奥硝唑纯度标准物质及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了奥硝唑纯度标准物质及其制备方法与应用。它的制备方法，包括如下步骤：1)对奥硝唑原料粉末取样，采用高效液相色谱面积归一化法测定其含量，得到奥硝唑原料粉末的纯度定值；2)测定奥硝唑原料粉末中水、非挥发性杂质和有机挥发性杂质的质量百分含量，按照公式Ⅰ计算，得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值1，记为PHPLC-AN；PHPLC-AN＝P0×[100％-Xw-Xn-Xv]公式Ⅰ；3)取奥硝唑原料粉末采用定量核磁法测定其含量，得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值2，记为PNMR；4)计算PHPLC-AN和PNMR的平均值，即得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值。本发明能作为标准物质用于畜禽产品中药物残留的检测，为国家农产品质量安全风险评估与监测溯源体系的建立提供技术支持与物质保证。

权利要求

1.奥硝唑纯度标准物质的制备方法，包括如下步骤：

1)对奥硝唑原料粉末取样，采用高效液相色谱面积归一化法测定所述奥硝唑原料粉末中奥硝唑的质量百分含量，得到所述奥硝唑原料粉末的纯度定值；

2)测定所述奥硝唑原料粉末中水分质量百分含量、非挥发性杂质质量百分含量和有机挥发性杂质质量百分含量，结合步骤1)中测定的所述奥硝唑原料粉末的纯度定值，按照如下公式Ⅰ计算，得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值1，记为PHPLC-AN；

PHPLC-AN＝P0×[100％-Xw-Xn-Xv]公式Ⅰ；

其中，P0为奥硝唑原料粉末的纯度定值，Xw为水分质量百分含量，Xn为非挥发性杂质质量百分含量，Xv为有机挥发性杂质质量百分含量；

3)取所述奥硝唑原料粉末采用定量核磁法，测定所述奥硝唑原料粉末中奥硝唑的质量百分含量，得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值2，记为PNMR；

4)计算所述奥硝唑纯度标准物质的纯度定值1和所述奥硝唑纯度标准物质的纯度定值

2的平均值，即得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中还包括对所述奥硝唑原料粉末取样采用JJG 1006-1994《一级标准物质技术规范》的要求采用方差分析法进行均匀性检验的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中还包括对所述奥硝唑原料粉末取样采用直线拟合法进行稳定性检验的步骤。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱面积归一化法的色谱条件如下：色谱柱：SB-aq(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：由乙腈和乙酸水溶液组成，乙腈与乙酸水溶液的体积份数比为13:87，乙酸水溶液中的乙酸与水的体积份数比为0.001:100；进样量：20μL；UV波长：312nm；

所述奥硝唑原料粉末测定时配制为100～500mg/L的奥硝唑甲醇溶液。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述定量核磁法采用内标法，所述奥硝唑纯度标准物质的纯度定值2按照如下公式Ⅱ进行计算：式Ⅱ中：PNMR为采用核磁共振法测得的被测物的纯度；

Ix为所述奥硝唑原料粉末指定峰的积分面积；

Istd为内标物指定峰的积分面积；

nstd为内标物指定峰的核群核个数；

nx为所述奥硝唑原料粉末指定峰的核群核个数；

Mx—所述奥硝唑原料粉末的分子量；

Mstd—内标物的分子量；

mstd—添加的内标物的质量；

mx—所述奥硝唑原料粉末的称样量；

Pstd—内标物的纯度。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：采用卡尔费休法测定所述奥硝唑原料粉末中的水分含量；

所述奥硝唑原料粉末中非挥发性杂质质量百分含量采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法、微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法和离子色谱法测定；所述微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定非挥发性杂质中的As、Se、Cd、Mn、Sn、Li、Cr、Cs、Ni、Pb、Sr、Rb、Ti和Ba中至少一种的含量；所述微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法测定所述非挥发性杂质中的Cu、Ca、Mg、K、Na、P、Mn、Mo、Zn、Fe和Co中至少一种的含量；所述离子色谱法测定氯离子、硝酸根离子和硫酸根离子的含量；

采用顶空气相色谱测定所述奥硝唑原料粉末中所述有机挥发性杂质质量百分含量。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：步骤2)中还包括对奥硝唑纯度标准物质的定值进行不确定度分析的步骤。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法得到的定值的所述奥硝唑纯度标准物质。

9.根据权利要求8所述奥硝唑纯度标准物质，其特征在于：所述奥硝唑纯度标准物质的质量百分含量的纯度定值为99.9％。

10.权利要求8或9所述奥硝唑纯度标准物质在如下1)-6)任一项中的应用：

1)作为标准物质应用于农产品生产流通领域中兽药和/或饲料产品中奥硝唑成分检测；

2)食品领域中畜禽产品中奥硝唑药物残留检测；

3)检测实验室质量控制；

4)作为标准物质对分析仪器校准；

5)分析方法确认评价；

6)对给定材料赋值。

说明书

奥硝唑纯度标准物质及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及奥硝唑纯度标准物质及其制备方法与应用，属于化学计量中标准量值传递技术领域。

背景技术

[0002] 禁限用药物在畜牧养殖过程中滥用情况严重，由于其具有较强的毒副作用和毒性作用，且在动物组织中的残留会通过食物链传给人类，长期微量摄入会引起多种疾病，对人类的健康造成危害。禁限用药物已成为农业部农产品质量安全风险评估与监测活动的重要参数，为保证测量结果的一致性、可比性、可溯源性以及量值的准确可靠，急需配套相应的标准物质。

[0003] 奥硝唑中文别名奥尼达唑，英文名称：Ornidazole，主要用做抗厌氧菌及抗原虫药。CAS：16773-42-5。分子式C7H10ClN3O3。相对分子量219.63，熔点86-90℃，沸点443.2℃。为白色至微黄色粉末，无臭，味苦，在甲醇、乙醇中易溶，在水中略溶。储存条件：2-8℃。为第三代硝基咪唑类衍生物，其发挥抗微生物作用的机理可能是：通过其分子中的硝基，在无氧环境中还原成氨基或通过自由基的形成，与细胞成分相互作用，从而导致微生物死亡。奥硝唑的分子结构式如式1所示。

[0004]

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供奥硝唑纯度标准物质及其制备方法与应用，本发明能作为标准物质用于畜禽产品中药物残留的检测，为国家农产品质量安全风险评估与监测溯源体系的建立提供技术支持与物质保证。

[0006] 本发明提供的奥硝唑纯度标准物质的制备方法，包括如下步骤：

[0007] 1)对奥硝唑原料粉末取样，采用高效液相色谱面积归一化法测定所述奥硝唑原料粉末中奥硝唑的质量百分含量，得到所述奥硝唑原料粉末的纯度定值；

[0008] 2)测定所述奥硝唑原料粉末中水分质量百分含量、非挥发性杂质质量百分含量和有机挥发性杂质质量百分含量，结合步骤1)中测定的所述奥硝唑原料粉末的纯度定值，按照如下公式Ⅰ计算，得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值1，记为PHPLC-AN；

[0009] PHPLC-AN＝P0×[100％-Xw-Xn-Xv]公式Ⅰ；

[0010] 其中，P0为奥硝唑原料粉末的纯度定值，Xw为水分质量百分含量，Xn为非挥发性杂质质量百分含量，Xv为有机挥发性杂质质量百分含量；

[0011] 3)取所述奥硝唑原料粉末采用定量核磁法，测定所述奥硝唑原料粉末中奥硝唑的质量百分含量，得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值2，记为PNMR；

[0012] 4)计算所述奥硝唑纯度标准物质的纯度定值1和所述奥硝唑纯度标准物质的纯度定值2的平均值，即得到奥硝唑纯度标准物质的纯度定值。

[0013] 上述的方法中，步骤1)中还包括对所述奥硝唑原料粉末取样采用JJG 1006-1994《一级标准物质技术规范》的要求采用方差分析法进行均匀性检验的步骤。

[0014] 上述的方法中，步骤1)中还包括对所述奥硝唑原料粉末取样采用直线拟合法进行稳定性检验的步骤；所述稳定性检验根据JJG1006-1994《一级标准物质技术规范》中的要求进行。

[0015] 上述的方法中，所述高效液相色谱面积归一化法的色谱条件如下：

[0016] 色谱柱：SB-aq(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：由乙腈和乙酸水溶液组成，乙腈与乙酸水溶液的体积份数比为13:87，乙酸水溶液中的乙酸与水的体积份数比为0.001:100；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；UV波长：312nm；

[0017] 所述奥硝唑原料粉末测定时配制为100～500mg/L的奥硝唑甲醇溶液。

[0018] 本发明中，HPLC：岛津LC-20A系统。

[0019] 上述的方法中，所述定量核磁法采用内标法，所述奥硝唑纯度标准物质的纯度定值2按照如下公式Ⅱ进行计算：

[0020]

[0021] 式Ⅱ中：PNMR为采用核磁共振法测得的被测物的纯度；

[0022] Ix为所述奥硝唑原料粉末指定峰的积分面积；

[0023] Istd为内标物指定峰的积分面积；

[0024] nstd为内标物指定峰的核群核个数；

[0025] nx为所述奥硝唑原料粉末指定峰的核群核个数；

[0026] Mx—所述奥硝唑原料粉末的分子量；

[0027] Mstd—内标物的分子量；

[0028] mstd—添加的内标物的质量；

[0029] mx—所述奥硝唑原料粉末的称样量；

[0030] Pstd—内标物的纯度。

[0031] 本发明中，所述内标物为苯甲酸。

[0032] 上述的方法中，采用卡尔费休法测定所述奥硝唑原料粉末中的水分含量；

[0033] 所述奥硝唑原料粉末中非挥发性杂质质量百分含量采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法、微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法和离子色谱法测定；所述微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定非挥发性杂质中的As、Se、Cd、Mn、Sn、Li、Cr、Cs、Ni、Pb、Sr、Rb、Ti和Ba中至少一种的含量；所述微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法测定所述非挥发性杂质中的Cu、Ca、Mg、K、Na、P、Mn、Mo、Zn、Fe和Co中至少一种的含量；所述离子色谱法测定氯离子、硝酸根离子和硫酸根离子的含量；

[0034] 采用顶空气相色谱测定所述奥硝唑原料粉末中所述有机挥发性杂质质量百分含量。

[0035] 上述的方法中，步骤2)中还包括对奥硝唑纯度标准物质的定值进行不确定度分析的步骤。

[0036] 本发明还提供了上述的方法得到的定值的所述奥硝唑纯度标准物质。

[0037] 本发明中，所述奥硝唑纯度标准物质的质量百分含量的纯度定值为99.9％。

[0038] 本发明进一步提供了所述奥硝唑纯度标准物质在如下1)-6)任一项中的应用：

[0039] 1)作为标准物质应用于农产品生产流通领域中兽药和/或饲料产品中奥硝唑成分检测；

[0040] 2)食品领域中畜禽产品中奥硝唑药物残留检测；

[0041] 3)检测实验室质量控制；

[0042] 4)作为标准物质对分析仪器校准；

[0043] 5)分析方法确认评价；

[0044] 6)对给定材料赋值。

[0045] 本发明具有以下优点：

[0046] 本标准物质候选物通过订购相应的市售标准品，并根据其理化特性减压干燥处理，充分摇匀，经定性与初步分析满足要求后，干燥条件下分装。采用液相色谱-面积归一化法(UV检测器)和定量核磁法两种不同原理的方法对标准物质的纯度进行定值，通过使用满足计量学特性要求的制备方法、测量方法和计量器具，保证标准物质特性量值的溯源性。

附图说明

[0047] 图1为本发明奥硝唑纯度标准物质6个月稳定性监测结果。

[0048] 图2为本发明阿昔洛韦短期稳定性监测结果，其中图2(a)为20℃条件下短期稳定性结果，图2(b)为40℃条件下短期稳定性结果，图2(c)为60℃条件下短期稳定性结果。

[0049] 图3为本发明不同浓度条件下奥硝唑色谱图，其中图3(a)为100mg/L的奥硝唑甲醇溶液的色谱图，图3(b)为500mg/L的奥硝唑甲醇溶液。

[0050] 图4为本发明甲醇空白与奥硝唑候选物样品的色谱图，其中图4(a)为甲醇空白的色谱图，图4(b)为奥硝唑候选物样品的色谱图。

[0051] 图5为非挥发性杂质含量测，其中图5(a)为氯离子的标准曲线，图5(b)为硝酸根的标准曲线，图5(c)为硫酸根离子的标准曲线。

[0052] 图6为奥硝唑(2000mg/L)的离子色谱图。

[0053] 图7为奥硝唑中挥发性杂质含量测定，其中图7(a)为奥硝唑顶空色谱图，图7(b)为空气空白的顶空色谱图，图7(c)为奥硝唑与单标对比的顶空气相色谱图。

[0054] 图8为奥硝唑的定量核磁谱图，其图8(a)为奥硝唑的定量核磁谱图(1H-NMR谱)，图1
8(b)为苯甲酸标准物质的定量核磁谱图(H-NMR谱)，图8(c)为奥硝唑和内标混合后的定量核磁谱图(1H-NMR谱)。

[0055] 图9为奥硝唑纯度标准物质定值不确定度来源分析及评定流程图。

具体实施方式

[0056] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0057] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0058] 下述实施例中，标准物质候选物奥硝唑购于TCI公司，批号为Lot SFHEL，标签纯度为99.9％(HPLC)和99.9％(Nonaqueous Titration)，候选物的包装规格为25g。分别定性和纯度初步确认后，采用液相色谱法(紫外检测器，UV)进行标准物质均匀性初步检验，减压干燥后，将充分混合好的奥硝唑候选物分装至5.0mL干净的西林瓶中，每个包装100mg，共436瓶。低温(4℃)、避光储存。

[0059] 实施例1、奥硝唑纯度标准物质的定值

[0060] 本发明奥硝唑纯度标准物质的定值步骤如下：

[0061] 1、均匀性检验

[0062] 根据JJG 1006-1994《一级标准物质技术规范》的要求，对标准物质进行了均匀性检验。本发明采用方差分析法统计检验奥硝唑纯度标准物质的均匀性，从分装的奥硝唑中随机抽取15个包装，每个包装取平行三次，重量-容量法配制100mg/L甲醇溶液，采用定值时的条件，液相色谱-面积归一化法检验，获得的均匀性数据与统计结果如表1所示。

[0063] 表1奥硝唑纯度标准物质均匀性检验结果(％)

[0064]

[0065] 根据表1数据，对均匀性检验的数据进行统计分析，结果 对均匀性标准偏差sH计算如下：

[0066]

[0067] 2、稳定性考察

[0068] (1)长期稳定性考察

[0069] 根据JJG1006-1994《一级标准物质技术规范》中的要求，标准物质稳定性考察按照先密后疏的原则。本发明从2016年2月开始，采用液相色谱法分别在第0、1、3、6个月进行稳定性考察。每次抽取2个包装，采用重量-容量法配制溶液，每个包装平行测定3次，稳定性检验结果如表2和图1所示。由表2和图1可知，本纯度标准物质在4℃避光保存的条件下，六个月纯度量值稳定。

[0070] 表2奥硝唑纯度标准物质长期稳定性监测结果(％)

[0071]

[0072] (2)短期稳定性考察

[0073] 将样品置于20℃、40℃和60℃恒温箱中(模拟运输条件)保存，分别在第1、3、5、7、9天进行稳定性监测，检测方法与长期稳定性监测相同。采用趋势分析进行数据考察，结果如表3和图2所示。由表3和图2结果显示，本标准物质在60℃及以下的运输条件下9天内可保证纯度量值稳定。

[0074] 表3奥硝唑纯度标准物质短期稳定性考察结果(％)

[0075]

[0076]

[0077] 综上所述，环丙沙星标准物质6个月长期稳定性良好，在20℃、40℃、60℃的模拟运输温度、9天的运输时间条件下特性量值稳定。

[0078] 3、标准物质定值

[0079] (1)纯度定值：液相色谱-面积归一化法

[0080] 按照“国家一级标准物质技术规范”，奥硝唑标准物质定值采用液相色谱-面积归一化法和核磁定量法两种方法。

[0081] 面积归一化法包括采用HPLC-UV法进行奥硝唑主组分含量测定，采用卡尔费休库伦法进行候选物中水分含量测定，采用ICP-MS和离子色谱法进行非挥发性杂质含量测定，采用顶空气相色谱法进行挥发性杂质含量测定。核磁定量法采用苯甲酸为内标，选择合适的共振峰内标定量。对奥硝唑纯度标准物质的不确定度进行了来源分析和系统的评定。

[0082] 配制100mg/L和500mg/L的奥硝唑甲醇溶液，在同一色谱条件下分别进样(具体见下述奥硝唑液相色谱定值条件)。如图3所示，通过图3比较发现，高浓度条件下杂质的信噪比提高，并且有更多的杂质响应，而且在甲醇溶液中奥硝唑的最大浓度为500mg/L。因此，选用500mg/L的奥硝唑甲醇溶液做进一步的色谱条件优化。

[0083] 奥硝唑液相色谱定值条件如下：

[0084] 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-aq(250mm×4.6mm,5.0μm)；由乙腈和乙酸水溶液组成，乙腈与乙酸水溶液的体积份数比为13:87，乙酸水溶液中的乙酸与水的体积份数比为0.001:100；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；UV波长：312nm；HPLC：岛津LC-20A系统。

[0085] 如图4所示，通过比较甲醇空白与奥硝唑候选物样品的色谱图，以确定主成分与杂质。

[0086] 实验选取7个包装单元，每个包装取样量为25mg，用甲醇配制为50mL溶液，配制浓度为500mg/mL。在优化好的液相色谱条件下测定奥硝唑主成分纯度，测定三次取平均值，结果表4所示。

[0087] 表4奥硝唑主成分面积归一化法含量测定结果(％)

[0088]

[0089] (2)杂质含量的测定

[0090] 1)水分含量测定

[0091] 对实验选取的用于定值的7个包装单元采用METTLER TOLEDO DL39串联METTLER TOLEDO Stromboli仪，依国标(GB/T606化学试剂水分测定通用法卡尔-费休法)测定水分，测三次取平均值，结果如表5所示。

[0092] 表5奥硝唑水分含量测定结果(％)

[0093]

[0094] 2)非挥发性杂质含量测定

[0095] 2)-1电感耦合等离子体质谱法

[0096] 本发明采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法(Microwave-assisted ICP-MS)检测奥硝唑纯度标准物质中的As,Se,Cd,Mn,Sn,Li,Cr,Cs,Ni,Pb,Sr,Rb,Ti,Ba含量，具体实验过程如下。

[0097] 实验仪器及试剂：

[0098] 电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)赛默飞世尔有限公司ICP-MS X series 2，万分之一分析天平，纯度>99.99％高纯氩气，CEM微波消解仪(MARS SYSTEM)，超纯水，硝酸(优级纯)，双氧水(优级纯)，As,Se,Cd,Mn,Mo,Co,Cu,Cs,Ni,Pb,Sr,Rb,Ti,Ba混合标准溶液(10mg/L)。

[0099] 实验方法：

[0100] 标准工作曲线的建立：标准工作曲线的制作通过配置不同浓度的混标溶液(0.01ppm、0.1ppm、1.0ppm、10.0ppm、50.0ppm)。

[0101] 内标液(In 114)：以超纯水作介质，配成溶液浓度为1μg/L。

[0102] 样品前处理：微波消解法。称取均匀干样0.100g，精确至0.0001g，于55mL消解管中，加5mL硝酸，浸泡过夜，加入1mL双氧水，盖上溶样盖，置于高压罐内，再放入微波溶样装置内，设置微波系统消解程序，开始消解试样。消解完全结束后，取出内罐，放置于赶酸仪上，以100℃加热赶酸至溶液剩余1mL，取下冷却至室温，用水转移入10mL容量瓶中，定容，混匀备用。同时做试剂空白。仪器条件：雾化器流量1.02L/min；吹扫次数45次；辅助气流量0.80L/min；冷却气流量13L/min。

[0103] 2)-2电感耦合等离子体发射光谱法

[0104] 本发明采用微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法(Microwave-assisted ICP-AES)检测奥硝唑纯度标准物质中的Cu,Ca,Mg,K,Na,P,Mn,Mo,Zn,Fe,Co含量，实验过程如下。

[0105] 实验仪器及试剂：电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)上海聚光科技仪器公司ICP-5000，万分之一分析天平，纯度>99.99％高纯氩气，空气压缩机，循环冷却水，CEM微波消解仪(MARS SYSTEM)，超纯水，硝酸(优级纯)，双氧水(优级纯)，Cu,Ca,Mg,K,Na,P,Mn,Mo,Zn,Fe,Co标准溶液(100mg/L)

[0106] 实验方法：

[0107] 标准工作曲线的建立：标准工作曲线的制作通过配置不同浓度的混标溶液(0.1ppm、1.0ppm、5.0ppm、10.0ppm)。

[0108] 样品前处理：微波消解法。称取均匀干样0.100g，精确至0.0001g，于55mL消解管中，加5mL硝酸，浸泡过夜，加入1mL双氧水，盖上溶样盖，置于高压罐内，再放入微波溶样装置内，设置微波系统消解程序，开始消解试样。消解完全结束后，取出内罐，放置于赶酸仪上，以100℃加热赶酸至溶液剩余1mL，取下冷却至室温，用水转移入10mL容量瓶中，定容，混匀备用。同时做试剂空白。仪器条件：水平观测方式；冲洗泵速100rpm；RF功率：1150w；分析泵速50rmp；雾化器流量0.6SLM；分析时间25s；辅助气流量1.0SLM；冷却气流量12SLM。

[0109] 通过以上两种方法测得的奥硝唑中各个元素的含量见表6所示。

[0110] 表6奥硝唑纯度标准物质中非挥发性无机元素杂质测定结果

[0111]

[0112]

[0113] 2)-3离子色谱法

[0114] 仪器与试剂：

[0115] ICS-3000型离子色谱仪(美国Dionex公司)，配有EG40淋洗液自动发生器、电导检测器和Chromeleon 6.80色谱工作站；Ionpac AS11-HC型分离柱(250mm×4mm)；Ionpac AG11-HC型保护柱(50mm×4mm)；ASRS-ULTRA阴离子抑制器；OnGuard RP柱(美国Dionex公司)，0.45过滤膜(Milipore公司)；超纯水系统(Pine-Tree公司)；KQ100-DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

[0116] 亚硝酸钠和己酸等其他有机酸盐标准样品为Sigma公司高纯试剂，所用溶液均用电阻率为18.2MΩ·cm超纯水配制，。

[0117] 色谱条件：

[0118] 色谱柱：IonPac AS11-HC型分离柱(250mm x4mm)，IonPac AG11-HC型保护柱(50mm×4mm)；流动相：15mM KOH等度淋洗18min；流速：1.0ml/min；抑制器再生模式：外加水电抑制；电导检测器检测；进样量：25μL。以峰面积定量。

[0119] 实验结果：

[0120] 配制氯离子、硝酸根离子和硫酸根离子的标准曲线，标准曲线如图5所示，测定数据如表7所示。

[0121] 表7离子色谱标准溶液配制浓度及测定结果

[0122]标准溶液浓度/ppm 氯离子峰面积 硝酸根峰面积 硫酸根峰面积
0.1 0.036 0.019 0.0852
0.5 0.0984 0.0581 0.1374
1 0.1743 0.1134 0.2018
5 0.9316 0.6301 0.8015
10 1.9381 1.3298 1.7156
20 3.9721 2.7854 3.4592

[0123] 奥硝唑(2000mg/L)的离子色谱图如图6所示，积分结果计算得出奥硝唑纯品中氯离子含量为0.00601％，硝酸根离子在检出限以下，硫酸根离子含量为0.000341％。

[0124] 综上所述，奥硝唑中非挥发性杂质含量共为0.00935％。

[0125] 3)挥发性杂质含量测定

[0126] 奥硝唑合成过程中，不可避免会用到有机溶剂。为了验证纯品中是否存在有机溶剂残留，实验采用顶空气相色谱进行奥硝唑纯品中有机挥发性成分的检测。

[0127] 主要仪器与试剂：Agilent 6890型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器(FID)(美国Agilent公司)，Agilent 1888型顶空自动进样仪(美国Agilent公司)，10mL顶空瓶美国Agilent公司)，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷标准物质(中国计量科学研究院)。

[0128] 仪器工作条件：色谱柱：DB-624(60m×0.25mm，1.40μm)；载气流速：氢气40ml/min、空气400ml/min；程序升温条件：初始45℃保持5min，以每分钟7℃的速率升温至120℃，以每分钟15℃的速率升温至230℃，保持15min。进样量：1mL，分流比：不分流。

[0129] 加热箱：70℃；环路：90℃；传输线：110℃

[0130] 实验步骤：分别取10μL甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷溶液标准物质分别溶于990μL纯水中并准确记录其质量，置于顶空瓶中立即用压盖器封好制备单标，待测定。分别称取50.00mg(精确至0.01mg)奥硝唑于10mL顶空瓶中立即用压盖器封好，待测定。

[0131] 在以上的实验条件下进行样品及单标的测定，实验结果如表8和图7所示。

[0132] 表8单标的质量与含量记录表

[0133]

[0134]

[0135] 根据保留时间以及与单标和空气空白对比得出奥硝唑候选物中含有甲醇、乙腈两种挥发性杂质，通过峰面积与含量之间的关系来确定甲醇、乙腈的含量，结果如下表9所示，检测结果显示：奥硝唑中挥发性杂质为甲醇和乙腈，但是含量很低，对奥硝唑纯度的定值结果影响极小，故可以忽略。

[0136] 表9奥硝唑中挥发性杂质及其含量

[0137]

[0138] 4)奥硝唑纯度标准物质的定值结果

[0139] 液相色谱-面积归一化法(High performance liquid chromatography-area normalization method,HPLC-AN)纯度定值公式如下：

[0140] PHPLC-AN＝P0×[100％-Xw-Xn-Xv]×100％。

[0141] 其中，P0为奥硝唑原料粉末的纯度定值，Xw为水分含量，Xn为非挥发性杂质含量，Xv为挥发性杂质含量。

[0142] 对7瓶分装后奥硝唑候选物采用液相色谱-面积归一化法定值结果如表10所示。

[0143] 表10奥硝唑面积归一化法定值结果(％)

[0144]

[0145]

[0146] (2)纯度定值：定量核磁法

[0147] 核磁共振仪器：核磁型号:AvanceⅢ400MHz，1H NMR测定参数：激发脉冲角度90°，采样时间3.9846s，扫描宽度：8223.43Hz，弛豫延迟60s，累计采样16次，探头温度293.4K，偏置频率：2464.5137Hz，接收增益64.00，脉冲序列zg30；电子天平：UMX2，瑞士Mettler Toledo公司(分度值：0.1μg)；氘代试剂：氘代甲醇(美国sigma公司)；核磁用内标：苯甲酸(美国NIST标准物质，SRM-350b，质量分数为99.9978％±0.0044％)。

[0148] 1H-NMR测试条件：

[0149] 激发脉冲角度30度，采样时间3.9846s，扫描宽度：8223.43Hz，弛豫延迟60s，累计采样128次，探头温度293.4K，偏置频率：2464.5137Hz，接收增益64.00，脉冲序列zg30。采样前，经过自动调谐和自动匀场，然后手动调谐和匀场，最后自动调节增益。谱宽20.00ppm,图谱中心位于8.0ppm,纵向弛豫为8.5s。采样结束后，用氘代甲醇定标。利用窗函数(exponential multiplication)优化，线宽因子0.1。

[0150] 样品的制备：取出保存在4℃的奥硝唑样品，放置在室温条件下，使样品的温度上升至室温。使用精确度为0.01mg的电子天平分别准确称量20mg奥硝唑和10mg内标物苯甲酸(内标物)置于同一玻璃小瓶中，然后将其溶解在氘代甲醇(0.75ml)中。用超声波超声15分钟促进其完全溶解，最后将其转移到(5mm/20cm)核磁管中。依照以上步骤，得到相同7个封存在核磁管中的氘代溶液样品，直接用于氢谱的测定。

[0151] 重复测量：取同一份封存于核磁管中的奥硝唑氘代溶液，在上述条件下连续测定3次。

[0152] 数据处理：利用美国的数据处理软件ACD Lab将原始谱图经过傅里叶变换，基线校准，自动相位和手动相位调整后，得到谱图。

[0153] 定量核磁测定结果：经实验验证，奥硝唑的分子结构适合使用定量核磁法进行纯度定量，根据其特征峰的位置，本实验选择美国NIST标准物质苯甲酸作为内标物。

[0154] 由于奥硝唑在低场场区的H在杂环上，与苯甲酸上苯环的H相互之间不会造成干扰，而且低场区的氢非常特征，所以选择低场区位于δ＝7.87的CH特征氢其中的一个作为标定，同时选择内标物苯甲酸上苯环的2,6位氢δ＝8.01作为标定。这两个化合物的氢在核磁共振谱图中距离很近，在这个小范围内磁场是相当均匀的，所以用它们的累加的积分面积来测定它们的含量。标准物质苯甲酸的定量核磁谱图和奥硝唑(内标为标准物质苯甲酸)的定量核磁谱图如图8所示。

[0155] 经方法确认，奥硝唑的分子结构适合使用核磁共振法定量，并可采用纯度标准物质苯甲酸作为内标物，纯度计算公式如下：

[0156]

[0157] 式中：PNMR—采用核磁共振法测得的被测物的纯度；

[0158] Ix—样品指定峰的积分面积；

[0159] Istd—内标物指定峰的积分面积；

[0160] nstd—内标物指定峰的核群核个数；

[0161] nx—样品指定峰的核群核个数；

[0162] Mx—样品的分子量；

[0163] Mstd—内标物的分子量；

[0164] mstd—添加的内标物的质量；

[0165] mx—样品的称样量；

[0166] Pstd—内标物的纯度。

[0167] 奥硝唑定量核磁法定值结果如表11所示。

[0168] 表11奥硝唑定量核磁法(qNMR)定值结果(％)

[0169]

[0170] 纯度定值结果：

[0171] 纯度定值的结果取两种不同原理方法测量结果的平均值，结果如下：

[0172]

[0173] 综上所述，奥硝唑纯度标准物质定值结果为99.9％。

[0174] 4、不确定度评价

[0175] 奥硝唑纯度标准物质的不确定度由三部分组成：标准物质的不均匀引入的不确定度；标准物质的不稳定引入的不确定度；标准物质的定值过程引入的不确定度。

[0176] 奥硝唑纯度标准物质不确定度来源分析及评定流程如图9所示。

[0177] (1)均匀性引入的不确定度

[0178] 采用单因素方差分析法进行均匀性评估。则均匀性的标准偏差sH可以用公式计算：

[0179]

[0180] 式中：sH为均匀性标准偏差；为组间方差； 为组内方差；n为组内测量次数。

[0181] 在这种情况下，sH等同于瓶间不均匀性导致的不确定度分量ubb，即为公式ubb＝sH＝0.0096％

[0182] (2)稳定性引入的不确定度

[0183] 根据表2的数据，有效期为6个月的长期稳定性引入的不确定度ults计算如下：

[0184] ults＝s(b1)·X＝0.000894％×6＝0.00408％≈0.00537％

[0185] 根据表3的数据，短期稳定性引入的不确定度usts计算如下：

[0186] 在20℃下：usts1＝s(b1)·X＝0.00315％×9＝0.028％

[0187] 在40℃下：usts1＝s(b1)·X＝0.00278％×9＝0.025％

[0188] 在60℃下：usts2＝s(b1)·X＝0.00014％×9＝0.001％

[0189] 所以：

[0190]

[0191] (3)定值引入的不确定度

[0192] 1)面积归一化法引入的不确定度

[0193] 面积归一化法的不确定度u(PHPLC-AN)计算公式如下：

[0194]

[0195] 其中，u(PHPLC-AN，rel)为面积归一化法的不确定度，urel(P0)为液相色谱法的不确定度，u(Xw)为水分测量的不确定度，u(Xn)为非挥发性杂质测量的不确定度，u(Xv)为挥发性杂质测量的不确定度。

[0196] 1)-1液相色谱的测量不确定度

[0197] 液相色谱法定值测量重复性引入的不确定度u1由测量的标准偏差计算，u1＝0.021％；

[0198] 各成分在不同检测波长下响应差异引入的不确定度：

[0199]

[0200] 式中，Bimaxλ为在5个检测波长下杂质成分i的最大百分比含量；

[0201] Bi定值λ为定值波长下杂质成分i的百分比含量；

[0202] u2-i为杂质成分i的不确定度分量。

[0203] 各波长的响应与不确定度评定结果，如表8所示。

[0204] 1)-2水分引入的不确定度

[0205] 天平称样引入的不确定度分量很小，所以水分测量的主要不确定来源是测量的重复性uA，水分的测量结果Xw为0.0131％，标准偏差为0.001％，因此水分测定引入的不确定度：u(XW)＝0.001％。

[0206] 1)-3其他杂质引入的不确定度

[0207] 天平称样引入的不确定度分量很小，所以非挥发性杂质测量的主要不确定来源是测量的重复性uA，非挥发性杂质的测量结果Xn为0.00935％，因此，认为非挥发性杂质测定的不确定度:u(Xn)＝0.00935％。

[0208] 1)-4面积归一化法的相对不确定度：

[0209]

[0210] 1)-5面积归一化法的绝对不确定度：

[0211] uHPLC-AN＝99.93％×uHPLC-AN,rel＝0.027％

[0212] 2)定量核磁法引入的不确定度

[0213] 由核磁定量的公式得出纯度测量不确定度公式：

[0214]

[0215] 核磁定量法不确定度的来源包括测量的不确定度、分子量不确定度、称量不确定度、内标物纯度不确定度。

[0216] 积分面积测量的不确定度u(Ix/Istd)：积分面积测定结果的标准不确定度采用A类评定，用NMR法测定结果的标准偏差表示，不确定度为0.072％。

[0217] 内标物标准物质尼泊金乙酯和样品天平秤量不确定度u(mstd)和u(mx)：称量天平的最小分度为0.01mg，称样量为20mg和10mg，所以天秤称量的不确定度为：

[0218]

[0219] 内标物纯度不确定度u(Pstd)：内标物苯甲酸的纯度不确定度由标准物质证书获得，纯度值的相对扩展不确定度为0.0044％(k＝2)，所以其相对标准不确定度为0.0022％。

[0220] 分子量的不确定度u(Mx)和u(Mstd)：奥硝唑和内标物苯甲酸相对分子量的标准不确定度计算公式：

[0221]

[0222] 式中：Nj—j元素的原子个数；uj—j元素的相对原子质量的不确定度。

[0223] 根据IUPAC国际原子量表，4种原子的相对原子质量及不确定度为C:12.0107±0.0008；H:1.00794±0.00007；O:15.9994±0.0003；N:14.00674±0.00007；Cl：35.4527±
0.0009。

[0224] 对于每个元素，其标准不确定度是按照均匀分布由引用不确定度转化而来。

[0225] 奥硝唑的分子式为C7H10ClN3O3，相对分子量219.63，其标准不确定度为：

[0226]

[0227] 奥硝唑相对分子质量的相对标准不确定度:

[0228] u(Mx)/Mx＝0.0033/219.63＝1.5×10-5

[0229] 同理，内标物苯甲酸(C7H6O2)，相对分子量为122.12，其相对标准不确定度:

[0230] u(Mstd)/Mstd＝2.7×10-5。

[0231] 因此核磁定量法纯度测量的合成标准不确定度为：

[0232]

[0233] 因此，定值不确定度计算如下:

[0234]

[0235] 标准物质的不确定度：奥硝唑标准物质定值结果的不确定度由定值方法、标准物质的不均匀性及不稳定性带来的不确定度三部分组成。标准物质的总体不确定度计算公式如下：

[0236]

[0237] 扩展不确定度为：UCRM＝k×uCRM＝0.4％(k＝2)。

[0238] 综上所述，奥硝唑纯度标准物质的量值和不确定度如表12所示。

[0239] 表12奥硝唑纯度标准物质的纯度、不确定度

[0240]成分 量值/％ 不确定度/％(k＝2)
奥硝唑纯度 99.9 0.4

[0241] 对于出口的鸡肉中药物残留量测定，采用国标方法进行出口鸡肉中奥硝唑检测外，还需要采用奥硝唑标准物质，具体操作为：采用已知纯度的奥硝唑纯度标准物质，采用重量容量法配制标准溶液，绘制工作曲线，同时，将经过样品处理后得到的待测样品与标准工作溶液一起通过液相色谱或者液相色谱质谱检测，通过峰面积计算待测样品中奥硝唑含量，这样能待分析样品中含量就通过本纯度标准物质直接溯源到SI单位，增加了数据的准确性、可比性和可溯源性。