一株健康人肠道大肠杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株健康人肠道大肠杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。大肠杆菌JL‑3，属于埃希氏菌属，保藏号为CGMCC No.14074。这株大肠杆菌能显著延长秀丽隐杆线虫的平均寿命，显著提高秀丽隐杆线虫的抗热应激能力，能在秀丽隐杆线虫体内定植，且具有较好的胃肠运转耐受能力，能够产生一氧化氮信号分子，具有开发成保健食品或药品的广阔前景。

权利要求

1.一株健康人肠道大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌(Escherichia coli)命名为JL-3，属于埃希氏菌属，保藏号为CGMCC No.14074。

2.如权利要求1所述的一株健康人肠道大肠杆菌在制备具有延长寿命作用的保健食品中的应用。

说明书

一株健康人肠道大肠杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域。

背景技术

[0002] 人体衰老是不可避免的生理过程，是人类有史以来一直研究而未能解决的重大难题。当前我国已进入老龄化社会，随之而来的老年性疾病明显增多，给我国医疗保健工作带来巨大压力和挑战。因此，通过合适的延缓衰老的方法来有效降低因机体衰老而引发的老年性疾病，是当前亟待解决的重大问题。秀丽隐杆线虫形体小，寿命短，是以细菌为食的多细胞真核生物，因其自身具有的遗传学与发育生物学优势，秀丽隐杆线虫目前已成为研究动物寿命和衰老调控机制的重要动物模型（Brenner1974，Genetics77:71-94）。现有研究结果表明，胰岛素信号转导途径、限食途径、环境胁迫或抑制产卵等是使线虫延寿的主要机制，其中胰岛素信号转导途径研究最为详尽，目前已知胰岛素信号转导途径Insulin/IGF-1在线虫、果蝇、小鼠乃至灵长类动物体内高度保守，这条途径对于动物发育、代谢和衰老的调控均起到关键作用（Braeckman & Vanfleteren 2007，Experimental Gerontology 42: 90-98）。实际上，机体衰老是一个及其复杂的过程，一般个体大的动物比个体小的寿命长。
就平均寿命而言，小鼠2.5年，狗15年，猴子30年，人大约80年。与其他动物相比，人的寿命相对较长，尽管目前还没有直接证据证明胰岛素信号转导途径对人类也具有延寿作用，但有研究证实该信号通路与人类癌症及糖尿病的发生密切相关（Saltiel & Kahn 2001, Nature 414:799-806）。目前，癌症已被认为是一种与衰老有关的疾病，临床医学研究结果表明，癌症死亡率随年龄增加而升高。越来越多的研究结果证实，在细胞衰老和预期寿命中起关键作用的分子和亚细胞因子也与癌症的发生和生长有关（Wang E. 1995, Cancer Res 
55:2284-2292）。

[0003] 此外，最新研究结果表明，将枯草芽孢杆菌喂食秀丽隐杆线虫后，枯草芽孢杆菌可通过产生一氧化氮（NO）来延长秀丽隐杆线虫的寿命（Gusarov et al 2013，Cell 152:818-830）。NO是细胞内的新型信息传递信使分子、效应分子和免疫调控分子，在神经、血管及免疫系统调解中参与炎症反应、信号传递等生理过程。此外，NO又可激活鸟苷酸环化酶，催化GTP形成cGMP，cGMP作为胞内第二信使，可通过调节蛋白激酶、磷酸二酯酶及离子通道等途径，发挥杀菌或杀肿瘤细胞作用（《乳酸细菌—基础、技术和应用》，张刚主编，化学工业出版社，2007年1月第一版）。NO的作用是网络性的，其产生与作用都是连锁性的，具有“牵一发而全身俱动”的功效。现有研究结果表明，NO信号分子在改善心血管疾病、免疫系统疾病、循环系统疾病、中枢神经系统疾病以及泌尿生殖系统疾病中发挥重要作用。

[0004] 因此，通过有目的筛选对线虫有延寿作用的细菌菌株，结合菌株在动物体内的安全性评价、菌株胃肠运转耐受试验和定植试验等，便可推测，该类细菌菌株一旦在人体内定植可能发挥有益作用。

[0005] 在健康人肠道内寄居着数量庞大的微生物群落，这些微生物群落又被称为肠道菌群。现有研究结果证实，人肠道菌群与人体营养、免疫、代谢等多种生理功能紧密相关，在调节人体生理机能、平衡人体健康和疾病过程中发挥着重要作用。2002年，美国田纳西州大学微生物学家Savage教授在日本召开的国际肠内菌会议上郑重宣布：正常微生物群，即正常人肠道菌群应该被看作是宿主的“一个器官”或“一个系统”，人或动物都不能脱离正常肠道菌群的存在和作用而独立存在。换句话说，健康人肠道菌群是宿主生理结构的一部分，是“自己”，而不是“异己”。健康人体肠道菌群主要包括细菌、病毒和古菌，其中以细菌为主，其数量占肠道菌群99%以上。寄居在人肠道内的细菌有500～1000种，数量高达1014，而人体自身的细胞数量只有1013个（Backhed et al 2005，Science 307:1915-1920）。人肠道细菌被分为有益菌、有害菌和中性菌三大类，其中的有益菌是指“对生命有益的菌株”，也被称为“益生菌”。分离和筛选益生菌的样品主要包括传统发酵食品、自然环境以及动物和人体粪便等，其中从动物和人粪便中分离得到的益生菌较多。目前益生菌主要包括乳杆菌类、双歧杆菌类和兼性厌氧革兰氏阳性球菌类，其中乳杆菌类主要包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等；双歧杆菌类主要包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等；兼性厌氧革兰氏阳性球菌类主要包括粪链球菌、乳球菌和中介链球菌等，其中最为常用的人用益生菌是乳酸菌和双歧杆菌（高霞等2009，广东化工36:122-123）。

[0006] 尽管人肠道菌群中厌氧菌占99％以上，需氧菌的数量则不到1%，但需氧菌对保持肠道微生态稳定以及维护机体健康却起着至关重要的作用，如通过消耗氧气来保持肠道微生态系统的稳衡，通过分泌消化酶来促进机体对营养的吸收，通过产生维生素、氨基酸和生长因子等来满足人自身新陈代谢所需的营养等（李文建1999，中国微生态学杂志314-316）。然而，目前从人粪样中分离兼性厌氧菌或需氧菌作为益生菌的报道则较少。由于不同宿主肠道菌群的特异性，菌株来源最好与使用对象一致。很多学者认为，理想的人用益生菌应该是来自人体自身的肠道细菌，因为相对于其它来源的益生菌而言，人源益生菌具有更高的安全性和遗传稳定性，更不容易被人体肠道的免疫系统所排斥。

发明内容

[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种来自健康人肠道的大肠杆菌及其应用，该大肠杆菌通过胰岛素信号转导途径来显著延长秀丽隐杆线虫的平均寿命，显著提高秀丽隐杆线虫抗热应激能力。该大肠杆菌可在秀丽隐杆线虫体内定植，具有较强的耐受人工胃液、人工肠液和胆盐能力；该大肠杆菌可产生一氧化氮信号分子，推测对人体抗衰老可能具有一定作用，可在保健食品或药品中得到应用。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一株健康人肠道大肠杆菌（Escherichia coli）命名为JL-3，属于埃希氏菌属，保藏号为CGMCC No.14074。

[0009] 本发明中的大肠杆菌JL-3（Escherichia coli）已于2017年04月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC No.14074；中国科学院微生物研究所菌种保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0010] 本发明健康人肠道大肠杆菌JL-3的分类学特征分别为：

[0011] 菌落直径2～3 毫米，光滑、湿润，乳白色圆形扁平菌落，边缘较整齐；在LB液体培养基中培养时，液体表面长一层白膜，试管底部有絮状沉淀物，菌体在光学显微镜下呈长短不一的杆状；菌体在半固体培养基中能运动，不产芽孢，革兰氏染色呈阴性。

[0012] 人肠道菌株JL-3既可以在普通生化培养箱中生长，又可以在厌氧工作站内生长，为兼性厌氧细菌；菌株JL-3的最适生长温度为37℃，淀粉水解酶活性呈阴性，吲哚和甲基红试验均为阳性，V. P. 试验和硫化氢试验均为阴性，发酵乳糖、山梨醇、甘露醇产酸产气。

[0013] 本发明还提供了健康人肠道大肠杆菌JL-3在制备具有延长寿命、抗衰老作用的药品或保健食品中的应用。

[0014] 本发明又提供了健康人肠道大肠杆菌JL-3在制备改善心血管疾病、免疫系统疾病、循环系统疾病、中枢神经系统疾病和泌尿生殖系统疾病的药品或保健食品中的应用。

[0015] 其中，人肠道细菌具体应用包括下列步骤：

[0016] 用灭菌镊子取健康成年人新鲜粪样，放入事先备好的LB液体培养基中，在37 ℃普通生化培养箱内培养24 小时，将菌群进行系列梯度稀释（10-1～10-8），并涂布于LB琼脂平板，继续分别培养1～2天。分别挑取形态不同的菌落进行培养，通过平板划线将挑出的菌落进行纯化，平板划线至少重复三次。将分离得到的纯培养物进行命名并进行菌种保藏。本发明中所得的纯培养物全部于50%甘油中−80 ℃冻存。对所分离的纯培养物进行菌体形态观察、生理生化及16S rDNA序列分析。将分离得到的纯培养物分别喂食野生型秀丽隐杆线虫，研究不同食物对线虫寿命及抗性的影响。最终确定一株肠道细菌能显著延长野生型秀丽隐杆线虫的平均寿命，并且能显著提高线虫抗热应激能力。

[0017] 本发明中的野生型秀丽隐杆线虫以下简称秀丽隐杆线虫或线虫。

[0018] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

[0019] （1）本发明中的人肠道大肠杆菌JL-3能显著延长野生秀丽隐杆线虫的平均寿命、提高秀丽隐杆线虫的抗热应激能力；

[0020] （2）本发明中的大肠杆菌JL-3可在线虫体内定植，是通过 DAF-2/DAF胰岛素信号转导途径延长线虫寿命，胰岛素信号转导途径在包括线虫、果蝇、小鼠乃至灵长类动物在内的真核生物中高度保守，推测本发明中的大肠杆菌JL-3对人体抗衰老也会有一定作用，可以在保健食品或药品中得到应用；

[0021] （3）本发明中的大肠杆菌JL-3能产生一氧化氮（NO）信号分子。由于NO信号分子可在心血管系统、免疫系统、神经系统中发挥重要调节作用。故此，上述大肠杆菌JL-3一旦在人体内定植，则可通过产生NO减少衰老性疾病发病率，提高机体免疫力和生活质量；对高血压病人，通过服用大肠杆菌JL-3活菌菌剂则可起到降低血压，减少心脑血管发病率。

附图说明

[0022] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明；

[0023] 图1是本发明实施例1中喂食大肠杆菌JL-3后秀丽隐杆线虫的寿命曲线图；

[0024] 图2是本发明实施例1中喂食大肠杆菌JL-3后秀丽隐杆线虫在不同时间内的产卵图；

[0025] 图3是本发明实施例1中喂食大肠杆菌JL-3后秀丽隐杆线虫突变体daf-16的寿命曲线图；

[0026] 图4是本发明实施例1中喂食大肠杆菌JL-3后秀丽隐杆线虫突变体daf-2的寿命曲线图；

[0027] 图5是本发明实施例1中喂食大肠杆菌JL-3对秀丽隐杆线虫抗热应激能力影响的曲线图；

[0028] 图6是本发明实施例1中大肠杆菌JL-3产NO能力柱状图；

[0029] 图7是本发明实施例1中大肠杆菌JL-3耐人工胃液能力曲线图；

[0030] 图8是本发明实施例1中大肠杆菌JL-3耐人工肠液能力曲线图；

[0031] 图9是本发明实施例1中大肠杆菌JL-3耐胆盐能力柱状图。

具体实施方式

[0032] 实施例中所用的线虫均为野生型秀丽隐杆线虫。

[0033] 实施例1

[0034] 1、用灭菌镊子取健康人新鲜粪样，放入事先备好的LB液体培养基中，在普通生化培养箱内培养24小时，将菌群分别进行系列梯度稀释（10-1～10-8），并涂布于LB琼脂平板，继续分别培养1～2天。分别挑取形态不同的菌落进行纯培养，即将所挑出菌落进行平板划线，试验至少重复三次。所得的纯培养物于50%甘油中−80 ℃冻存。对分离的单菌落进行菌体形态观察、生理生化及16S rDNA序列分析。

[0035] 2、对秀丽隐杆线虫有延寿作用的人肠道兼性厌氧细菌的筛选

[0036] （1）菌种活化：将低温冷冻保存的细菌纯培养物融化并按10%体积比接种量接种到LB液体培养基中，37℃活化培养24 小时。次日，将活化的菌种重新转接到新鲜的LB液体培养基中进行传代，培养12 小时。

[0037] （2）野生型秀丽隐杆线虫活化：将−80℃冻存的野生型秀丽隐杆线虫取出，37℃迅速融化，离心，弃掉上清，将剩余虫体加到含有E. coli OP50的NGM培养板上，20℃恒温培养。

[0038] （3）秀丽隐杆线虫标准食物E. coli OP50的制备：挑取E. coli OP50单菌落接入2 毫升经过高压灭菌的新鲜LB液体培养基中，37℃下180转/分钟震荡培养8～12 小时，培养至OD600为1.0左右时，吸取100 微升菌液并均匀涂布到提前配制好的NGM平板的中央位置（距离平板边缘约0.5 毫米），于37 ℃倒置培养过夜，放4 ℃保存备用。

[0039] 制备秀丽隐杆线虫液体培养用标准食物E. coli OP50食物时，菌株E. coli OP50的培养方法同上，只是在培养到OD600为1.0左右时，于4℃下 4000转/分钟离心10 分钟，收集菌体，将得到的沉淀用S. Medium培养液洗涤两次，弃去上清，加入S. Medium培养液调整菌体浓度至OD600为1.0左右，放4 ℃保存备用。

[0040] （4）人肠道分离的兼性厌氧细菌食物的制备：分别将上述活化并传代好的肠道细菌用移液枪吸取150 微升涂布LB固体平板，37 ℃培养12 小时。次日，用M9缓冲液将LB板上的菌体冲洗下来，收集到离心管中，将得到的沉淀用S. Medium培养液洗涤两次，弃去上清，加入S. Medium培养液调整菌体浓度至OD600为1.0左右，放4 ℃保存备用。

[0041] （5）秀丽隐杆线虫的同步化：挑取未被杂菌污染的、处于产卵期成虫较多的秀丽隐杆线虫培养板，用M9缓冲液将虫体和卵冲洗下来，收集到离心管中，使每管的虫体量尽量一致，虫体密度不可过大。将含有产卵期成虫的离心管于4 ℃ 1500转/分钟离心1 分钟，弃掉上清。再向上述离心管中每管加入650 微升 M9缓冲液和350 微升现配的线虫裂解液，充分震荡混匀，直到用肉眼看不到虫体为止，立即取少量液体于显微镜下观察，确定是否只剩下虫卵，此过程不能超过10 分钟，否则虫卵也会受到影响，甚至死亡。在观察到离心管中只剩下虫卵的瞬间，立即于4 ℃ 3500 转/分钟离心30 秒，弃掉上清。向上述离心管中加入M9缓冲液洗涤剩余沉淀，4 ℃ 3500 转/分钟离心30 秒，弃掉上清。重复上述洗涤步骤四次。将最后得到的秀丽隐杆虫卵吸取到上述含有E. coli OP50的新鲜NGM平板（步骤（3））的边缘不含菌部分，20 ℃恒温培养，约48 小时后，这些卵将发育成为同期化的L4期线虫，用于试验研究。

[0042] （6）秀丽隐杆线虫的寿命分析：将同步化后处于L4期的秀丽隐杆线虫分别转到添加含有500微升OD600为1.0左右的不同兼性厌氧细菌液体食物的24孔板中，20 ℃恒温培养，以添加E. coli OP50液体食物的为对照，线虫条数为每孔30条。线虫每天转移到含有相应新鲜食物的孔中，死掉的虫子每天进行记录。秀丽隐杆线虫的寿命实验数据使用SPSS 19.0的Kalpan-Meir存活曲线分析程序分析。

[0043] 结果表明：从新鲜粪样中分离的兼性厌氧细菌中有一株能显著延长野生型秀丽隐杆线虫的平均寿命，如图1所示。我们将这株细菌命名为JL-3。以标准食物E. coli OP50喂食秀丽隐杆线虫时，线虫的平均生存时间为18.600±0.841天，以人肠道细菌JL-3喂食秀丽隐杆线虫时，线虫平均生存时间分别为21.531±1.254 (P<0.01)，秀丽隐杆线虫的寿命比喂食标准食物E. coli OP50 延长15.76%，经显著性分析发现，人肠道兼性厌氧菌株JL-3能极显著延长线虫寿命(P<0.01)。

[0044] 根据菌株16S rDNA序列分析，结合菌落和菌体形态特征以及生理生化指标测定结果，将人肠道细菌菌株JL-3鉴定为大肠杆菌（Escherichia coli）。

[0045] 3、大肠杆菌JL-3对秀丽隐杆线虫繁殖能力的影响

[0046] 研究结果已证实，生殖能力的缺陷或丧失会导致秀丽隐杆线虫寿命的延长。本发明对喂食大肠杆菌JL-3的线虫产卵量进行了统计。

[0047] 将上述同步化的L4期线虫500 微升添加到含大肠杆菌JL-3食物的24孔板中，以喂食标准食物E. coli OP50菌悬液做对照，线虫1条/孔，至少重复5次。每隔24 小时将成虫转移到含新鲜食物的新的24孔板的孔中，将剩余的卵留在旧孔中继续培养至L4期，观察并记录线虫后代数目。

[0048] 结果表明：喂食标准食物E. coli OP50的线虫的平均产卵量为232，喂食兼性厌氧细菌JL-3的线虫产卵量为238，如图2所示。显著性测验结果表明，与喂食E. coli OP50的对照组线虫相比，喂食人肠道大肠杆菌JL-3的线虫在产卵量上无显著差异。这一研究结果表明，分自人粪样的大肠杆菌JL-3对线虫的延寿作用并非通过牺牲生育能力来实现。

[0049] 4、大肠杆菌JL-3对秀丽隐杆线虫突变体寿命的影响

[0050] 为进一步研究健康人肠道大肠杆菌JL-3延长线虫寿命的机制，本发明分别选取了Insulin/IGF-1途径中两个关键位点进行突变的突变株，即daf-16 (mu86) 突变株和daf-2 (e1370)突变株，研究大肠杆菌JL-3对这两株线虫突变株平均寿命的影响。将30条同步化后处于L4期的daf-16 (mu86) 突变株和daf-2 (e1370)突变株分别转到添加含有500微升OD600为1.0左右的大肠杆菌JL-3食物的24孔板中，20 ℃恒温培养，以添加E. coli OP50液体食物的线虫作为对照，线虫条数为每孔30条。线虫每天转移到含相应新鲜食物的孔中，死掉的虫子每天进行记录。秀丽隐杆线虫的寿命实验数据使用SPSS 19.0的Kalpan-Meir存活曲线分析程序分析。

[0051] 喂食线虫突变体daf-16和daf-2的结果分别如图3和图4所示，研究结果表明，喂食人肠道大肠杆菌JL-3的daf-16突变株（图3）和daf-2突变株（图4）与喂食标准食物E. coli OP50的线虫突变株相比，线虫寿命均无显著性差异(P> 0.05)。该结果表明，大肠杆菌JL-3对秀丽隐杆线虫的延寿作用是通过DAF-2/DAF-16胰岛素信号转导途径进行调控的。

[0052] 5、大肠杆菌JL-3对秀丽隐杆线虫抗热应激能力的影响

[0053] 将上述同步化的L4期秀丽隐杆线虫添加到分别含有大肠杆菌JL-3和标准食物E. coli OP50的24孔板中，每孔含有E. coli OP50菌悬液和大肠杆菌JL-3菌悬液各500 微升，线虫30条/孔，每隔24 小时将成虫转移到含对应的新鲜食物的新的24孔里面，20 ℃恒温培养。到第5天时，将线虫放于37℃条件下进行热应激试验，每隔2 小时观察一次线虫存活情况。线虫死亡判断标准同上述秀丽隐杆线虫寿命试验，试验数据至少重复三次。

[0054] 当大肠杆菌JL-3和E. coli OP50喂食的秀丽隐杆线虫分别放于37 ℃下2～4小时，线虫开始死亡，当置于37 ℃下4和12小时时，喂食E. coli OP50的线虫与喂食大肠杆菌JL-3的线虫分别大量死亡，喂食E. coli OP50的线虫的平均生存时间为6.93 ± 0.88小时，喂食大肠杆菌JL-3的线虫的平均生存时间为10.87 ± 0.823小时，结果如图5所示。显著性测验结果表明，与喂食标准食物E. coli OP50的线虫相比，喂食大肠杆菌JL-3的线虫的抗热应激能力得到极显著提高(P < 0.01)。

[0055] 6、大肠杆菌JL-3产NO能力测定

[0056] 之前，本实验室从中国科学院微生物研究所菌种保藏中心购买了一株枯草芽孢杆菌（菌株保藏号: CGMCC No. 1.4255），当以该枯草芽孢杆菌喂食野生秀丽隐杆线虫时，发现与喂食E. coli OP50的对照相比，并不能显著延长线虫寿命。通过硝酸盐/亚硝酸盐分析试剂盒测定，发现所购买的枯草芽孢杆菌并不产生NO。

[0057] 将预先培养12 小时的上述大肠杆菌JL-3的菌悬液，以上述购买的枯草芽孢杆菌为对照，用一氧化氮试剂盒（南京建成）测定NO生成，具体步骤如下：

[0058] （1）分别取100 微升双蒸水作为空白管、标准品作为标准管、分别以购买的枯草芽孢和大肠杆菌JL-3的菌悬液作为测定管。

[0059] （2）加入混合试剂400 微升，混匀，37 °C准确水浴60 分钟。

[0060] （3）加入试剂三200 微升，试剂四 100 微升，充分旋涡混匀30 秒，室温静置40 分钟，3500g 向心力下离心10 分钟。

[0061] （4）分别取上清500 微升加600 微升显色剂，混匀后室温静置10 分钟进行显色。

[0062] （5）双蒸水调零，550 纳米，0.5 厘米光径，测定各管吸光度值。

[0063] （6）依据公式计算出NO含量。

[0064]

[0065] 结果发现，分自健康人肠道的大肠杆菌JL-3可以产生NO，平均含量45.68 微摩尔/升，而购买的枯草芽孢杆菌（菌株保藏号: CGMCC No. 1.4255）并不产生NO，如图6所示。为此，我们推测，如果大肠杆菌JL-3能在线虫体内定植的话，大肠杆菌JL-3延长线虫寿命除通过保守的DAF-2/DAF-16胰岛素信号转导途径外，很可能也通过产生NO信号分子来延长线虫寿命。

[0066] 7、大肠杆菌JL-3定植特性分析

[0067] 为了了解大肠杆菌JL-3在喂食秀丽隐杆线虫一段时间后是否能够定植在线虫体内，进行了如下试验：

[0068] 将同步化后处于L4期的秀丽隐杆线虫用大肠杆菌JL-3喂食3天、一周及三周后，分别按如下步骤进行表面消毒处理及培养：

[0069] （1）吸取24孔板中的秀丽隐杆线虫于1.5 毫升的EP管中，加入M9缓冲液，1200 g向心力下离心2 分钟，弃上清，离心管中加入100 微升70%酒精，对线虫表面消毒20 秒，然后立即加入1 毫升 M9缓冲液（稀释酒精）。

[0070] （2）用M9缓冲液洗涤两次后，弃上清，在离心管中加入100 微升 10%次氯酸钠，对线虫表面消毒40 秒，然后立即加入1毫升 M9缓冲液（稀释次氯酸钠），并再用M9缓冲液洗涤线虫两次。

[0071] （3）吸取表面消毒后的线虫管中的缓冲液100 微升于灭菌的LB液体培养中，37°C培养并作为对照，检测线虫表面消毒是否彻底。

[0072] （4）剩余虫体和缓冲液用事先灭菌的研棒轻轻研磨虫体，使虫体破裂，然后吸取100 微升带有磨碎虫体的缓冲液，涂布在LB固体培养基中，37°C下培养1～2天。

[0073] （5）如果步骤（3）中LB培养无菌生长说明线虫表面消毒彻底，那么步骤（4）中LB培养基中生长的菌体即为线虫体内的菌体。通过稀释涂板得到单菌落，再从菌体及菌落形态、伊红美蓝鉴定平板以及16S rDNA序列分析，来综合判定出现在LB平板上的菌落是否为大肠杆菌JL-3，如果确实为大肠杆菌JL-3，则表明大肠杆菌JL-3已在线虫体内定植。

[0074] 结果表明：当把喂食3天大肠杆菌JL-3以及喂食一周大肠杆菌JL-3的线虫研碎涂板后，均未发现平板上有菌落长出；对喂食三周大肠杆菌JL-3的线虫进行研碎涂板后，发现平板上有菌落长出，并且只有一种菌落形态。经过菌体及菌落形态观察和伊红美蓝平板鉴定，确认平板上长出的菌落就是喂食的大肠杆菌JL-3，我们的研究结果表明，喂食三周后大肠杆菌JL-3可在线虫体内定植。

[0075] 8、大肠杆菌JL-3胃肠运转耐受能力测定

[0076] （1）大肠杆菌JL-3对人工胃液的耐受能力

[0077] 将培养好的大肠杆菌JL-3以10%接种量接种到pH为3的人工胃液中，置37°C恒温培养箱中分别处理30 分钟和180 分钟，处理后的溶液用无菌水做10-1～10-5梯度稀释，对10-5浓度取样50微升涂布于LB固体平皿中，以未经人工胃液处理的大肠杆菌JL-3作为对照，置37°C恒温培养箱培养24 小时，观察并记录单菌落数量。

[0078] （2）大肠杆菌JL-3对人工肠液的耐受能力

[0079] 将培养好的大肠杆菌JL-3以10%接种量接种到人工肠液中，培养温度、培养时间、无菌水处理以及梯度稀释和平板涂布均同上述人工胃液处理。以未经人工肠液处理的大肠杆菌JL-3作为对照，置37°C恒温培养箱培养24小时，观察并记录单菌落数量。

[0080] （3）大肠杆菌JL-3对胆盐的耐受能力

[0081] 将大肠杆菌JL-3分别接种到含有0.08%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%浓度牛胆盐的液体LB培养基，培养24小时后用无菌水进行10-1～10-4的梯度稀释，从10-4稀释度中取样50 微升涂布于LB固体平皿，以未经胆盐处理的大肠杆菌JL-3作为对照，置37°C恒温培养箱培养24小时，观察并记录单菌落数量。

[0082] 结果表明：大肠杆菌JL-3经人工胃液处理后，随处理时间的延长，耐受人工胃液能力逐渐下降，如图7所示。在处理180 分钟时，大肠杆菌JL-3的平均存活率为57.59%，表明大肠杆菌JL-3对人工胃液具有较强的耐受能力。同样地，大肠杆菌JL-3经人工肠液处理后，随处理时间的延长，菌株耐受人工肠液能力逐渐下降，如图8所示。处理180分钟后，大肠杆菌JL-3的平均存活率为57.23%表明大肠杆菌JL-3对人工肠液具有较强的耐受能力。

[0083] 大肠杆菌JL-3经不同浓度的胆盐处理24 小时后发现，随胆盐浓度升高，秀丽隐杆线虫存活率逐渐下降，如图9所示。经24 小时处理后，大肠杆菌JL-3在浓度为0.3%的胆盐中的存活率仍有4.86%，表明大肠杆菌JL-3对0.08%～0.3%浓度的胆盐耐受性较强。

[0084] 菌株胃肠运转耐受能力是指菌株能够耐受人工胃液、人工肠液和胆盐的能力。如果菌株的胃肠运转耐受能力较强，就说明菌株很可能能够在人体肠道内定植。因为：人体胃液pH很低，如果能够耐受人工胃液，表明菌株能耐受很酸的而环境，在胃内存留期间不至于死亡，进而能够顺利进入肠道；肠道环境中胆盐含量高且肠液成分复杂，到达肠道的外来菌株只有能够耐受肠道内的高胆盐和复杂的肠液环境，才有可能存活下来，存活下来后就有了定植到肠粘膜上的可能。所以，如果菌株的胃肠运转耐受能力较强，说明该菌株在动物体内的定植能力较强。