA2300-LIC菌液。

[0025] 或，所述步骤(2)中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法分别转化农杆菌C58C1，得到农杆菌C58C1/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和C58C1/pCAMBIA2300-LIC菌液。

[0026] 本发明植物表达载体pCAMBIA2300-LIC由韩国首尔大学Kim教授提供，载体大小约10490bp，载体抗性为Kan。

[0027] 本发明以下实施例中，农杆菌介导的鉴定技术标准如表1所示，根据枯斑面积占叶片总面积的大小判定烟草抗性的强弱。

[0028] 表1农杆菌介导的鉴定技术标准

[0029]

[0030] 实施例1

[0031] 试验所用农杆菌感受态细胞为LBA4404购自北京博迈德生物司。

[0032] 一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，包括以下步骤：

[0033] (1)瞬时表达载体的构建

[0034] 首先，将PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，分别在序列5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，合成序列SEQ ID NO.1；

[0035] 其次，将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体；

[0036] (2)质粒DNA的转化及农杆菌菌株LBA4404培养

[0037] 将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法分别转化农杆菌菌株LBA4404；将转化好的农杆菌菌株LBA4404涂布到含有抗生素的LB固体培养基平板上，挑选农杆菌LBA4404的单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用MgCl2溶液重悬，用重悬液将菌液OD600值调至0.5；

[0038] (3)农杆菌菌株LBA4404介导的瞬时表达

[0039] 试验材料种植于光合培养箱中，白天温度设置为26℃，16个小时；夜晚温度设置为18℃，8个小时。试验选取6～8周的烟草真叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤(2)制得的菌液，在叶脉之间轻轻注入；注射完成后套上保鲜膜，在黑暗条件下培养两天后取下保鲜膜，再置于光合培养箱中，连续3～7天观察叶片的过敏性反应情况并记录。

[0040] 植物的生长环境，如光照时间和温湿度等，影响植物的生长和生理状况，也会影响植物的瞬时表达的效率。普通烟草品种在苗龄为6～8周时，瞬时表达效率较高，表现的枯斑反应最剧烈。除苗龄外，烟草叶片的生理状态也影响瞬时表达效率。活体叶片较离体叶片瞬时表达效率高，离体叶片在注射菌液后，后期观察过程中烟草叶片上会出现褪绿发黄现象，对枯斑反应的观察造成一定的影响。

[0041] 其中，LB固体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1L，最后用5mol/L的NaOH调PH值至7.0。

[0042] LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1L，最后用5mol/L的NaOH调PH值至7.0。

[0043] 重悬液配方：10mmol/L MgCl2，10mmol/L 2-N吗啉代乙磺酸和120μmol/L乙酰丁香酮，用KOH溶液将溶液PH调至5.6，KOH溶液可以为5mol/L。

[0044] 其中，步骤(2)中质粒DNA细胞的冻融法转化按以下步骤进行：

[0045] 1)取-80℃保存的LBA4404农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化；

[0046] 2)在超净工作台中，向刚刚化冻的感受态细胞悬浮液中加3ul需要转化的质粒DNA细胞，轻轻混匀，冰水浴静置10min；

[0047] 3)将离心管置于液氮中速冻5min，然后放入37度水浴温浴5min，再次冰浴5min；

[0048] 4)在超净工作台中向离心管中加入无抗生素的LB液体培养基，在摇床中震荡培养(温度：28℃；转速：180rpm)4～5h，目的是使菌体复苏并表达抗生素抗性；

[0049] 5)5000rpm离心1分钟收菌，留100ul左右上清，轻轻吹打重悬菌体，加到相应抗生素的LB固体培养基平板上，用无菌的细菌涂布器将细胞均匀涂开，等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28℃培养48小时。

[0050] 其中，步骤(2)中农杆菌的培养：

[0051] 农杆菌浓度及侵染时间是影响遗传转化率的重要因子，以烟草叶片为转化受体，将菌液浓度调至0.5时，瞬时表达效率最高。

[0052] 乙酰丁香酮(AS)是遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，对植物的遗传转化有很大帮助，不同植物所需的最适乙酰丁香酮浓度也不同，当乙酰丁香酮的浓度为200umol/L时，瞬时表达的效率较高。

[0053] 1)挑取经转化和培养好的农杆菌单菌落于含有1.5ml液体培养基(每毫升液体培养基中加1ul的50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)的2ml离心管中，28℃过夜培养12小时；

[0054] 2)次日进行菌液PCR检测是否含有目的条带；

[0055] 反转录反应液

[0056]

[0057]

[0058] 引物序列

[0059] 空载体引物序列：

[0060] PVY-KZ F：ATCGAGCTGTATGCGGAGTG

[0061] PVY-KZ R：CCGCTTACCGGATACCTGTC

[0062] PVY-NIB引物序列：

[0063] PVY-MSNR F：AACCGTGGATACGGAAGCAG

[0064] PVY-MSNR R：CCACTACAGTCGAAGGCTGG

[0065] 反应条件

[0066]

[0067] 3)将经过PCR鉴定出含有目的条带的菌液加入30ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，在摇床(温度：28℃；转速：180rpm)震荡培养12小时；

[0068] 4)将瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC加入到含50ug/mL卡那霉素的50mlLB培养基中扩大培养，在28℃下220r/min培养16～20h后。次日于4℃下6000r/min离心10min，回收菌体；

[0069] 5)次日在4℃，4000r/min离心8min收集农杆菌菌液于50ml离心管，去上清，加30ml重悬液(10mmol/L MgCl2，10mmol/L 2-N吗啉代乙磺酸和120μmol/L乙酰丁香酮，用KOH溶液将溶液PH调至5.6，KOH溶液可以为5mol/L)用紫外分光光度计测OD600值，用重悬液将菌液OD600值调至0.5，在26℃光合培养箱放置1～3h。

[0070] 其中，农杆菌菌株C58C1介导的瞬时表达的具体过程为：

[0071] 试验材料种植于光合培养箱中，白天温度设置为26℃，16个小时；夜晚温度设置为18℃，8个小时，选取6～8周的烟草叶片。注射前将烟草在日光灯下培养2～3h，以便烟草气孔张开而有利于注射。选择烟草植株中部较大的两个叶片进行注射，用蒸馏水清洁叶片背部，蘸75％乙醇擦拭，再蘸取蒸馏水清洗残留的乙醇溶液，选用背面叶脉部位，用注射器针头轻轻划伤，用无针头的注射器吸取0.5～1.0ml的菌液，左手扶着注射叶片正面，右手用注射器吸取菌液从注射点轻轻推入，每个注射点注射量以注射液无法在叶背面扩散为止，每个叶片的注射点不要超过6个点为宜，空载体菌液和PVY-NIB菌液各注射五株。注射后用标记笔标记注射液扩散的范围。为了防止操作失误引起的注射液喷射，在注射的过程中要戴口罩、手套和眼镜。如果同时进行多个工程菌的注射，在注射不同菌液前更换1次手套，防止交叉污染。注射完毕后用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背部，套上保鲜袋，在22℃黑暗条件下培养2d后取下保鲜袋，而后置于22℃，18h/6h光照/黑暗交替的温室中培养，以接种空载体缓冲液的叶片作为对照，连续3～7d观察是否出现枯斑反应并记录。

[0072] 实施例2

[0073] 目前已发现有的三大类型的Ti质粒农杆菌，每一大类又有不同种类农杆菌，即使是同一种农杆菌，又有许多变异菌株，它们的侵染能力及宿主范围相差甚大。

[0074] 在试验中发现根癌农杆菌菌株LBA4404存在生长慢，菌株培养过程中结球、结块，尤其是共培养后难以洗掉等诸多问题，以致转化试验难于操作。另外，还可能存在菌株变异的问题，使农杆菌难以控制。为了克服LBA4404的这些问题，为了对现有的转化菌株进行优化，本发明采用发根农杆菌C58C1替代根癌农杆菌LBA4404。

[0075] 试验所用农杆菌感受态细胞为C58C1购自北京博迈德生物司。

[0076] 一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，包括以下步骤：

[0077] (1)瞬时表达载体的构建

[0078] 首先，将PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，分别在序列5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，合成序列SEQ ID NO.1；

[0079] 其次，将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4 DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体；

[0080] (2)质粒DNA的转化及农杆菌菌株C58C1培养

[0081] 将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法分别转化农杆菌菌株C58C1；将转化好的农杆菌菌株C58C1涂布到含有抗生素的LB固体培养基平板上，挑选农杆菌C58C1的单菌落，分别接种于LB液体培养基中选择培养，离心收集菌体，菌体沉淀用MgCl2溶液重悬，用重悬液将菌液OD600值调至0.6；

[0082] (3)农杆菌菌株C58C1介导的瞬时表达

[0083] 试验材料种植于光合培养箱中，白天温度设置为26℃，16个小时；夜晚温度设置为18℃，8个小时。试验选取6～8周的烟草离体叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤(2)制得的菌液，在叶脉之间轻轻注入；注射完成后套上保鲜膜，在黑暗条件下培养两天后取下保鲜膜，再置于光合培养箱中，连续3～7天观察叶片的过敏性反应情况并记录。

[0084] 其中，LB固体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1L，最后用5mol/L的NaOH调PH值至7.0。

[0085] LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1L，最后用5mol/L的NaOH调PH值至7.0。

[0086] 重悬液配方：10mmol/L MgCl2，10mmol/L 2-N吗啉代乙磺酸和120μmol/L乙酰丁香酮，用KOH溶液将PH调至5.6，KOH溶液可以为5mol/L。

[0087] 其中，步骤(2)中质粒DNA细胞的冻融法转化按以下步骤进行：

[0088] 1)取-80℃保存的C58C1农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化；

[0089] 2)在2管C58C1感受态细胞中分别加入3ul载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA轻轻混匀，冰浴30min；

[0090] 3)置液氮中冷冻2min，迅速移入37℃水浴中热激5min，再迅速冰浴2min；

[0091] 4)管中各加入800ulLB液体培养基，于28℃震荡培养3h～4h；

[0092] 5)5000r/min离心5min沉淀菌体，弃掉800ul上清液后重新悬浮菌体，2管分别均匀涂布于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基平板上，28℃倒置培养2d。

[0093] 还可以通过电击法对发根农杆菌C58C1的转化：

[0094] 1)取发根农杆菌感受态细胞C58C1，置于冰上解冻；

[0095] 2)加5ul质粒于菌液中，混匀并转移至无菌预冷的电击杯中(电极间距为0.2cm)；

[0096] 3)吸干电击杯表面的水，将电击杯放入电转化仪的电极之间，电击4-5ms；

[0097] 4)取出电击杯，迅速加入800ul LB液体培养基(28℃预热)，混匀并转移细胞至1.5mL的离心管中，在28℃培养3h；

[0098] 5)取100ul菌液涂布于含利福平(100ug/mL)和卡那霉素(50ug/mL)的LB平板中，28℃培养3d。

[0099] 其中，步骤(2)中农杆菌的培养：其具体过程与实施例相同，有以下两点区别：

[0100] 农杆菌浓度及侵染时间是影响遗传转化率的重要因子，以烟草叶片为转化受体，将菌液浓度调至0.6时，瞬时表达效率最高。

[0101] 乙酰丁香酮(AS)是遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，对植物的遗传转化有很大帮助，不同植物所需的最适乙酰丁香酮浓度也不同，当乙酰丁香酮的浓度为120umol/L时，瞬时表达的效率较高。

[0102] 其中，农杆菌菌株C58C1介导的瞬时表达的具体过程与实施例1相同。

[0103] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。