一种生物-物理联合处理稻草生产乙醇及挥发性脂肪酸的方法

摘要

本发明公开了一种生物-物理联合处理稻草生产乙醇及挥发性脂肪酸的方法，属于生物技术可再生能源领域。将稻草进行高固瘤胃液发酵处理，即生物预处理，得到发酵产物，挤压固液分离得到挥发性脂肪酸。然后干燥后固体产物再经过物理预处理，得到联合预处理产物。将预处理后的产物进行同步糖化发酵得到乙醇。本发明的主要目标是在提升纤维素转变乙醇，同时获得了挥发性脂肪酸，实现了不同产物的联合生产，提高了生物质稻草转化效率。另外，本发明几乎达到零污染物排放，无有害副产物生成，无需耗费财力处理废液，是一种绿色预处理方法。针对目前利用木质纤维素生物质生产能源转化率低及预处理过程产生的污染废液的问题提出了有效的解决方案。

权利要求

1.一种生物-物理联合处理稻草生产乙醇及挥发性脂肪酸的方法，其特征在于：首先将稻草进行高固瘤胃液发酵处理，即生物预处理，得到发酵产物，挤压固液分离得到挥发性脂肪酸。将干燥后固体产物再进行物理预处理，得到联合预处理产物。将预处理后的产物进行同步糖化发酵得到乙醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稻草是指经清洗并在自然风干后磨碎至2-10mm长度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物预处理是指采用瘤胃液高固发酵稻草，按照稻草的质量和瘤胃液的体积以40g:200ml混合，并密封置于25-40℃的温度下，运行时间为20-40d。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的生物预处理，为避免酸转化为甲烷，瘤胃液中加入5-15mM甲烷抑制剂(2-溴乙烷磺酸钠，BES)。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的生物预处理，瘤胃液中加入30g/L NaHCO3缓冲剂和3g/L CO(NH2)2氮源。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物理预处理是指采用超声波或球磨预处理发酵固体产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述超声波预处理是指，将5g干燥发酵固体加入到50mL醋酸钠缓冲液(pH＝4.8)中，超声功率设为300-500W,频率为45kH，处理时间为30-90min。预处理后的固体经过滤后烘干至恒重，进行同步糖化发酵产乙醇。

8.根据权利要求6所述的方法，所述球磨预处理是指将4g干燥发酵固体直接加入到行星式球磨装置中，转速为600-800rpm，处理时间为60-180min。将产物直接进行同步糖化发酵产乙醇。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同步糖化发酵产乙醇是指将联合预处理后固体产物与乙酸钠缓冲液(pH＝4.8)、培养基、纤维素酶及经活化浓缩后酵母菌培养物混合，总固体浓度保持为2-6％。在30℃条件下培养24-72h。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养基成分为：酵母膏,5g/L；蛋白胨,5g/L；MgSO4·7H2O,1g/L；K2HPO4,1g/L。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶来自黑曲霉(Aspergillus niger)，纤维素酶的投加量为10-40FUP/g底物。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酵母菌为所选菌株为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，经活化浓缩后，以1:5-1:15的体积比例与培养基混合。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述活化浓缩酵母菌是指：酿酒酵母菌与杀菌后培养基于在30℃的条件下，活化12-48h。活化后，在1000rmp转速下对其进行浓缩

15min。

说明书

一种生物-物理联合处理稻草生产乙醇及挥发性脂肪酸的

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物-物理联合处理稻草生产乙醇及挥发性脂肪酸的方法，属于生物技术可再生能源领域。

背景技术

[0002] 近年来，在全球范围内随着人口数量的增加和生活质量提高，导致对能源的需求急剧上升。已超过84％全球总能源来自不可再生的化石能源，例如：煤、石油、天然气。这些化石能源物质燃烧时不可避免往大气层中的排放温室气体和有害气体，污染环境。生物燃料被公认为是可以取代化石燃料的一种可再生能源，已成为当今的研究热点。木质纤维素生物质(稻草)以其可再生，廉价的优点成为生产生物燃料理想的原材料。木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维和木质素组成，木质素和半纤维素结合的共价键将纤维素分子包埋其中，木质素中醚键和碳-碳键形成的具有三维结构高分子芳香类化合物，这些强的键会形成一种天然屏障，进而阻碍碳水化合物转变为生物能源。因此，适当的预处理显得尤为重要。目前所用的预处理主要包括物理(球磨、超声)，热(蒸汽爆破、热液)，化学(酸、碱、氧化剂)，生物(真菌、酶、发酵)以及联合处理(生物+化学，生物+物理)。生物预处理是一种安全，耗能少，环境友好型的预处理方法，因此受到广泛关注。

[0003] 本专利提出了以高固瘤胃液发酵(总固体浓度≥20％)作为一种新颖的生物预处理方法。瘤胃液中约含有106个细菌，106纤毛原生动物和103-106真菌，这些微生物通过相互作用能够有效降解木质纤维素生物质，短时间会产生大量的挥发性脂肪酸。通过控制底物和接种物的比例或添加甲烷菌抑制剂可使反应器内长期保持酸化状态。这些有机酸和瘤胃微生物共同作用可被视为一种木质纤维素的预处理方法。生物质经长期酸和微生物作用下，晶体结构易遭到破坏，半纤维素被降解，表面孔隙度增大，使其内部纤维素更容易被酶接触。长期的厌氧发酵还可以使木质纤维素生物质颗粒变小，从而增大了比表面积，增加了酶对纤维素的可触及性。高固瘤胃液发酵具有高的处理能力，节省了能源，无有害代谢产物排放，无需用水冲洗发酵产物，产生的挥发性脂肪酸可以被回收作为生产甲烷、氢气，电，生物柴油及生物塑料(PHAs)的底物。此外，瘤胃液得以合理的利用，还可以减少了屠宰场处理牛羊瘤胃内容物的负担。

[0004] 物理预处理主要是通过降低颗粒大小，增加其比表面积，降低纤维素结晶度促进酶水解效率。本专利提出生物与物理联合预处理稻草生产乙醇及挥发性脂肪酸的方法，无有害副产物生成，是一种环境友好型的预处理方法。增加了生物能源产量和产物多样性，提高了物质转化效率，突破了传统单一预处理方法的瓶颈。

发明内容

[0005] 本发明目的在于填补现有相关技术的空白，提供一种生物-物理联合处理稻草生产乙醇及挥发性脂肪酸的方法。该方法解决了稻草水解效率低的问题，提高了稻草的转化效率，增加了生物能源产量和产物多样性，是一种环境友好型的预处理方法。

[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 一种生物-物理联合处理稻草生产乙醇及挥发性脂肪酸的方法，其特征在于：首先将稻草进行高固瘤胃液发酵处理，即生物预处理，得到发酵产物，挤压固液分离得到挥发性脂肪酸。将干燥后固体产物再进行物理预处理，得到联合预处理产物。将预处理后的产物进行同步糖化发酵得到乙醇。

[0008] 所述稻草是指：经清洗并在自然风干后磨碎至2-10mm长度的稻草。

[0009] 所述的生物预处理是指：采用瘤胃液高固发酵稻草，按照稻草的质量和瘤胃液的体积以40g:200ml混合，并密封置于25-40℃的温度下，运行时间为 20-40d。

[0010] 所述生物预处理，为避免酸转化为甲烷，瘤胃液中加入5-15mM甲烷抑制剂(2-溴乙烷磺酸钠，BES)。

[0011] 所述生物预处理，瘤胃液中加入30g/L NaHCO3缓冲剂和3g/L CO(NH2)2氮源。

[0012] 所述物理预处理是指：采用超声波或球磨预处理发酵固体产物。

[0013] 所述超声波预处理是指：将5g干燥发酵固体加入到50mL醋酸钠缓冲液 (pH＝4.8)中，超声功率设为300-500W,频率为45kH，处理时间为30-90min。预处理后的固体经过滤后烘干至恒重，进行同步糖化发酵产乙醇。

[0014] 所述球磨预处理是指：将4g干燥发酵固体直接加入到行星式球磨装置中，转速为600-800rpm，处理时间为60-180min。将产物直接进行同步糖化发酵产乙醇。

[0015] 所述同步糖化发酵产乙醇是指：将联合预处理后固体产物与乙酸钠缓冲液 (pH＝4.8)、培养基、纤维素酶及经活化浓缩后酵母菌培养物混合，总固体浓度保持为2-6％。在30℃条件下培养24-72h。

[0016] 所述培养基成分为：酵母膏,5g/L；蛋白胨,5g/L；MgSO4·7H2O,1g/L； K2HPO4,1g/L。

[0017] 所述纤维素酶来自黑曲霉(Aspergillus niger)，纤维素酶的投加量为10-40 FUP/g底物。

[0018] 所述酵母菌为所选菌株为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，经活化浓缩后，以1:5-1:15的体积比例与培养基混合。

[0019] 所述活化浓缩酵母菌是指：酿酒酵母菌与杀菌后培养基于在30℃的条件下，活化12-48h。活化后，在1000rmp转速下对其进行浓缩15min。

[0020] 本发明的优点在于：

[0021] 本发明利用瘤胃液作为微生物菌剂，对农业废弃物稻草进行生物预处理，回收液体产物挥发性脂肪酸后，固体产物经超声或球磨预处理后进行同步糖化发酵产乙醇。这种联合预处理方法，实现了挥发性脂肪酸和乙醇的联合生产，较单一预处理提高了乙醇的产量和稻草全纤维素转化效率。针对目前利用木质纤维素生物质生产能源转化率低的瓶颈问题提出了有效的解决方案。

[0022] 此外，本发明在实际应用中具有以下优点：

[0023] (1)采用联合预处理稻草同步糖化发酵产乙醇可同时获得两种产物：挥发性脂肪酸和乙醇。而挥发性脂肪酸可以被利用生产甲烷、氢气，电，生物柴油等能源物质。可以满足不同能源需求。

[0024] (2)在生产能源过程中，联合预处理可以提高稻草的总物质转化率，更多组分被利用转化为当今急需的能源乙醇，为清洁能源的工业化生产提供合理的理论依据。

[0025] (3)在实际应用中，该联合预处理方法几乎达到零污染排放，无需耗费财力处理废液，是一种绿色预处理方法。

[0026] (4)该联合预处理中涉及到来自屠宰场废水重要组成部分的瘤胃液，如果其被大规模应用到实际生产中，可以有效的缓解了屠宰场污水处理负担。

附图说明

图1是未处理和四种预处理稻草的产物结果图；图2是未处理与四种预处理稻草的总物质转化率结果图。

具体实施方式

[0027] 下面通过具体事例对本发明进一步阐述，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实例。

[0028] 本实例中的瘤胃液取自屠宰场新鲜的牛瘤胃，过滤后，并置于密闭保温装置中，立即进行接种。瘤胃液的pH为6.5，TS为10.7g/L，VS为6.8g/L。本实例中得纤维素酶和酵母菌均来自购买。下述实例中得其它所用的材料，试剂等如无特殊说明，均从商业途径获得。

[0029] 实施例1

[0030] 本实施例的具体步骤如下：

[0031] (1)生物预处理：称取2-10mm长度的干稻草40g于1L的厌氧发酵瓶中，在瘤胃液中加入缓冲剂NaHCO3 30g/L，氮源CO(NH2)2 3g/L，甲烷抑制剂BES 12mM。充分混匀后接种到1L的厌氧发酵瓶中。在温度为39℃条件下，发酵 30d。发酵结束后，通过挤压回收挥发性脂肪酸，将固体产物用烘箱烘干后进行物理预处理。

[0032] (2)物理预处理：取5g步骤(1)得到的干燥固体产物加入到50mL醋酸钠缓冲液(pH＝4.8)中，在超声波功率为400W，频率为45kH，处理60min，将处理后的样品过滤，烘干后进行同步糖化发酵产乙醇。

[0033] (3)同步糖化发酵产乙醇：配制培养基：葡萄糖,50g/L；酵母膏,5g/L；蛋白胨,5g/L；MgSO4·7H2O,1g/L；K2HPO4,1g/L。在121℃的高温灭菌锅灭菌30 min，冷却后，将酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)在30℃的条件下，活化24h。活化后，在1000rmp转速下对其进行浓缩20min。将步骤(2)得到的固体产物与乙酸钠缓冲液(pH＝4.8)、培养基、纤维素酶及经活化浓缩后酵母菌培养物混合，总固体浓度为4％。纤维素酶的投加量为30FUP/g底物，浓缩酵母菌以1:10的体积比例与培养基混合。发酵时间为72h后，将发酵液蒸馏获得乙醇。

[0034] (4)实验结果：如表1所示，稻草经过30d的生物预处理可以回收挥发性脂肪酸为，醋酸：62.1mg COD/g干稻草；丙酸：41.7mg COD/g干稻草；丁酸： 27.3mg COD/g干稻草；戊酸：11.6mg COD/g干稻草。联合预处理后固体样品经72h同步糖化发酵产乙醇为117.8mg/g干稻草，较单独超声预处理提高了28.6％(91.6mg/g干稻草)，是未预处理的约1.7倍(69.3mg/g干稻草)。如图1 所示，联合预处理总物质转化率是单独超声及未处理近2.2和3倍。

[0035] (5)结论：通过生物和超声联合预处理的策略可以实现稻草生物质原料清洁能源乙醇的生产及回收有价值的代谢产物挥发性脂肪酸，提高了稻草总物质转化率，达到了有效利用木质纤维素生物质的目的，为清洁能源的工业化生产提供合理的理论依据。

[0036] 实施例2

[0037] (1)生物预处理：称取2-10mm长度的干稻草40g于1L的厌氧发酵瓶中，在瘤胃液中加入缓冲剂NaHCO3 30g/L，氮源CO(NH2)2 3g/L，甲烷抑制剂BES 12mM。充分混匀后接种到1L的厌氧发酵瓶中。在温度为39℃条件下，发酵 30d。发酵结束后，通过挤压回收挥发性脂肪酸，将固体产物用烘箱烘干后进行物理预处理。

[0038] (2)物理预处理：取4g步骤(1)得到的干燥固体产物，直接加入到行星式球磨装置中，转速为750rpm，处理时间为120min。将产物直接进行同步糖化发酵产乙醇。将产物直接进行同步糖化发酵产乙醇。

[0039] (3)同步糖化发酵产乙醇：配制培养基：葡萄糖,50g/L；酵母膏,5g/L；蛋白胨,5g/L；MgSO4·7H2O,1g/L；K2HPO4,1g/L。在121℃的高温灭菌锅灭菌30 min，冷却后，将酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)在30℃的条件下，活化24h。活化后，在1000rmp转速下对其进行浓缩20min。将步骤(2)得到的固体产物与乙酸钠缓冲液(pH＝4.8)、培养基、纤维素酶及经活化浓缩后酵母菌培养物混合，总固体浓度为4％。纤维素酶的投加量为30FUP/g底物，浓缩酵母菌以1:10的体积比例与培养基混合。发酵时间为72h后，将发酵液蒸馏获得乙醇。

[0040] (4)实验结果：回收的挥发性脂肪酸同实例一，联合预处理乙醇产量为145.3 mg/g干稻草，较单独球磨处理提高了10.4％(131.6mg/g干稻草)，是未预处理的近2.1倍。如图1所示，总物质转化率分别是单独球磨及未处理的1.6和3.2 倍。

[0041] (5)结论：通过生物和球磨联合预处理的策略可以实现稻草生物质原料清洁能源乙醇的生产及回收有价值的代谢产物挥发性脂肪酸，提高了稻草总物质转化率，达到了有效利用木质纤维素生物质的目的，为清洁能源的工业化生产提供合理的理论依据。