一种利用固定化双酶预处理秸秆的方法

摘要

本发明公开了一种利用固定化双酶预处理秸秆的方法：将秸秆粉碎至80～100目，用稀硫酸进行水解，水解后用水洗净，加入以硅藻土为载体、用吸附法共固定化的纤维素酶和木聚糖酶双酶体系进行酶解。本发明采用可分解纤维素和半纤维素的纤维素酶和木聚糖酶，并采用固定化的方式添加，不仅使得还原糖的含量大大提升，酶固定化后，稳定性也大大增加，并且易从反应中分离，易于控制而且能够反复多次的使用，大大的提高了原料的利用率，为工业生产提供了重要的基础原料，降低了工业生产成本，是实现生物资源循环利用的重要途径之一。

权利要求

1.一种利用固定化双酶预处理秸秆的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将农作物秸秆进行粉碎，过80～100目筛，备用；

（2）上述粉碎后的秸秆，添加质量浓度为1%的稀硫酸溶液，固液比为1:5～10，常温下静置40～60小时，然后，将物料温度升高至100～120℃，处理60～120分钟，得预处理液；

（3）制备共固定化酶：取硅藻土，在55～75℃下活化30～60分钟，然后在浓度为0.1～

0.5mol/L、pH为4.5～5.5的柠檬酸缓冲液中浸泡10～40分钟，再用pH为5～6的缓冲溶液清洗；将上述处理后的硅藻土加入到混合酶液中，所述混合酶液中含有纤维素酶和木聚糖酶，在pH 4.5～6，温度10～30℃条件下处理10～30分钟，即得共固定化酶；

（4）将共固定化酶加入到预处理液中，进行酶解预处理：在温度50～60℃下酶解30～60分钟；过滤去掉秸秆滤渣，得到糖化液。

2.根据权利要求1所述的利用固定化双酶预处理秸秆的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，秸秆粉碎的具体方式为：先经过切割机将秸秆切成1～2cm的小段后，再进入到超微粉碎机粉碎，直至粉碎至80～100目，过筛。

3.根据权利要求1所述的利用固定化双酶预处理秸秆的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，硅藻土、纤维素酶、木聚糖酶三者的用量比例关系为：硅藻土（g）：纤维素酶（U）：木聚糖酶（U）=1：120～150：150～200。

4.根据权利要求1所述的利用固定化双酶预处理秸秆的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，共固定化酶的加入比例为：每10～20ml预处理液加入0.1～0.3g共固定化酶。

说明书

一种利用固定化双酶预处理秸秆的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用固定化双酶预处理秸秆的方法，属于农业固体废弃秸秆的处理技术领域。

背景技术

[0002] 农作物秸秆是自然界蕴藏最丰富的可再生资源，其中含有大量的纤维素和半纤维素，可通过化学方式和生物方式将其分解为单糖，应用于工业生产当中。因此，秸秆木质纤维素的生物转化近些年受到了广泛关注，大规模木质纤维素生物转化工艺的发展，将有效解决或减轻食品和动物饲料的不足、废弃物处理、矿石燃料依赖性等一系列问题。

[0003] 木质纤维素含有的纤维素和半纤维素可在纤维素酶和木聚糖酶作用下转化为以葡萄糖为代表的六碳糖以及以木糖为代表的五碳糖。但是，目前的纤维素酶解的转化率不能达到较高的程度，并且木质纤维素的水解在工业化应用中还存在稳定性差、成本高、回收困难等问题。专利CN106480109 A和CN102719492 A分别采用单一酶和单一酶的固定化对秸秆进行酶解，这样能够使秸秆中的40%左右的纤维素进行酶解，但是秸秆中含30%多的半纤维素中也含有发酵所需的葡萄糖和木糖等单糖，其并没有得到充分利用，并且酶直接添加，稳定性弱，且不能回收利用。

发明内容

[0004] 针对上述现有技术，本发明提供了一种利用固定化双酶预处理秸秆的方法，旨在通过双酶共固定的方法提高酶的专一性及稳定性，大大提高木质纤维素的酶解预处理效率、木质纤维素糖化率。本发明采用可分解纤维素和半纤维素的纤维素酶和木聚糖酶，并采用固定化的方式添加，不仅使得还原糖的含量大大提升，酶固定化后，稳定性也大大增加，并且易从反应中分离，易于控制而且能够反复多次的使用，大大的提高了原料的利用率，为工业生产提供了重要的基础原料，降低了工业生产成本，是实现生物资源循环利用的重要途径之一。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：一种利用固定化双酶预处理秸秆的方法，包括以下步骤：
（1）将农作物秸秆进行粉碎，过80～100目筛，备用；
（2）上述粉碎后的秸秆，添加质量浓度为1%的稀硫酸溶液，固液比为1:5～10（质量比），常温下静置40～60小时，然后，将物料温度升高至100～120℃，处理60～120分钟，得预处理液；
（3）制备共固定化酶：取硅藻土，在55～75℃下活化30～60分钟，然后在浓度为0.1～
0.5mol/L、pH为4.5～5.5的柠檬酸缓冲液中浸泡10～40分钟，再用pH为5～6的柠檬酸缓冲液进行清洗；将上述处理后的硅藻土加入到混合酶液中，所述混合酶液中含有纤维素酶和木聚糖酶（pH为4.5～6）（混合酶液中，除了含有纤维素酶、木聚糖酶外，还含有必要的溶剂和pH调节剂，此为常规技术；纤维素酶、木聚糖酶的浓度按照使用说明添加，本发明对此无特殊要求），在温度10～30℃条件下处理10～30分钟，即得共固定化酶；
（4）将共固定化酶加入到预处理液中，进行酶解预处理：在温度50～60℃下酶解30～60分钟；过滤去掉秸秆滤渣，得到糖化液。

[0006] 进一步地，所述步骤（1）中，秸秆粉碎的具体方式为：先经过切割机将秸秆切成1～2cm的小段后，再进入到超微粉碎机粉碎，直至粉碎至80～100目，过筛。

[0007] 进一步地，所述步骤（3）中，硅藻土、纤维素酶、木聚糖酶三者的用量比例关系为：硅藻土（g）：纤维素酶（U）：木聚糖酶（U）=1：120～150：150～200。

[0008] 进一步地，所述步骤（4）中，共固定化酶的加入比例为：每10～20ml预处理液加入0.1～0.3g共固定化酶。

[0009] 本发明的利用固定化双酶预处理秸秆的方法，将纤维素酶与木聚糖酶用吸附法固定于硅藻土中，大大提高了酶的专一性和高效性，并可大幅提高酶的耐用性，使还原糖浓度明显提升，且酶分子易于回收。本发明将固定的酶应用于秸秆的预处理中，使得酶解后的还原糖转化率为65%以上。采用本发明的方法能够将秸秆在相对较短的时间内迅速分解为单糖，并使得总还原糖转化率在65%以上，转化率高，本发明的方法简单，制作成本低廉，对环境无污染，节约能源，绿色环保。

附图说明

[0010] 图1：还原糖的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0011] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0012] 实施例1 利用固定化双酶预处理秸秆步骤如下：
（1）玉米秸秆先经过切割机切成1～2cm的小段后，再进入到超微粉碎机粉碎，过80目筛，备用；
（2）上述粉碎后的秸秆，添加质量浓度为1%的稀硫酸溶液，固液比为1:5（质量比），常温下静置50小时，然后，将物料温度升高至100℃，处理70分钟，得预处理液；
（3）制备共固定化酶：取硅藻土，在75℃下活化30分钟，然后在浓度为0.3mol/L、pH为5的柠檬酸缓冲液中浸泡30分钟，再用pH为5的缓冲溶液清洗；将上述处理后的硅藻土加入到混合酶液中，所述混合酶液中含有纤维素酶和木聚糖酶，硅藻土、纤维素酶、木聚糖酶三者的用量比例关系为：硅藻土（g）：纤维素酶（U）：木聚糖酶（U）=1：120：150，在pH 5，温度10℃条件下处理20分钟，即得共固定化酶；
（4）将共固定化酶加入到预处理液中，每10ml预处理液加入0.1g共固定化酶，在温度50℃下酶解50分钟；过滤去掉秸秆滤渣，得到糖化液，进行液相色谱分析，其中葡萄糖和木糖的浓度达66.9%。

[0013] 实施例2 利用固定化双酶预处理秸秆步骤如下：
（1）玉米秸秆先经过切割机切成1～2cm的小段后，再进入到超微粉碎机粉碎，过100目筛，备用；
（2）上述粉碎后的秸秆，添加质量浓度为1%的稀硫酸溶液，固液比为1:8（质量比），常温下静置40小时，然后，将物料温度升高至100℃，处理90分钟，得预处理液；
（3）制备共固定化酶：取硅藻土，在55℃下活化60分钟，然后在浓度为0.1mol/L、pH为
5.5的柠檬酸缓冲液中浸泡40分钟，再用pH为6的缓冲溶液清洗；将上述处理后的硅藻土加入到混合酶液中，所述混合酶液中含有纤维素酶和木聚糖酶，硅藻土、纤维素酶、木聚糖酶三者的用量比例关系为：硅藻土（g）：纤维素酶（U）：木聚糖酶（U）=1：150：180，在pH 5.5，温度15℃条件下处理30分钟，即得共固定化酶；
（4）将共固定化酶加入到预处理液中，每12ml预处理液加入0.3g共固定化酶，在温度55℃下酶解60分钟；过滤去掉秸秆滤渣，得到糖化液，进行液相色谱分析，其中葡萄糖和木糖的浓度达65.7%。

[0014] 实施例3步骤如下：
（1）玉米秸秆先经过切割机切成1～2cm的小段后，再进入到超微粉碎机粉碎，过80目筛，备用；
（2）上述粉碎后的秸秆，添加质量浓度为1%的稀硫酸溶液，固液比为1:10（质量比），常温下静置60小时，然后，将物料温度升高至120℃，处理60分钟，得预处理液；
（3）制备共固定化酶：取硅藻土，在65℃下活化40分钟，然后在浓度为0.5mol/L、pH为
4.5的柠檬酸缓冲液中浸泡10分钟，再用pH为5的缓冲溶液清洗；将上述处理后的硅藻土加入到混合酶液中，所述混合酶液中含有纤维素酶和木聚糖酶，硅藻土、纤维素酶、木聚糖酶三者的用量比例关系为：硅藻土（g）：纤维素酶（U）：木聚糖酶（U）=1：150：200，在pH 5，温度
10℃条件下处理10分钟，即得共固定化酶；
（4）将共固定化酶加入到预处理液中，每15ml预处理液加入0.2g共固定化酶，在温度60℃下酶解30分钟；过滤去掉秸秆滤渣，得到糖化液，进行液相色谱分析，其中葡萄糖和木糖的浓度达66.2%。