一种集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊

摘要

本发明涉及一种集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊，涉及这类多功能纳米胶囊的制备方法及其在肿瘤诊疗方面的用途。集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊的结构示意图如图所示，其膜成份包括用于光热治疗的近红外染料、用于化疗的双亲性Janus药物共聚体以及常规磷脂，近红外吸收剂和化疗药物的比例可以根据需要进行调控，载药量大大提高。该多功能纳米胶囊可以通过EPR效应在肿瘤部位实现靶向富集，有效地提高了药物在肿瘤部位的富集及摄取，显著改善了光热/化疗联合抑制肿瘤生长的效果。

权利要求

1.一种用于集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊，其特征在于该纳米胶囊是由双层膜结构构成，其组成同时包括：Janus药物共聚体、近红外染料DiR，以及二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，三者按照30％～70％:10％～50％:20％的摩尔比混合；

所述Janus药物共聚体结构一般如下：

其中，A代表喜树碱，B代表5氟脱氧尿苷，X和Y代表各种连接基团，X和Y可以相同，也可以不同；a＝2或3；b＝2或3，a和b可以相同，也可以不同。

2.如权利要求1所述的一种集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将一定比例的磷脂、Janus药物及近红外染料于二甲基亚砜(DMSO)中溶解混合均匀；

2)将混匀的上述体系溶液缓慢滴加到生理盐水中，40-60℃水浴超声15-30分钟；

3)使用8000～14000KD的透析袋，将得到的体系在生理盐水中室温下透析2～4h；

4)将上述所得体系转移至西林瓶中，4℃密封保存。

3.根据权利要求1所述的一种集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊，其特征在于该纳米胶囊可用于肿瘤的诊断和治疗。

说明书

一种集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳

米胶囊

技术领域

[0001] 本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一类集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊，以及其在肿瘤诊疗方面的用途。

背景技术

[0002] 耐药性问题一直是癌症治疗的长期挑战，为了提高临床癌症治疗的治疗效果，精确控制的不同作用模式的药物的联合使用在很多种癌症治疗中被用作标准疗法，因为同单次或连续给药的方式相比较，癌细胞更加难以形成代偿性抵抗机制。通过纳米颗粒能够实现药物组合的同步递送以及释放特性的控制，为克服癌症耐药性提供了许多前所未有的选择。目前已证实，与传统联合治疗期间游离药物的混合配制相比，1：1伊立替康和氟尿苷的双重药物脂质体制剂可以更有效用于结直肠癌治疗。然而，将两种药物按照固定比例，以高负载量有效、稳定的包封在单个纳米颗粒内，仍然是许多组合纳米颗粒的关键挑战之一。此外，非特异性递送通常导致明显的正常组织毒性，并将抗癌药物的剂量限制在远低于治愈癌组织所需的水平。

[0003] 现有研究已证明，热疗可以增加细胞代谢和膜通透性，从而促进药物摄取以增加一些化学治疗剂的细胞毒性，导致与较高剂量的药物相同的结果。因此，热疗被用于联合化疗(称为热化疗)。在热疗中，使用近红外(NIR)光吸收剂将光能转换成热量的光热治疗(PTT)，因为其具有最小侵袭力和潜在有效性，在热化疗中得到了广泛的关注。由于强近红外光吸收能力和可忽略的细胞毒性，载有1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚三羰基碘化物(DiR)的纳米颗粒已被应用于体外和体内的PTT(Adv Funct Mater 2016,26,7495.)。然而，它们在热化疗中的应用往往受限于低的药物负载量(通常低于10％)和过早的渗漏。特别地，据我们所知，共同封装DiR和两种药物的组合纳米颗粒尚未见文献报道用于成像引导的化疗和光热治疗联合治疗。因此，热化疗迫切需要开发具有更多功能的纳米体系，以达到更好的协同治疗效果。

[0004] 基于上述需求，本发明使用高度对称的Janus喜树碱-5氟脱氧尿苷共轭药物分子(CF)，近红外光吸收剂DiR和聚乙二醇化磷脂(DSPE-PEG2000)构建新型的组合纳米胶囊(CF-DiR NCs)。CF-DiR NCs具有固定摩尔比的喜树碱(CPT)/氟尿苷(FUDR)(1：1)和可调的CF/DiR摩尔比，从而优化了CPT和FUDR的协同抗肿瘤活性，并提高了癌症的热化疗功效。我们将两个疏水性CPT分子和两个亲水性FUDR分子通过可水解酯键与多价季戊四醇结合，合成了具有磷脂-模拟结构的CPT-FUDR(CF)药物分子。CF和DiR的双亲性促进了它们自组装成与脂质体类似结构的纳米胶囊。由于使用CF和DiR本身作为纳米载体，所获得的CF-DiR NCs具有显著提高的载药量，高度稳定的共递送药物组合并且不会过早释放。在静脉注射(静脉注射)后，CF-DiR NC可以被动积累在肿瘤组织中并被肿瘤细胞摄取内化。CPT和FUDR可以通过酯酶和肿瘤细胞的酸性环境水解酯键而协同释放。由于DiR的强烈的近红外吸光度，可用于PTT和进一步用于增强化疗的疗效。此外，通过使用DiR荧光进行近红外荧光(NIRF)成像，可以容易地监测CF-DiR NC的生物分布，用于进行精确的光化疗，避免对周围正常组织的损伤。总之，这项研究强调，CF-DiR NCs可以作为新型的纳米诊疗剂用于成像引导的癌症光热疗。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一类集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊以及该类纳米胶囊的制备方法。

[0006] 本发明的另一目的是提供上述集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊在肿瘤诊疗中的应用。

[0007] 本发明所述的集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊的结构如附图1所示。

[0008] 本发明中的多功能纳米胶囊，其特征在于该纳米胶囊的壳层是由脂质双分子层构成，其组成同时包括：用于光热治疗的近红外染料、用于化疗的双亲性Janus药物共聚体以及常规磷脂，近红外染料和双亲性Janus药物共聚体可以和常规磷脂在水溶液中共同自组装形成纳米胶囊。

[0009] 其中所述近红外染料首选生物相容性好、光热转换效率高的具有疏水长链或者双亲性的染料，一般其结构如下：

[0010]

[0011] 其中R1，R2＝C6～18烷基，R3，R4＝H或SO3H-；n＝2或3；X＝H，CH3，CH3O，CI-，Br-，I-，对位吡啶环，吡嗪等；例如1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyanine iodide(DiR)、吲哚菁绿(ICG)及其衍生物等。所述的染料与常规磷脂自组装形成纳米胶囊，染料和磷脂通过静电作用力或范德华力结合。

[0012] 所述的双亲性Janus药物共聚体一般指药物分子通过季戊四醇共价连接在一起得到的共聚体，其结构一般如下：

[0013]

[0014] 其中，A代表各种疏水性分子，B代表各种亲水性分子，X和Y代表各种连接基团，X和Y可以相同，也可以不同；a＝2或3；b＝2或3，a和b可以相同，也可以不同。所述的Janus药物共聚体经溶胶凝胶过程后在水溶液中能自组装形成脂质体(中国发明专利，201611231246.5)。

[0015] 本发明所述的一种集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：

[0016] 1)将一定比例的磷脂、Janus药物共聚体及近红外染料于二甲基亚砜(DMSO)中溶解混合均匀(Janus药物共聚体比例0～80％，近红外染料比例0～50％，磷脂比例0～30％)。

[0017] 2)采用DMSO注入法，将混匀的上述体系滴加到生理盐水中，40-60℃水浴超声15-30分钟。

[0018] 3)使用8000～14000KD的透析袋，将得到的体系在生理盐水中室温下透析2～4h。

[0019] 4)将上述所得体系转移至西林瓶中，4℃密封保存。

[0020] 在步骤l)中，所述的磷脂包含12～24个碳的碳链长度，优选二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG5000)。

[0021] 本发明中近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊，其光热吸收剂、Janus药物共聚体和磷脂共成膜，近红外染料和化疗药物的比例可以根据需要进行调控，载药量大大提高；同时，其能够通过荧光成像，精准定位肿瘤位置；并且可以通过活体荧光成像监测纳米胶囊的靶向富集，引导精准的光热治疗；光热和光动力联合治疗肿瘤，优于单独的光热治疗或者光动力治疗效果，有效改善了疗效。

附图说明

[0022] 图1是本发明所描述的多功能纳米胶囊的结构图，图2是具体实施例1制备得到的多功能纳米胶囊的粒径分布图；图3是具体实施例4中不同浓度的多功能纳米胶囊在近红外光照射下的升温曲线；图4是具体实施例5中多功能纳米胶囊用于热化疗后的细胞存活率统计结果图；图5是具体实施例6中纳米胶囊在动物肿瘤组织处逐渐富集的荧光成像的图像；图6是具体实施例7中纳米胶囊在肿瘤部位富集后，经激光照射后肿瘤组织的热成像图；图7是具体实施例8中纳米胶囊用于化疗和光热联合治疗下的动物肿瘤生长曲线。

具体实施方式

[0023] 通过以下具体实施方式将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

[0024] 实施例1

[0025] 将Janus药物共聚体、近红外染料DiR和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)按照一定摩尔比混合(70％:10％:20％)，然后采用DMSO注入法，在50℃水浴超声条件下，将上述混合物注入到去离子水中；将上述所得到的溶液置于截留分子量8000-14000Da的透析袋中，透析2～4h，取出后转入西林瓶中，得到集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊(CF-DiR NCs)。密封保存于4℃冰箱。纳米胶囊粒径分布如附图2所示。

[0026] 实施例2

[0027] 将Janus药物共聚体、近红外染料DiR和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)按照一定摩尔比混合(30％:50％:20％)，然后采用DMSO注入法，在50℃水浴超声条件下，将上述混合物注入到去离子水中；将上述所得到的溶液置于截留分子量8000-14000Da的透析袋中，透析2～4h，取出后转入西林瓶中，得到集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊(CF-DiR NCs)。密封保存于4℃冰箱。

[0028] 实施例3

[0029] 将Janus药物共聚体、近红外染料DiR和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(DSPE-PEG5000)按照一定摩尔比混合(70％:10％:20％)，然后采用DMSO注入法，在50℃水浴超声条件下，将上述混合物注入到0.8ml水中；将上述所得到的溶液置于截留分子量8000-14000Da的透析袋中，透析2～4h，取出后转入西林瓶中，得到集近红外荧光成像及化疗/光热治疗于一体的多功能纳米胶囊(CF-DiR NCs)。密封保存于4℃冰箱。

[0030] 实施例4

[0031] 为了评价实施例1-3中获得的多功能纳米胶囊的光热转化能力，将不同浓度的纳2
米胶囊经过760nm激光辐照(1W/cm ，5min)后，记录其温度随时间的变化情况。附图3显示PBS经过激光照射5min后温度基本没有明显的升高，10μmol和30μmol的纳米胶囊(DiR当量)经过激光辐照5min后温度可以分别升高9.7℃和19.5℃，说明DiR有很高的光热转换效率。
6.3μg/mL，12.5μg/mL，25μg/mL和50μg/mL纳米胶囊，经过激光辐照5min后温度可以分别升高了2℃，6.2℃，11.8℃和16.1℃，表明高的DiR负载量可以赋予CF-DiR NCs高效光热转换能力，显示在癌症光热疗应用中的巨大潜力。

[0032] 实施例5

[0033] 为了评价实施例1-3中获得的多功能纳米胶囊的光热转化能力协同治疗能力，使用摩尔比为8:2:2的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，DiR和DSPE-PEG2000制备了DSPC-DiR NC作为单独光热治疗组。对于激光治疗组(仅激光，DSPC-DiR NCs+激光，CF-DiR NCs+激光)，首先孵育4小时后，用760nm激光(3W/cm 2，5分钟)照射细胞，然后再孵育72小时。未处理的细胞用作对照。附图4显示，仅激光治疗的对照组显示出可忽略的细胞毒性。用不含CF的DSPC-DiR NC(含有0.6μg/mL DiR)与激光照射组合治疗后，细胞活力评估为
85％。用CF-DiR NC(含有1.8μg/mL CF和0.6μg/mL DiR)处理后，细胞活力为50％。形成鲜明对比的是，用CF-DiR NC和激光治疗可以使细胞存活率达到20％，远远低于化疗或光热处理。此外，CF-DiR NCs的治疗效果随着浓度而增加，呈剂量依赖性。这种显著的肿瘤热化疗疗效是由于局部热疗引起细胞摄取药物的增加和并加快了药物分子的水解速度。在近红外激光照射下，CF-DiR NCs的光热效应将增强细胞膜通透性，并进一步促进CF-DiR NCs的摄取。因此，化疗与PTT结合可有效解决肿瘤治疗不完全、有残留的问题。

[0034] 实施例6

[0035] 为了评估实施例1-3中获得的多功能纳米胶囊在体内对肿瘤进行荧光成像的能力，对接种了皮下PC3肿瘤的裸鼠进行荧光成像。附图5显示，通过尾静脉注射CF-DiR NC后，小鼠的肿瘤部位显示出强烈的荧光信号，并随时间增加而增强，在注射后24小时达到最大值，然后由于血液清除荧光信号开始减弱。CF-DiR NC的持续强荧光信号显示出其实时监测分布的巨大潜力。相反，与CF-DiR NC相比，注射游离DiR的小鼠在肿瘤中显示出非常弱的荧光信号。证实CF-DiR NC可以通过EPR效应有效的富集在肿瘤部位，这将大大有助于提高治疗效率和减少副作用。

[0036] 实施例7

[0037] 体内治疗实验中进一步考察了实施例1-3中获得的多功能纳米胶囊是否能对癌细胞进行有效的光热消融。PC3荷瘤小鼠静脉注射PBS，DSPC-DiR NC(20μg DiR)和CF-DiR NC(20μg DiR)后24h，使用760nm的激光(3W cm-2)照射10分钟。附图6，体内热成像图显示注射CF-DiR NCs和DSPC-DiR NCs的小鼠，肿瘤温度升高至52℃，明显高于PBS处理组的温度(Tmax＝38摄氏度)。这些结果表明，CF-DiR NCs在照射后有效富集在肿瘤部位，可以用作一种肿瘤消融的有效光热剂。

[0038] 实施例8

[0039] 体内光热和光动力联合治疗实验考察了实施例1-3中获得的多功能纳米胶囊是否能对肿瘤生长进行有效抑制。使用PC3荷瘤裸鼠评估CF-DiR NCs的体内光热疗的治疗效果。当肿瘤体积达到 3时，PC-3肿瘤裸鼠随机分为PBS，PBS+激光，DSPC-DiR NCs+激
光，CF-DiR NC和CF-DiR NCs+激光等5组。附图7显示，在用PBS或PBS+激光治疗的小鼠中，肿瘤体积在13天内从原始的100mm 3迅速增加到约1800mm 3(18倍)。这些结果表明，在实验条件下单独的激光照射不能产生潜在的破坏作用。如预期的那样，仅通过CF-DiR NCs组(52.2％)的化学疗法或仅针对DSPC-DiR NCs+激光组(29.8％)的光热疗法实现肿瘤生长的部分抑制。用DSPC-DiR NCs+激光治疗7天后，观察到肿瘤复发。相比之下，CF-DiR NCs和激光照射组合热化疗疗法显示出非常高的抑制率，导致几乎完全的肿瘤消除，而在整个实验期间无复发。在用CF-DiR NC加激光照射后肿瘤部位留下的黑色瘢痕，3天后开始逐渐减少。
由于协同效应，光热化学联合疗法比单独的光热处理或化学疗法对肿瘤细胞具有更显著的细胞毒性。光热效应引起的局部高热可能促进NC的细胞摄取，显著增强癌细胞对CPT和FUDR的抗癌药物的敏感性，导致药物功效的改善。