一种低成本的Ag+检测方法

摘要

本发明公开了一种低成本的Ag+检测方法，首先于检测试管中加入一定浓度、一定体积的葡萄糖氧化酶溶液与Ag+溶液，在一定温度下让其反应一段时间；随后，加入一定体积的葡萄糖溶液，让其反应一定的时间；接着，加入已知浓度的碘化钠溶液，让其反应一定时间；最后，加入一定浓度的可溶性淀粉溶液，观察溶液颜色的变化；同时，把生成碘单质的溶液滴加在纸微流控分析装置的加样区。最终，通过观察酶标板中溶液颜色的变化就可以定性地分析溶液中Ag+的含量和测量纸微流控分析装置检测区生成的蓝色印迹的长度对Ag+进行定量分析。本发明不需要仪器设备的操作，成本低廉，操作简单。

权利要求

1.一种低成本的Ag+检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、首先在电脑上使用Corel DRAW软件绘制所需的图形，其中，圆形加样区的直径为

5.0mm，矩形检测区的宽度和长度分别为3.0mm和40.0mm、检测区自带有间隔3mm的标尺；

S2、待图形绘制完成后，将一张9cm×9cm的定量中速滤纸放置于激光雕刻机的工作台上，启动仪器，通过激光雕刻机，在滤纸上切出所需的纸微流控分析装置，在纸微流控分析装置的检测区，用1μL的微量进样器均匀地涂上由甲酰胺溶液配置的2％可溶性淀粉溶液1μL，在自然条件下晾干、储存在干净没有灰尘的地方，备用；

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S3、在1.5mL的离心管中，依次加入一定体积2μg/mL的GOD溶液和一定浓度的Ag溶液，然后将其置于40℃的恒温水浴箱中，反应15min后，向离心管中加入20mM的葡萄糖溶液，继续反应30min；然后向离心管中加入0.5M的碘化钠溶液，继续反应5min；

S4、反应完成后，从恒温水浴箱中取出离心管，然后用移液枪吸取溶液滴加在步骤S2所得的纸微流控分析装置的加样区，分析溶液在毛细管作用下流入纸微流控分析装置的检测区，检测区固定的2％的可溶性淀粉溶液遇到分析溶液中的碘单质，产生有颜色的轨迹，通过测量检测区有颜色的轨迹的长度完成对Ag+的定量检测。

说明书

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一种低成本的Ag 检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及Ag+检测领域，具体涉及一种低成本的Ag+检测方法。

背景技术

[0002] 人们生活的环境当中分布着很多重金属离子，它可以通过多种方式进入到人们的生活当中。例如：在人们日常的饮食当中；工人们开采矿产资源的过程中；工业产品的生产过程中；未处理的污水、污泥当中。重金属的污染已经对人们的健康与生态系统的稳定构成了越来越严重的威胁。重金属离子可以附合在与生命体相关的含巯基的基团及相关的配体上，从而抑制了谷胱甘肽的代谢过程及大量的酶与激素的活性。重金属离子与生命体必须的微量元素是不同的，它们经常取代生命体必须的微量元素结合在蛋白质、受体、金属酶上，从而导致了人体新陈代谢过程的严重紊乱。从事生物医学与环境科学的人们对各种不同的重金属离子抑制于各种不同酶的活性具有很大的兴趣，比如研究者们对重金属离子在单位酶分子上的结合数量及其对酶分子活性的抑制百分比进行了详细地研究与学习。其2+ 2+ 2+ 2+ +
中，Pb 、Hg 、Cd 、Cu 和Ag这五种重金属离子经常与酶发生作用，从而导致酶失活或者活性降低。研究者们已经研究了Hg2+和Cu2+对很多酶的抑制作用。但是，对于Ag+与酶的相互作用的研究甚少。Ag+是重金属离子中的一种。同时，它也是一种最具有毒性的，可以致癌的污染物。它通常存在于各种不同的金属矿石中。在工业上，银经常被用来制作硝酸银、溴化银及与摄影有关其它化学药品。在生活中，银存在于日常用的镜子上、镀银设备上、特殊电池的电极上、餐桌上的餐具中，日常佩戴的首饰上，牙科医疗及其它的科学设备当中。在一些国家，人们用氧化银对日常的饮用水进行消毒处理，这样就会造成自来水中银离子浓度升高。然而，在人们大量使用银纳米材料与纳米粒子的过程中，银离子就会进入到水生生态系统中，这就对环境可能产生了严重的危害。人们排放到水体、土壤中的银离子，它可以富集在日常生活所必须的食物当中，比如：各种鱼类及贝壳类等海产品，从而给人们的健康造成了巨大的危险。皮肤及人体其它器官组织产生的灰白色的斑点是银离子中毒最明显的特征。美国国家环境保护局设立了食品及饮水中重金属离子的含量标准。其中，Ag+在饮用水中的浓度不能大于0.46μM。由于重金属离子对生命体的毒性，因此人们非常需要对重金属离子进行测定及对微量重金属离子进行检测。现如今存在很多种方法检测生态环境中、生物科学中、食品样品中的重金属离子。这些方法包括：原子吸收光谱测试法、电感耦合等离子发射光谱与电感耦合等离子质谱法、原子荧光光谱法、X-射线荧光光谱法和电化学分析法。然而，这些方法都需要复杂、精密的仪器设备进行分析检测，并且对于仪器的操作者还需要进行专门的仪器使用方法的培训与学习。因此，人们特别需要设计与开发一种低成本、快速检测、灵敏度高的分析方法对Ag+进行分析检测。

发明内容

[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种低成本的Ag+检测方法，不需要仪器设备的操作，成本低廉，操作简单，能实现Ag+的快速检测，灵敏度高。

[0004] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

[0005] 一种低成本的Ag+检测方法，包括如下步骤：

[0006] S1、首先在电脑上使用Corel DRAW软件绘制所需的图形，其中，圆形加样区的直径为5.0mm，矩形检测区的宽度和长度分别为3.0mm和40.0mm、检测区自带有间隔3mm的标尺；

[0007] S2、待图形绘制完成后，将一张9cm×9cm的定量中速滤纸放置于激光雕刻机的工作台上，启动仪器，通过激光雕刻机，在滤纸上切出所需的纸微流控分析装置，在纸微流控分析装置的检测区，用1μL的微量进样器均匀地涂上由甲酰胺溶液配置的2％可溶性淀粉溶液1μL，在自然条件下晾干、储存在干净没有灰尘的地方，备用；

[0008] S3、在1.5mL的离心管中，依次加入一定体积2μg/mL的GOD溶液和一定浓度的Ag+溶液，然后将其置于40℃的恒温水浴箱中，反应15min后，向离心管中加入20mM的葡萄糖溶液，继续反应30min；然后向离心管中加入0.5M的碘化钠溶液，继续反应5min；

[0009] S4、反应完成后，从恒温水浴箱中取出离心管，然后用移液枪吸取溶液滴加在步骤S2所得的纸微流控分析装置的加样区，分析溶液在毛细管作用下流入纸微流控分析装置的检测区，检测区固定的2％的可溶性淀粉溶液遇到分析溶液中的碘单质，产生有颜色的轨迹，通过测量检测区有颜色的轨迹的长度完成对Ag+的定量检测。

[0010] 本发明具有以下有益效果：

[0011] 操作简单，免仪器，成本低廉，现象明显，检出限低，可以检测到100fM的Ag+浓度。新方法适合于在经济条件有限的偏远落后地区水质、食品、环境检测等领域内的推广使用。

附图说明

[0012] 图1为本发明实施例的原理图。

[0013] 图2基于纸微流控分析装置检测银离子的可行性实验。

[0014] 图3为纸微流控分析装置检测区蓝色印迹的长度对银离子浓度的响应。(a.高、中、低三个银离子浓度对检测区蓝色印迹长度的响应；b.银离子的线性检测范围；每个数据是6次平行实验的平均值，所得标准差作为误差棒。)

[0015] 图4基于纸微流控分析装置检测Ag+的特异性实验。(其中，1.Ag+、2.Cd2+、3.Co2+、4.Cr2+、5.Cu2+、6.Fe2+、7.Hg2+、8.Mn2+、9.Ni2+、10.Pb2+、11.Zn2+。)

具体实施方式

[0016] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0017] 以下实施例中所需的试剂与仪器分别见表1和表2。

[0018] 表1实验试剂

[0019]

[0020] PBS缓冲溶液(0.1M，pH 6.0)由磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠与氯化钾配置；2％可溶性淀粉溶液由甲酰胺溶液配置；葡萄糖溶液、葡萄糖氧化酶(GOD)溶液均由PBS溶液配置。除非特别说明，否则所有溶液均使用去离子水(电阻率大于18MΩ.cm)配置与稀释。

[0021] 表2实验仪器

[0022]

[0023]

[0024] 所使用的2％可溶性淀粉溶液通过以下步骤配制所得：

[0025] 首先，取两个容量为25mL的小烧杯(提前用王水浸泡)，编号分别为A与B。然后，在A烧杯内加入3mL的甲酰胺溶液；B烧杯中加入6.5mL甲酰胺溶液。接着，在通风橱中，给B烧杯中的甲酰胺溶液套上泡沫圈放在恒温水箱中进行加热，把甲酰胺溶液加热到100℃。A烧杯中加入0.2g可溶性淀粉，并用玻璃棒不断地搅拌，使可溶性淀粉均匀地分散在A烧杯中的甲酰胺溶液中。最后，把A烧杯中溶有可溶性淀粉的甲酰胺溶液少量多次地加入到温度为100℃的B烧杯中的甲酰胺溶液中进行溶解。溶解完毕，取出B烧杯在空气中自然冷却，封口保存。

[0026] PBS缓冲溶液通过以下步骤配制所得：

[0027] 先用王水(浓盐酸与浓硝酸按体积比为3:1组成的混合物)浸泡两个100mL、一个1000mL的容量瓶、三个体积为100mL的烧杯24小时。然后，先用自来水冲洗干净容量瓶与烧杯，再用二次水洗干净容量瓶与烧杯，储存备用。在电子天平上，先称取磷酸氢二钠
14.196g，倒到编号为A的100mL小烧杯中，加入二次水并用玻璃棒不断地搅拌使其完全溶解，然后转移到100mL容量瓶中，最后用胶头滴管定容到容量瓶的刻度线处。贴上标签：浓度为1mol/L的磷酸氢二钠溶液。同样，在电子天平上称取11.998g磷酸二氢钠，将其倒在编号为B的100mL小烧杯中，接着用一定体积的二次水溶解磷酸二氢钠并用玻璃棒不断地搅拌使其完全溶解，随后将其转移到100mL容量瓶中，最后用胶头滴管定容到容量瓶的刻度线处。
贴上标签：浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液。最后，取12mL的磷酸氢二钠溶液、88mL的磷酸二氢钠溶液到编号为C的小烧杯中，将其稀释定容到1000mL的容量瓶中。贴上标签：0.1mol/L的PBS缓冲溶液。

[0028] 实施例1

[0029] 首先在电脑上使用Corel DRAW软件绘制实验所需的图形。其中，圆形加样区的直径为5.0mm，矩形检测区的宽度和长度分别为3.0mm和40.0mm、检测区自带有间隔3mm的标尺。待分析装置图案绘制好后，将一张滤纸(9cm×9cm，定量，中速)放置于激光雕刻机的工作台上，启动仪器，通过激光雕刻机，在定量、中速滤纸上切出实验所需要的纸微流控分析装置。在纸微流控分析装置的检测区，用1μL的微量进样器均匀地涂上由甲酰胺溶液配置的2％可溶性淀粉溶液1μL，在自然条件下晾干、储存在干净没有灰尘的地方备用。

[0030] 在1.5mL的离心管中，首先用移液枪加入一定体积2μg/mL的GOD溶液，接着加入一定浓度的Ag+溶液。然后，把加好溶液的离心管放到恒温40℃的水浴箱中，让其反应15min。15min后，又给离心管中加入20mM的葡萄糖溶液，然后放到水浴箱中继续反应30min。30min后，给离心管中继续加入0.5M的碘化钠溶液，让其反应5min。5min过后，从恒温水浴箱中取出离心管，然后用移液枪吸取溶液滴加在纸微流控分析装置的加样区。随后，分析溶液在毛细管作用下流到了纸微流控分析装置的检测区，检测区固定的2％的可溶性淀粉溶液遇到分析溶液中的碘单质，就会产生有颜色的轨迹。同样的实验步骤，改变反应液中Ag+的浓度进行一系列的实验。最后，通过测量检测区蓝色轨迹的长度对Ag+进行定量检测。

[0031] 结论

[0032] 在最佳的GOD浓度为2μg/mL，Ag+浓度分别为空白(0)与1mM下，进行可行性实验。实验结果如图2所示。由图可以得出：当Ag+浓度为1mM时，在纸微流控分析装置的检测区没有生成蓝色印迹；当Ag+浓度为0时，在纸微流控分析装置的检测区观察到有均匀的蓝色印迹生成。因此，在GOD浓度为2μg/mL时，可以通过纸微流控分析装置对银离子进行定量检测。

[0033] 基于纸微流控分析装置对Ag+进行定量检测

[0034] 在GOD浓度为2μg/mL，Ag+浓度由1nM-1mM(十倍变化)时，进行了一系列的实验。在实验当中，先在比色管中加入2μg/mL的GOD溶液，接着加入一定浓度的Ag+溶液；然后把比色管放在40℃的恒温水浴箱中反应15min。之后，取出比色管，用移液枪给比色管中加入一定+体积20mM的葡萄糖溶液，反应30min；这时候未被Ag 抑制的GOD将催化葡萄糖溶液的水解反应，反应生成过氧化氢溶液。然后，再往比色管中加入0.5M的碘化钠溶液，溶液中的过氧化氢将于碘化钠溶液发生氧化还原反应，反应生成碘单质。最后，用移液枪移取少量的反应液滴加在纸微流控分析装置的加样区，然后在纸微流控分析装置的检测区测量生成的蓝色印迹长度。实验结果如图3所示。在图3A中，可以看出，Ag+浓度分别为10-4、10-6、10-8mol/L时，纸微流控分析装置的检测区检测到的蓝色印迹的长度明显不同。并且，Ag+浓度越小，在纸微流控分析装置检测区检测到的蓝色印迹的长度就越长，它们成反比例关系。在图3B中，可以看出：检测区测量的蓝色印迹的长度与Ag+的浓度之间成良好的线性关系。当Ag+浓度在
1nM-1mM范围内，对应的线性回归方程为Y＝-3.3869+1.46131x(R2＝0.93493)。当Ag+浓度为
1nM时，纸微流控分析装置的检测区检测到蓝色印迹的长度与空白样品检测到的长度基本-9
一样，没有明显的区别。因此，该方法的检出下限约为1.0×10 mol/L。由此看以看出的方法可以很好地用来检测溶液中的Ag+。

[0035] 在以上实验条件下，选取Ag+、Cd2+、Co2+、Cr2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+十一种金属离子进行特异性实验。其中每种金属离子的浓度都为100μM。在实验过程中，让这+ +十种金属离子代替Ag ，分别与GOD溶液反应；接下来的实验步骤与检测Ag的操作步骤一样。
检测结果如图4所示。由图中的数据可以得出，这十种金属离子对基于纸微流控分析装置定量检测Ag+的浓度基本没有影响。当Ag+浓度为100μM时，在纸微流控分析装置的检测区测量到的蓝色印迹的平均长度约为2.33mm(三次平行实验)。但是，当十种特异性金属离子的浓度都为100μM时，在纸微流控分析装置的检测区测量到的蓝色印迹的长度基本都分布在7-
8mm之间。这就说明本方法对Ag+的特异性响应。从图中还可以看出，十种特异性金属离子浓度都为100μM时，在纸微流控分析装置检测区测量到的蓝色印迹长度都比较长，其等同于Ag+浓度为100nM时检测区的蓝色印迹长度。由此，也可以得出，的分析方法对Ag+的特异性选择。因此，可以得出：该方法抗干扰性强，可以很好地用来检测溶液中的Ag+浓度。

[0036] 实施例2

[0037] 用设计的纸微流控分析装置对实验室中的自来水进行分析检测。在自来水的分析过程中，设计了四组加标回收实验。其中，每组回收实验中的加标Ag+浓度不同。四种加标Ag+溶液都是用自来水配置，其浓度分别为：100nM、1μM、10μM、100μM。实验结果如表3所示。由表3中数据可以得出：开发的纸微流控分析装置可以很好地用来检测自来水中的Ag+。其中，加入标准浓度为100nM的Ag+时，其回收率为93.57％，相对标准偏差为2.9％；加入标准浓度为
1μM的Ag+时，回收率为99.33％，相对标准偏差为5.7％；加入标准浓度为10μM的Ag+时，回收率为107.8％，相对标准偏差为5.0％；加入标准浓度为100μM的Ag+时，回收率为103.25％，相对标准偏差为5.7％。综上所述，该分析方法可以较好地应用在实际样品的分析当中。

[0038] 表3对自来水中的银离子进行分析检测

[0039]

[0040] 本具体实施的基于Ag+对GOD活性的选择性抑制作用；从而使GOD催化葡萄糖溶液的水解反应生成相对比较少的过氧化氢；具有氧化性的过氧化氢溶液与还原性的碘化钠溶液发生氧化还原反应，生成碘单质；碘-2％可溶性淀粉溶液反应生成蓝色的络合物。通过以上原理，分别应用比色法与测距法对溶液中的银离子进行检测。实验原理图如图1所示。在图中，首先检测试管中加入一定浓度、一定体积的葡萄糖氧化酶溶液与Ag+溶液，在一定温度下让其反应一段时间；随后，加入一定体积的葡萄糖溶液，让其反应一定的时间；接着，加入已知浓度的碘化钠溶液，让其反应一定时间；最后，加入一定浓度的可溶性淀粉溶液，观察溶液颜色的变化；同时，把生成碘单质的溶液滴加在纸微流控分析装置的加样区。最终，通过观察检测试管中溶液颜色的变化就可以定性地分析溶液中银离子的含量和测量纸微流控分析装置检测区生成的蓝色印迹的长度对银离子进行定量分析。的方法不需要仪器设备的操作，成本低廉，操作简单。研究结果表明，该方法定性检测到的最低银离子浓度为100fM，定量检测到的最低银离子浓度为1nM。

[0041] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。