一种农杆菌介导的大麻转基因方法

摘要

一种农杆菌介导的大麻转基因方法，包括以下步骤：（1）将大麻种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于芽诱导培养基；（3）将含有外源基因的根癌农杆菌复活，浸染子叶外植体并进行共培养；（4）用无菌水冲洗子叶5-10遍，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中培养，得大麻小苗；（5）将所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中培养，得大麻转基因苗；（6）转入水培液或基质中进行驯化。本发明首次建立了大麻转基因体系，通过转基因方法将目的外源基因导入到大麻中，为大麻品种改良和基因功能研究等打下了基础。

权利要求

1.一种农杆菌介导的大麻转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将大麻种子经无菌处理、播种，得到3日龄种子无菌苗；

（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于含噻苯隆和α-萘乙酸的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为0.1-2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-0.2mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂6-7g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200-

2600lx，光照时间16-18h/d，温度24±2℃，培养时间为0-4天；

（3）将含有外源基因的根癌农杆菌复活，7000-9000rpm离心8-12分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为0.8-1.0，加入乙酰丁香酮, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为

90-110mmol/L，所述液体MS培养基含噻苯隆浓度为0.1-2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-

0.2mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶20-240分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；再将子叶转入共培养基中培养1-4天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1-2mg/L，α-萘乙酸0.01-0.2mg/L ，乙酰丁香酮90-110mmol/L；

（4）用含有300-600mg/L头孢霉素和300-600mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养22-28天，得大麻小苗；

所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1-2mg/L，α-萘乙酸0.01-0.2mg/L ，头孢霉素300-600mg/L，羧苄青霉素300-600mg/L，筛选剂；

（5）将步骤（4）所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中，所述生根培养基成份为：MS培养基，含吲哚乙酸0.01-0.2mg/L，筛选剂；培养30-60天，得大麻转基因苗；

（6）将步骤（5）所得大麻转基因苗转入水培液或基质中进行驯化。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大麻转基因方法，其特征在于，步骤（2）中，撕下的子叶为靠下胚轴部分。

3.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的大麻转基因方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）中，所述筛选剂为潮霉素或除草剂，若筛选剂为潮霉素，则浓度为30-40mg/L，用筛选剂为除草剂，则浓度为2-5mg/L。

4.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的大麻转基因方法，其特征在于，步骤（6）中，所述水培液为不含有机成分的液体MS培养基，稀释1-4倍。

5.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的大麻转基因方法，其特征在于，步骤（6）中，所述基质为泥炭：蛭石：珍珠岩以体积比2.8-3.2:1:1混合。

6.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的大麻转基因方法，其特征在于，步骤（3）中，含有外源基因的根癌农杆菌，通过以下方法得到：将含有GUS基因的载体pcambia1304导入GV3101根癌农杆菌；或将含有GUS基因的载体ptf102导入EH101根癌农杆菌。

说明书

一种农杆菌介导的大麻转基因方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种农杆菌介导的大麻转基因方法。

背景技术

[0002] 大麻（Cannabis Sativa L.）是一种环境适应性优良、吸附重金属能力强的天然纤维植物，在纺织、制药、建材、能源等领域发挥着不容低估的作用，具有广阔的发展前景。纤用大麻在中国种植历史悠久，种植面积居世界前列。药用大麻则是近年来发展迅速的产业领域，大麻二酚（CBD）安全无致幻成瘾作用，具有抗痉挛、抗风湿性关节炎、抗焦虑等药理活性，对多种癌症有治疗效果，是制药行业的重要原料，在国际市场供不应求。因此，对优异大麻品种的需求也十分迫切。但因大麻是常异花授粉作物，遗传背景复杂，传统的育种方法改良品种进展缓慢。

[0003] 转基因方法是研究基因功能、改良大麻品种的有效途径。高效转基因体系建立的前提是高效再生体系的建立，但是，大麻是一种再生和遗传转化顽拗型植物，其再生效率较低，限制了转基因体系的建立，迄今为止，并无成功的大麻转基因体系建立的报道。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种可以更快的获得改良品种的农杆菌介导的大麻转基因方法。

[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种农杆菌介导的大麻转基因方法，包括以下步骤：（1）将大麻种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；
具体操作方法可参见以下文献：程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得大麻种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011, 33(1):24-26；
（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下（不宜切下，否则会影响再生频率），切去叶尖，正置于含噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为0.1-2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-0.2mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂（6-7）g/L，pH5.5-6.0，光照强度2200-2600lx，光照时间16-18h/d，温度24±2℃，培养时间为0-4天；
进一步，撕下的子叶为靠下胚轴部分；
（3）将含有外源基因的根癌农杆菌复活，7000-9000rpm离心8-12分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为0.8-1.0，加入乙酰丁香酮（AS）, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为90-110mmol/L，所述液体MS培养基含噻苯隆浓度为0.1-2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01-
0.2mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶20-240分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；再将子叶转入共培养基中培养1-4天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1-2mg/L，α-萘乙酸0.01-0.2mg/L ，乙酰丁香酮90-110mmol/L；
含有外源基因的根癌农杆菌，可以通过以下方法得到：将含有GUS基因的载体pcambia1304导入GV3101根癌农杆菌；或将含有GUS基因的载体ptf102导入EH101根癌农杆菌。原料、载体、菌种都可通过市售途径获得。

[0006] （4）用含有300-600mg/L头孢霉素和300-600mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶(优选5-10遍)，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养22-28天，得大麻小苗；所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1-2mg/L，α-萘乙酸0.01-0.2mg/L ，头孢霉素300-600mg/L，羧苄青霉素300-600mg/L，筛选剂；所述筛选剂优选为潮霉素或除草剂，若筛选剂为潮霉素，则浓度为30-40mg/L，用筛选剂为除草剂，则浓度为2-5mg/L；
（5）将步骤（4）所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中，所述生根培养基成份为：MS培养基，含吲哚乙酸（IAA）0.01-0.2mg/L，筛选剂；所述筛选剂优选为潮霉素或除草剂，若筛选剂为潮霉素，则浓度为30-40mg/L，用筛选剂为除草剂，则浓度为2-5mg/L；培养30-60天，得大麻转基因苗；
（6）将步骤（5）所得大麻转基因苗转入水培液或基质中进行驯化。之后可移栽。所述水培液为不含有机成分的液体MS培养基，稀释1-4倍。所述基质为泥炭：蛭石：珍珠岩以体积比
2.8-3.2:1:1混合。

[0007] 本发明以无菌苗子叶为外植体，结合组织培养、生长调节剂，首次建立了大麻转基因体系，通过转基因方法将有用的外源基因导入到大麻中，为大麻品种改良和基因功能研究等打下了良好基础。

附图说明

[0008] 图1为实施例1外源GUS基因在大麻子叶外植体中表达图；图2为实施例1外源GUS基因在大麻愈伤组织中中表达图；
图3为实施例1外源GUS基因在大麻根中表达图；
图4为实施例1外源GUS基因在叶片中表达图。

具体实施方式

[0009] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

[0010] 实施例1本实施例包括以下步骤：
（1）将大麻种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；
具体操作方法参见程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得大麻种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011, 33(1):24-26；
（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于含噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为
0.1mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.5-6.0，光照强度
2200lx，光照时间16/d，温度24±2℃，培养时间为1天；
撕下的子叶为靠下胚轴部分；
（3）将含有外源基因的GV3101根癌农杆菌（含有外源基因的GV3101根癌农杆菌通过以下方法得到：将含有GUS基因的载体pcambia1304导入GV3101根癌农杆菌；本实施例使用的含有GUS基因的载体pcambia1304和GV3101根癌农杆菌均购自武汉菌种保藏中心）复活，
7000rpm离心8分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为0.8，加入乙酰丁香酮（AS）, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为90mmol/L，所述液体MS培养基含噻苯隆浓度为0.1mg/L，α-萘乙酸浓度为0.01mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶30分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；
再将子叶转入共培养基中培养1天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1mg/L，α-萘乙酸0.01mg/L ，乙酰丁香酮90mmol/L；
（4）用含有300mg/L头孢霉素和300mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶5遍，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养22天，得大麻小苗；
所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆0.1mg/L，α-萘乙酸0.01mg/L ，头孢霉素300mg/L，羧苄青霉素300mg/L，筛选剂；所述筛选剂为潮霉素，浓度为30mg/L；
（5）将步骤（4）所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中，所述生根培养基成份为：MS培养基，含吲哚乙酸（IAA）0.01mg/L，筛选剂；所述筛选剂为潮霉素，浓度为30-40mg/L；培养
50天，得大麻转基因苗；
（6）将步骤（5）所得大麻转基因苗转入水培液中进行驯化。之后可移栽。所述水培液为不含有机成分的液体MS培养基。

[0011] 在步骤（4）-（6）的实施过程中，对大麻外植体、愈伤组织、小苗各部位进行GUS染色检测，从而判断外源基因是否转入大麻并表达（如图1-4所示）。

[0012] 图中颜色较深的部分为外源基因的表达。由图1-4可知，外源基因在大麻外植体、愈伤组织、小苗根和叶片中均有表达。

[0013] 实施例2本实施例包括以下步骤：
（1）将大麻种子经无菌处理、播种得到3日龄种子无菌苗；
具体操作方法参见程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得大麻种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011, 33(1):24-26；
（2）在超净工作台上，将子叶从3日龄种子无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于含噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基上，所述芽诱导培养基为MS培养基，噻苯隆浓度为
2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.2mg/L, 附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.5-6.0，光照强度2600lx，光照时间18h/d，温度24±2℃，培养时间为4天；
撕下的子叶为靠下胚轴部分。

[0014] （3）将含有外源基因的EH101根癌农杆菌（含有外源基因的EH101根癌农杆菌通过以下方法得到：将含有GUS基因的载体ptf102导入EH101根癌农杆菌；含有GUS基因的载体ptf102和EH101根癌农杆菌均购自武汉菌种保藏中心）复活， 9000rpm离心12分钟，用液体MS培养基将离心沉淀悬浮至OD600为1.0，加入乙酰丁香酮（AS）, 至悬浮液中乙酰丁香酮的含量为110mmol/L，所述液体MS培养基含噻苯隆浓度为2mg/L，α-萘乙酸浓度为0.2mg/L；用悬浮液浸染步骤（2）所得子叶30分钟后于洁净滤纸上吸干菌液；再将子叶转入共培养基中培养4天，所述共培养基成份为：MS培养基，含噻苯隆2mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L ，乙酰丁香酮110mmol/L；
（4）用含有600mg/L头孢霉素和600mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗子叶6遍，将子叶用滤纸吸干，转入筛选培养基中，培养28天，得大麻小苗；
所述筛选培养基的成份为：MS培养基，含噻苯隆2mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，头孢霉素
600mg/L，羧苄青霉素600mg/L，筛选剂；所述筛选剂为除草剂，浓度为10mg/L；
（5）将步骤（4）所得小苗转入含有筛选剂的生根培养基中，所述生根培养基成份为：MS培养基，含吲哚乙酸（IAA）0.2mg/L，筛选剂；所述筛选剂为除草剂，则浓度为10mg/L；培养50天，得大麻转基因苗；
（6）将步骤（5）所得大麻转基因苗转入基质中进行驯化。之后可移栽。所述基质为泥炭：
蛭石：珍珠岩以质量比3:1:1混合。

[0015] 在步骤（4）-（6）的实施过程中，对大麻外植体、愈伤组织、小苗各部位进行GUS染色检测，从而判断外源基因是否转入大麻并表达。外源基因在大麻外植体、愈伤组织、小苗根和叶片中均有表达。