与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记及其特异性引物对和应用

摘要

本发明涉及动物分子标记技术领域，是一种与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记及其特异性引物对和在中国美利奴羊(新疆型)羊毛弯曲数性状选择中的应用，该与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记，其位于KIAA1109基因17号染色体的第7外显子处。本发明首次公开了将rs160836358 SNP位点作为与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记，首次公开将rs160836358 SNP位点应用于中国美利奴羊羊毛弯曲数性状的选择中；采用与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记对中国美利奴羊(新疆型)进行羊毛弯曲数性状甄选时，具有操作简单高效的优点，可以辅助筛选弯曲数多的绵羊，对于绵羊的育种具有重要意义。

权利要求

1.一种与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记在中国美利奴羊羊毛弯曲数性状选择中的应用，其特征在于所述分子标记为rs160836358 SNP 位点，其位于KIAA1109 基因 17 号染色体的第 7 外显子处，第 7 外显子的核苷酸序列如序列表 SEQ ID No. 1 所示。

2.根据权利要求 1 所述的与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记在中国美利奴羊羊毛弯曲数性状选择中的应用，其特征在于中国美利奴羊为新疆型中国美利奴羊。

3.根据权利要求 2 所述的与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记在中国美利奴羊羊毛弯曲数性状选择中的应用，其特征在于包括如下步骤：第一步，取待检测新疆型中国美利奴羊的基因组 DNA；第二步，以基因组 DNA 为模板，利用特异性引物对进行 PCR 扩增，获得新疆型中国美利奴羊的基于rs160836358 SNP 位点的目的片段，将 PCR 扩增产物进行测序，根据测序结果进行基因分型，当基因型为 AA 基因型时，则待测绵羊属于弯曲数多的新疆型中国美利奴羊优势品种，当基因型为 GG 基因型或 GA 基因型时，待测绵羊属于弯曲数少于 AA 基因型绵羊弯曲数的新疆型中国美利奴羊非优势品种；

其中，特异性引物对包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表 SEQ ID No. 2 和序列表 SEQ ID No. 3 所示，基因座特异性引物的序列如序列表 SEQ ID No. 4 所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表 SEQ ID No. 5 所示。

4.一种特异性引物对在制备体外检测与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于所述特异性引物对包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表 SEQ ID No. 2 和序列表 SEQ ID No. 3 所示，基因座特异性引物的序列如序列表 SEQ ID No. 4 所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表 SEQ ID No. 5 所示。

说明书

与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记及其特异性引物对和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及动物分子标记技术领域，是一种与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记及其特异性引物对，所述特异性引物对作为制备体外检测与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用，所述分子标记在中国美利奴羊羊毛弯曲数性状选择中的应用。

背景技术

[0002] 随着国内外毛纺行业不断更新毛料、布艺的加工，对原材料的羊毛要求更加严格，产品趋势已经向轻薄、柔软的方向发展，世界羊毛品质方面也出现了新的里程碑，毛纺行业对细型和超细型羊毛的需求呈逐步递增趋势。细毛羊在我国畜牧产业中占有重要地位，其主要产品羊毛作为重要的纺织原料，有较高的经济价值。细毛羊的生产不仅关系到产区的经济发展和社会稳定，而且关系到我国毛纺行业的发展以及进出口贸易平衡。

[0003] 目前我国细毛羊生产面临的一个主要问题就是国内细毛羊品种老化，缺少适应当前市场变化需求的新品种。因此寻求一种有效、便捷，并且能够在短时间内加速绵羊育种进程的育种手段便显得尤为重要。而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作为一种有效的分子生物学标记方法已广泛的应用于动物遗传育种领域，主要是指在某种生物不同个体DNA序列中，存在单个核苷酸变异的多态现象，如置换、颠换、缺失、插入。

[0004] 传统的动物遗传育种均是基于表型的选择，例如，在筛选具有优良羊毛弯曲数性状的绵羊育种时，通过测量该绵羊的羊毛弯曲数来决定其是否属于优质种羊，其期望通过表型的直接选择从而间接实现对有利基因型的选择。然而，羊毛重要经济性状为数量性状，是由微效多基因控制的，并受到环境因素的共同影响，鉴于其表型难以度量，遗传基础复杂，很难通过这种传统育种方式取得显著的成效。随着分子生物学、分子遗传学以及生物信息学的发展，以及最新生物技术在遗传育种的各个领域的应用，通过对与毛用性状密切相关的且与QTL(数量性状基因座)紧密连锁的分子标记的选择和主校基因的筛选，达到育种值得提高和早期选种的目的，从而获得较大的遗传进展。

[0005] 目前，羊毛弯曲数的检测根据国家纤维检验标准并依据中华人民共和国农业行业标准NY-1-2004《细毛羊鉴定项目、符号、术语》执行。

[0006] 然而，在选育出羊毛弯曲数较高的种羊时，由上述羊毛弯曲数的检测方法可知，该检测方法步骤繁琐，检测效率低，准确度有待提高，并且检测对象为周岁以上羊，由此提高了选育的成本，包括时间成本和其他的选育成本。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记及其特异性引物对，所述特异性引物对作为制备体外检测与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用，所述分子标记在中国美利奴羊羊毛弯曲数性状选择中的应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有选育毛品品质好的优质绵羊时，存在选育效率较低、选育成本较高的问题。

[0008] 本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记，其位于KIAA1109基因17号染色体的第7外显子处，第7外显子的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

[0009] 本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种用于扩增与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记的特异性引物对，包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

[0010] 本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种技术方案之二所述的特异性引物对作为制备体外检测与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用。

[0011] 本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记在中国美利奴羊羊毛弯曲数性状选择中的应用。

[0012] 下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进：

[0013] 上述中国美利奴羊为新疆型中国美利奴羊。

[0014] 上述包括如下步骤：第一步，取待检测新疆型中国美利奴羊的基因组DNA；第二步，以基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增，获得新疆型中国美利奴羊的基于rs160836358 SNP位点的目的片段，将PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行基因分型，当基因型为AA基因型时，则待测绵羊属于弯曲数多的新疆型中国美利奴羊优势品种，当基因型为GG基因型或GA基因型时，待测绵羊属于弯曲数少于AA基因型绵羊弯曲数的新疆型中国美利奴羊非优势品种；

[0015] 其中，特异性引物对包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

[0016] 本发明首次公开了将rs160836358 SNP位点作为与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记，首次公开了将rs160836358 SNP位点应用于中国美利奴羊羊毛弯曲数性状的选择中；采用与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记对中国美利奴羊(新疆型)进行羊毛弯曲数性状甄选时，具有操作简单，并且由于其从分子标记检测层面着手，因此其能够提高品种甄选的准确度，提高检测效率，并且可自动化检测；另外，能够实现羊毛弯曲数优良品种种羊的早期选种，出生后即可进行选留，从而降低选育成本，加速高品质细毛羊的育种进程。

附图说明

[0017] 附图1为DNA混池测序结果图；基因型为AA型。

[0018] 附图2为DNA混池测序结果图；基因型为AG型。

[0019] 附图3为DNA混池测序结果图；基因型为GG型。

[0020] 附图4为Fluidigm测序分型图结果图：分别为AA型、AG型和GG型；其中，横坐标为FAM的荧光信号，纵坐标为HEX的荧光信号。

具体实施方式

[0021] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。

[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步描述：

[0023] 实施例1：该与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记，其位于KIAA1109基因17号染色体(35163382)的第7外显子处，第7外显子的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

[0024] 与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记为rs160836358 SNP位点。

[0025] 实施例2：该用于扩增与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记的特异性引物对，包括两个等位基因特异性引物(ASP1/ASP2)、一个基因座特异性引物(LSP)和一个特异性靶向扩增引物(STA)，一个等位基因特异性引物(ASP1)的序列如序列表SEQ ID No.2所示，另一个等位基因特异性引物(ASP2)的序列如序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

[0026] 实施例3：实施例2所述的特异性引物对作为制备体外检测与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记的制剂或试剂盒中的应用。

[0027] 实施例4：与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记在中国美利奴羊羊毛弯曲数性状选择中的应用。

[0028] 实施例5：作为上述实施例4的优化，中国美利奴羊为新疆型中国美利奴羊。新疆型中国美利奴羊即中国美利奴羊(新疆型)。

[0029] 实施例6：作为上述实施例4和5的优化，与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记在中国美利奴羊羊毛弯曲数性状选择中的应用，包括如下步骤：第一步，取待检测新疆型中国美利奴羊的基因组DNA；第二步，以基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增，获得新疆型中国美利奴羊的基于rs160836358 SNP位点的目的片段，将PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行基因分型，当基因型为AA基因型时，则待测绵羊属于弯曲数多的新疆型中国美利奴羊优势品种，当基因型为GG基因型或GA基因型时，待测绵羊属于弯曲数少于AA基因型绵羊弯曲数的新疆型中国美利奴羊非优势品种；其中，特异性引物对包括两个等位基因特异性引物、一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

[0030] 通过本实施例所述的步骤可知，采用与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记对中国美利奴羊(新疆型)进行羊毛弯曲数性状品种进行甄选时，具有操作简单，并且由于其从分子标记检测层面着手，因此该方法能够提高检测的准确度，提高检测效率，并且可自动化检测；另外，可实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，从而降低选育成本，加速高品质细毛羊的育种进程。

[0031] 本发明中，所述序列(SEQ ID No.1至SEQ ID No.8)参考绵羊基因组3.1版本。

[0032] 实施例8：于新疆巩乃斯种羊场(472只)和拜城种羊场(469只)采集941只周岁健康的细毛羊母羊，品种为中国美利奴羊(新疆型)。颈静脉采血3至5mL，采用含EDTA抗凝冻存，采用常规酚-氯仿抽提法提取血样中基因组DNA。

[0033] 1 DNA的提取

[0034] 1.1取800μL的绵羊(中国美利奴羊，新疆型)血样加入灭菌后的2mL离心管中(标号)，再加入1000μL的T10E10溶液，上下翻动约10分钟，使红细胞破碎，然后8000r/min低温离心6分钟，使得白细胞沉淀。

[0035] 1.2弃去上清液，加入800μL的T10E1溶液上下翻动冲洗沉淀，然后放入低温离心机中8000r/min低温离心6分钟。

[0036] 1.3弃去上清液，加入500μL的USSTE溶液裂解悬浮，在涡旋机上剧烈震荡5分钟(2000r/min)，再上下翻动10分钟使白细胞破裂。

[0037] 1.4加入400μL(等体积)的Tris平衡酚，抽打混匀，上下翻动10分钟，然后放入低温离心机中10000r/min离心10分钟。

[0038] 1.5吸取400μL的上清液加入新的离心管中，再加入400μL(等体积)的氯仿：异戊醇(24:1)，上下摇动5分钟，直到看不到白色的界面，然后放入低温离心机中10000r/min离心10分钟。

[0039] 1.6吸取300μL的上清液加入新的离心管中，再加入600μL(2倍体积)的冷无水乙醇，上下摇动2分钟，然后放入低温离心机中12000r/min离心10分钟。

[0040] 1.7弃去上清液，加入500μL的70％乙醇浸洗，上下轻翻动2分钟，然后放入低温离心机中12000r/min离心10分钟，弃去液体。

[0041] 1.8重复第7步。

[0042] 1.9弃去上清液，无菌台内室温干燥40至60分钟，待离心管中无任何液体后加入70μL的T10E1溶液，在涡旋仪上振荡两次后，放入4℃冰箱中过夜使其充分溶于液体当中，然后放入-20℃的冰箱长期保存。

[0043] 2基因组DNA浓度及纯度的检测

[0044] 所提取的DNA溶液取2μL，使用NanoDrop 2000分光光度仪检测所提DNA的浓度及纯度，DNA的样本浓度需大于50ng/μL，纯度OD260/OD280值在1.6至1.8之间且OD260/OD230在1.8至2.1之间的DNA样本为合格的样本。

[0045] 为了确保DNA样本浓度的准确性，每个样本需要连续测定两次，若两次测定的值相差不大则表明样本合格可以留用，不合格的DNA样本则需要重新提取，直到样本的浓度以及纯度全部达到实验所需要的标准为止。

[0046] 3基因组DNA完整性的检测

[0047] 所有提取的DNA样本各取3μL与2μL的6×Loading buffer混匀，加入含有核酸染料的1％的琼脂糖凝胶电泳，以D2000作为Marker标记产物片段大小进行检测，0.5×TBE电泳缓冲液，110V，25分钟，电泳结果在凝胶电泳成像仪中检测。

[0048] 4 SNP位点及基因分型

[0049] 4.1 rs160836358 SNP位点

[0050] 针对绵羊KIAA1109基因的各个外显子、绵羊KIAA1109基因上游1000bp的调控区以及绵羊KIAA1109基因下游1000bp的调控区设计若干引物对，分别对绵羊群体中的每个个体进行PCR扩增并测序，发掘SNP位点并对SNP位点与细毛羊羊毛弯曲数性状进行关联分析。

[0051] 通过上述大量试验，得到特异引物对如下：

[0052] 上游引物F的序列如序列表SEQ ID No.6所示：5’-aaaactggcc atttcatatg gtctc-3’；

[0053] 下游引物R的序列如序列表SEQ ID No.7所示：5’-acgtcctcct attgatccct ca-3’。

[0054] 在941只中国美利奴羊(新疆型)试验群体中，选取其中30个个体的血液DNA样本，以相同浓度组成混池DNA，采用F和R组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。对测序峰图进行分析，结合细毛羊毛用性状全基因组关联分析，找到了一个与细毛羊羊毛弯曲数性状显著相关SNP位点rs160836358，如图1至图3所示。

[0055] rs160836358 SNP位点位于KIAA1109基因17号染色体(35163382)的第7外显子处。中国美利奴羊(新疆型)基因组中rs160836358 SNP位点周边的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.8所示，该SNP位点由G突变A，发生错义突变。

[0056] 4.2基因分型

[0057] (1)Fluidigm的SNP检测技术步骤：

[0058] 将上述选择的SNP序列(rs160836358)提交给Fluidigm SNP Type Assay Design网站设计合成探针和引物，为SNP设计了四个引物，包括两个等位基因特异性引物和一个基因座特异性引物和一个特异性靶向扩增引物，两个等位基因特异性引物的序列分别如序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示，基因座特异性引物的序列如序列表SEQ ID No.4所示，特异性靶向扩增引物的序列如序列表SEQ ID No.5所示。

[0059] (2)基因分型检测：

[0060] 步骤一：准备SNPtype Assay Mixes。将3μL SNPtype Assay ASP1/ASP2和8μL SNPtype Assay LSP预混合并用29μL DNA悬浮液稀释以制备40μL的SNPtype Assay Mixes。

[0061] 步骤二：准备10X Assays(用于192*24芯片)。每个反应3μL，包含0.6μL的SNPtype Assay Mixes，1.5μL的2X Assay Loading Reagent和0.9μL ddH2O水。

[0062] 步骤三：准备Sample Mix(用于192*24芯片)。每个样品3μL，包含1.492μL的Biotium 2X Fast Probe Master Mix，0.149μL的20X SNPtype Sample Loading Reagent，0.05μL的60X SNPtype Reagent，0.018μL的ROX，0.032μL ddH2O水和1.26μL DNA。

[0063] 步骤四：分装3μL Assay mix和3μL Sample mix到对应的孔中。

[0064] PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火45s，72℃延伸15s，共38个循环并收集荧光信号，冷却至20℃30s。

[0065] 基因分型检测仪器采用Fluidigm BioMark HD基因分析系统，导出原始数据，用“Fluidigm SNP Genotyping Analysis”软件进行基因分型分析。试剂和耗材见表1，分型结果如图4所示，红色为AA型，蓝色为AG型，绿色为GG型。

[0066] (3)本发明中的941只中国美利奴羊均为新疆型周岁母羊，共检测到3种基因型，由表2可知，GA型为优势基因型，G等位基因为优势等位基因。χ2检验表明，该SNP位点在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。

[0067] (4)对绵羊基于rs160836358 SNP位点G/A单碱基突变的3种基因型与中国美利奴羊(新疆型)试验群体941个个体的羊毛弯曲数进行最小二乘分析。

[0068] 根据中国美利奴羊(新疆型)实验群体的特点，运用SAS 9.1软件的GLM过程进行基因型与弯曲数之间的关联分析，关联分析结果见表3，模型如下：Yijl＝μ+gi+cj+ql+eijl。

[0069] 其中，Yijl为性状的观测值；μ为群体均值；gi为基因型效应；cj为场效应；ql为群别效应；eijl为随机残差。

[0070] 表3中，均值比较时，同行不同大写字母表示差异极显著，即P＜0.01；同行不同小写字母表示差异极显著，即P＜0.05。

[0071] 羊毛弯曲数的检测根据国家纤维检验标准并依据中华人民共和国农业行业标准NY-1-2004《细毛羊鉴定项目、符号、术语》执行。

[0072] 对羊体左侧中线与肩胛骨后一掌缘相交处的毛样进行弯曲数的测定。

[0073] 羊毛弯曲数是指：被测纤维在轻负荷张力的情况下，记录25mm内的弯曲个数，两个相邻的波峰或波谷为一个弯曲，单位是(弯曲个数/25mm)。

[0074] 检测方法：(1)抽取完整的羊毛单纤维。放置黑绒布上，一端用厚玻璃板压住固定，用镊子夹住另一端轻微用力在保持弯曲状态的情况下，使其伸展并用厚玻璃板压住另一端。(2)用自制的刻有宽度为25mm凹槽塑料板比对羊毛纤维，同时可借助放大镜观察纤维弯曲并记录弯曲数。

[0075] 表3结果表明，基于rs160836358 SNP位点不同基因型多态性对中国美利奴羊(新疆型)试验群体的羊毛弯曲数有显著影响，P值为0.0290；再对3种基因型间的最小二乘均值进行多重比较，具有AA基因型群体的羊毛弯曲数显著高于GG基因型群体和GA基因型群体(P<0.05)，AA基因型可以作为绵羊早期分子育种的分子标记。

[0076] 综上所述，本发明首次公开了将rs160836358 SNP位点作为与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记，首次公开了将rs160836358 SNP位点应用于中国美利奴羊羊毛弯曲数性状的选择中；采用与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记对中国美利奴羊(新疆型)进行羊毛弯曲数性状甄具有操作简单的优点，并且由于其从分子标记检测层面着手，因此其能够提高品种甄选的准确度，提高检测效率，并且可自动化检测；另外，能够实现羊毛弯曲数优良品种种羊的早期选种，出生后即可进行选留，从而降低选育成本，加速高品质细毛羊的育种进程。

[0077] 以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

[0078] 表1试剂和耗材

[0079]

[0080] 表2 SNP基因型在所研究群体中的基因频率及等位基因频率

[0081]

[0082] 表3基于rs160836358 SNP位点不同基因型与羊毛弯曲数的关联分析[0083]