一种提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基及其制备方法

摘要

一种提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基及其制备方法，以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖10‑30g，酵母浸粉10‑30g、硫酸锰0.02‑0.05g、吐温800.5‑1.5g，菊糖1‑3g、酪蛋白胨3‑5g、磷酸氢二钠4‑7g、亮氨酸12‑18mg，黄瓜汁10‑20mL、初始pH值为7.0‑7.5。本发明提供的培养基，在常用基础培养基上添加了菊糖、亮氨酸、黄瓜汁，对提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶的活力有很好的效果；且这些物质廉价易得，制作方法简单易行，利于大规模生产。

权利要求

1.一种提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基，其特征在于：以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖10-30g、 酵母浸粉10-30g、硫酸锰0.02-0.05g、吐温80 0.5-1.5g、 菊糖1-3g、酪蛋白胨3-5g、磷酸氢二钠4-7g、亮氨酸12-18mg、 黄瓜汁10-

20mL、初始pH值为7.0-7.5。

2.一种提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)黄瓜汁的制备：将新鲜的黄瓜清洗干净并去皮，切块后加入蒸馏水打浆，即得到黄瓜汁；

2)亮氨酸溶液制备：将亮氨酸制成质量浓度为1％的溶液并通过膜过滤除菌；

3)培养基的制备：将葡萄糖、酵母浸粉、硫酸锰、吐温80、菊糖、酪蛋白胨、磷酸氢二钠加入水中配成溶液，将溶液进行灭菌后加入已除菌的亮氨酸和黄瓜汁，调节pH至7-7.5得培养基，所述培养基以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖10-30g、 酵母浸粉10-30g、硫酸锰0.02-0.05g、吐温80 0.5-1.5g、 菊糖1-3g、酪蛋白胨3-5g、磷酸氢二钠

4-7g、亮氨酸12-18mg、 黄瓜汁10-20mL；

所述2)中的过滤膜为0.22微米过滤膜，在使用前先经过121℃，15min高压灭菌。

3.根据权利要求2所述的提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基的制备方法，其特征在于：所述1)中制备黄瓜汁时加入黄瓜质量2倍的水打浆。

4.根据权利要求2所述的提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基的制备方法，其特征在于：所述3)溶液灭菌是在121℃，灭菌15min。

5.根据权利要求2所述的提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基的制备方法，其特征在于：所述3)中的pH是用1mol/L的盐酸或1mol/L的NaOH溶液调节。

说明书

一种提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于益生菌制品制备技术领域，涉及一种益生菌培养基的制备方法，特别涉及一种提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基及其制备方法。

背景技术

[0002] 乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)是一类有益微生物，不仅存在于乳及乳制品中，也存在于人畜肠道中，是人体重要的益生菌。具有调节人体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生等作用。乳酸菌耐酸，适应肠道的生态环境，便于在人体肠道内繁衍增殖。如果因抗生素、化疗、年龄、饮食等因素引起体内菌群失调，通过口服这些有益菌的活菌制剂，可获得较好的治疗效果。长期食用含有乳酸菌活菌的食物，可使体内菌群的协调性增强，提高免疫力。

[0003] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌的一种，属于乳杆菌属，形状有时为短杆型，有时则成对或成链状出现，无芽胞产生，将其接入LBS琼脂培养基中生长时，呈现圆形、光滑细密的菌落，颜色为不透明的灰白色，为革兰氏阳性菌，其最适生长温度和最适pH值分别为30～35℃和6.5，能在10℃生长，在pH值4.5～9.5也可生长。植物乳杆菌是同型发酵乳酸菌，它能够发酵许多常见的糖类以产酸，经常存在于一些发酵食品中，例如一些蔬菜、酸乳饮料以及经过发酵的果汁中等，经乳酸菌发酵后的一些植物蛋白的植物乳酸菌饮品，既提升了口感，同时又保留了植物蛋白所具有的营养成分和保健功能。

[0004] 植物乳杆菌的胞壁蛋白酶能与其他一些酶类共同作用水解乳蛋白，释放出不同的肽类以及一些游离的氨基酸，其中的一些肽类具有生物活性，如ACE抑制肽和抗氧化肽。在整个水解过程中，胞壁蛋白酶是其中最重要的酶，已有研究发现一些胞壁蛋白酶单独就可以水解乳蛋白并产生ACE抑制肽和抗氧化肽，而要使得ACE抑制率和抗氧化性的活性较高，必须保证胞壁蛋白酶的活力。

[0005] 培养基的选择对于乳杆菌的生长有着非常重要的作用，直接影响到菌体的密度和生产周期。要得到高活菌数以及保持菌体好的代谢，首先必须筛选适合乳酸菌生长代谢的培养基。目前，植物乳杆菌大都采用MRS作为基础培养基，然后配合其他的生长因子来培养植物乳杆菌。任晓芬对嗜酸乳杆菌JQ-1产胞壁蛋白酶做了相关研究，以MRS为基础培养基，对其碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖)和氮源(牛肉蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨)进行正交实验，结果发现产胞壁蛋白酶的最佳碳源氮源组合为2％葡萄糖+1％牛肉蛋白胨。张重阳等对瑞士乳杆菌ATCC15019产胞壁蛋白酶的培养基成分及条件进行了研究，将MRS培养基中其他成分保持不变，采用正交实验设计优化碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖)和氮源(普通蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨)，最终发现0.5％蔗糖+1％牛肉蛋白胨为最佳组合。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶活力的培养基及其制备方法。

[0007] 为达到上述目的，本发明的培养基以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖10-30g，酵母浸粉10-30g、硫酸锰0.02-0.05g、吐温80 0.5-1.5g，菊糖1-3g、酪蛋白胨3-5g、磷酸氢二钠4-7g、亮氨酸12-18mg，黄瓜汁10-20mL、初始pH值为7.0-7.5。

[0008] 本发明的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 1)黄瓜汁的制备：将新鲜的黄瓜清洗干净并去皮，切块后加入蒸馏水打浆，即得到黄瓜汁；

[0010] 2)亮氨酸溶液制备：将亮氨酸制成质量浓度为1％的溶液并通过膜过滤除菌；

[0011] 3)培养基的制备：将葡萄糖、酵母浸粉、硫酸锰、吐温80、菊糖、酪蛋白胨、磷酸氢二钠加入水中配成溶液，然后经121℃，15min灭菌，灭菌后加入已除菌的亮氨酸和黄瓜汁，调节pH至7-7.5培养基，以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖10-30g，酵母浸粉10-30g、硫酸锰0.02-0.05g、吐温80 0.5-1.5g，菊糖1-3g、酪蛋白胨3-5g、磷酸氢二钠4-7g、亮氨酸12-18mg，黄瓜汁10-20mL。

[0012] 所述1)中制备黄瓜汁时加入黄瓜质量2倍的水打浆。

[0013] 所述2)中的过滤膜为0.22微米过滤膜，在使用前先经过121℃，15min高压灭菌。

[0014] 所述3)中的pH是用1mol/L的盐酸或1mol/L的NaOH溶液调节。

[0015] 将植物乳杆菌LP69以3％的接种量接入到本发明所制备的培养基中，在37℃恒温培养箱中培养20h后取出，在4℃、4500r/min的条件下离心20min，倒掉上清液，收集菌体沉淀，之后用Tris-HCL(50mmol/L，pH 7.8，含30mmol/L的Ca2+)缓冲液重复洗涤菌体三次。将Tris-HCL(含50mmol/L EDTA-Na2，50mmol/L，pH7.0)缓冲液加入到上述菌体沉淀中，菌体与Tris-HCL缓冲液的比例为1:38-45，在搅拌机上搅拌均匀，37℃保温1-2h，之后在4℃、4500r/min条件下离心20min，所得上清液即为胞壁蛋白酶的粗酶液，酶活力采用福林酚法进行测定，蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，比活力的计算方式为酶活力除以蛋白含量。测得酶活为(20-25)U/mL，比活力为(0.9-1.2)U/mg，相较于商业MRS肉汤培养基培养的酶活(13-
18)U/mL和比活力(0.4-0.7)U/mg，酶活和比活力都有了显著提高。

[0016] 本发明提供的培养基，在常用基础培养基上添加了菊糖、亮氨酸、黄瓜汁，对提高植物乳杆菌胞壁蛋白酶的活力有很好的效果；且这些物质廉价易得，制作方法简单易行，利于大规模生产。

具体实施方式

[0017] 本发明结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明。

[0018] 实施例1：

[0019] 1)黄瓜汁的制备：将新鲜的黄瓜清洗干净并去皮，切块后加入黄瓜质量2倍的蒸馏水打浆，即得到黄瓜汁；

[0020] 2)亮氨酸溶液制备：将亮氨酸制成质量浓度为1％的溶液并通过0.22微米过滤膜过滤，经过121℃，15min高压灭菌；

[0021] 3)培养基的制备：将葡萄糖、酵母浸粉、硫酸锰、吐温80、菊糖、酪蛋白胨、磷酸氢二钠加入水中配成溶液，然后经121℃，15min灭菌，灭菌后加入已除菌的亮氨酸和黄瓜汁，调节pH至7.3培养基，以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖15g，酵母浸粉15g、硫酸锰0.04g、吐温80 0.8g，菊糖2g、酪蛋白胨4g、磷酸氢二钠6g、亮氨酸15mg，黄瓜汁16mL。

[0022] 将植物乳杆菌LP69以3％的接种量接入到本发明所制备的培养基中，在37℃恒温培养箱中培养20h后取出，在4℃、4500r/min的条件下离心20min，倒掉上清液，收集菌体沉淀，之后用Tris-HCL(50mmol/L，pH 7.8，含30mmol/L的Ca2+)缓冲液重复洗涤菌体三次。将Tris-HCL(含50mmol/LEDTA-Na2，50mmol/L，pH7.0)缓冲液加入到上述菌体沉淀中，菌体与Tris-HCL缓冲液的比例为1:39，在搅拌机上搅拌均匀，37℃保温1.5h，之后在4℃、4500r/min条件下离心20min，所得上清液即为胞壁蛋白酶的粗酶液，酶活力采用福林酚法进行测定，蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，比活力的计算方式为酶活力除以蛋白含量。测得酶活为23U/mL，比活力为0.95U/mg，相较于商业MRS肉汤培养基培养的酶活(13-18)U/mL和比活力(0.4-0.7)U/mg，酶活和比活力都有了显著提高。

[0023] 实施例2：

[0024] 1)黄瓜汁的制备：将新鲜的黄瓜清洗干净并去皮，切块后加入黄瓜质量2倍的蒸馏水打浆，即得到黄瓜汁；

[0025] 2)亮氨酸溶液制备：将亮氨酸制成质量浓度为1％的溶液并通过0.22微米过滤膜过滤，经过121℃，15min高压灭菌；

[0026] 3)培养基的制备：将葡萄糖、酵母浸粉、硫酸锰、吐温80、菊糖、酪蛋白胨、磷酸氢二钠加入水中配成溶液，然后经121℃，15min灭菌，灭菌后加入已除菌的亮氨酸和黄瓜汁，调节pH至7.2培养基，以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖20g，酵母浸粉25g、硫酸锰0.039g、吐温80 1g，菊糖1.8g、酪蛋白胨4.2g、磷酸氢二钠5.5g、亮氨酸16mg，黄瓜汁12mL。

[0027] 将植物乳杆菌LP69以3％的接种量接入到本发明所制备的培养基中，在37℃恒温培养箱中培养20h后取出，在4℃、4500r/min的条件下离心20min，倒掉上清液，收集菌体沉淀，之后用Tris-HCL(50mmol/L，pH 7.8，含30mmol/L的Ca2+)缓冲液重复洗涤菌体三次。将Tris-HCL(含50mmol/LEDTA-Na2，50mmol/L，pH7.0)缓冲液加入到上述菌体沉淀中，菌体与Tris-HCL缓冲液的比例为1:41，在搅拌机上搅拌均匀，37℃保温1h，之后在4℃、4500r/min条件下离心20min，所得上清液即为胞壁蛋白酶的粗酶液，酶活力采用福林酚法进行测定，蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，比活力的计算方式为酶活力除以蛋白含量。测得酶活为21U/mL，比活力为1.1U/mg，相较于商业MRS肉汤培养基培养的酶活(13-18)U/mL和比活力(0.4-0.7)U/mg，酶活和比活力都有了显著提高。

[0028] 实施例3：

[0029] 1)黄瓜汁的制备：将新鲜的黄瓜清洗干净并去皮，切块后加入黄瓜质量2倍的蒸馏水打浆，即得到黄瓜汁；

[0030] 2)亮氨酸溶液制备：将亮氨酸制成质量浓度为1％的溶液并通过0.22微米过滤膜过滤，经过121℃，15min高压灭菌；

[0031] 3)培养基的制备：将葡萄糖、酵母浸粉、硫酸锰、吐温80、菊糖、酪蛋白胨、磷酸氢二钠加入水中配成溶液，然后经121℃，15min灭菌，灭菌后加入已除菌的亮氨酸和黄瓜汁，调节pH至7.4培养基，以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖25g，酵母浸粉28g、硫酸锰0.043g、吐温80 1.3g，菊糖2g、酪蛋白胨3g、磷酸氢二钠6g、亮氨酸12mg，黄瓜汁18mL。

[0032] 将植物乳杆菌LP69以3％的接种量接入到本发明所制备的培养基中，在37℃恒温培养箱中培养20h后取出，在4℃、4500r/min的条件下离心20min，倒掉上清液，收集菌体沉淀，之后用Tris-HCL(50mmol/L，pH 7.8，含30mmol/L的Ca2+)缓冲液重复洗涤菌体三次。将Tris-HCL(含50mmol/L EDTA-Na2，50mmol/L，pH7.0)缓冲液加入到上述菌体沉淀中，菌体与Tris-HCL缓冲液的比例为1:43，在搅拌机上搅拌均匀，37℃保温1h，之后在4℃、4500r/min条件下离心20min，所得上清液即为胞壁蛋白酶的粗酶液，酶活力采用福林酚法进行测定，蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，比活力的计算方式为酶活力除以蛋白含量。测得酶活为24U/mL，比活力为0.98U/mg，相较于商业MRS肉汤培养基培养的酶活(13-18)U/mL和比活力(0.4-0.7)U/mg，酶活和比活力都有了显著提高。

[0033] 实施例4：

[0034] 1)黄瓜汁的制备：将新鲜的黄瓜清洗干净并去皮，切块后加入黄瓜质量2倍的蒸馏水打浆，即得到黄瓜汁；

[0035] 2)亮氨酸溶液制备：将亮氨酸制成质量浓度为1％的溶液并通过0.22微米过滤膜过滤，经过121℃，15min高压灭菌；

[0036] 3)培养基的制备：将葡萄糖、酵母浸粉、硫酸锰、吐温80、菊糖、酪蛋白胨、磷酸氢二钠加入水中配成溶液，然后经121℃，15min灭菌，灭菌后加入已除菌的亮氨酸和黄瓜汁，调节pH至7.1培养基，以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖18g，酵母浸粉21g、硫酸锰0.05g、吐温80 1.5g，菊糖1.7g、酪蛋白胨5g、磷酸氢二钠6.4g、亮氨酸18mg，黄瓜汁15mL。

[0037] 将植物乳杆菌LP69以3％的接种量接入到本发明所制备的培养基中，在37℃恒温培养箱中培养20h后取出，在4℃、4500r/min的条件下离心20min，倒掉上清液，收集菌体沉淀，之后用Tris-HCL(50mmol/L，pH 7.8，含30mmol/L的Ca2+)缓冲液重复洗涤菌体三次。将Tris-HCL(含50mmol/L EDTA-Na2，50mmol/L，pH7.0)缓冲液加入到上述菌体沉淀中，菌体与Tris-HCL缓冲液的比例为1:43，在搅拌机上搅拌均匀，37℃保温2h，之后在4℃、4500r/min条件下离心20min，所得上清液即为胞壁蛋白酶的粗酶液，酶活力采用福林酚法进行测定，蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，比活力的计算方式为酶活力除以蛋白含量。测得酶活为20U/mL，比活力为1.2U/mg，相较于商业MRS肉汤培养基培养的酶活(13-18)U/mL和比活力(0.4-0.7)U/mg，酶活和比活力都有了显著提高。

[0038] 实施例5：

[0039] 1)黄瓜汁的制备：将新鲜的黄瓜清洗干净并去皮，切块后加入黄瓜质量2倍的蒸馏水打浆，即得到黄瓜汁；

[0040] 2)亮氨酸溶液制备：将亮氨酸制成质量浓度为1％的溶液并通过0.22微米过滤膜过滤，经过121℃，15min高压灭菌；

[0041] 3)培养基的制备：将葡萄糖、酵母浸粉、硫酸锰、吐温80、菊糖、酪蛋白胨、磷酸氢二钠加入水中配成溶液，然后经121℃，15min灭菌，灭菌后加入已除菌的亮氨酸和黄瓜汁，调节pH至7培养基，以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖10g，酵母浸粉10g、硫酸锰0.03g、吐温80 1.0g，菊糖3g、酪蛋白胨3.5g、磷酸氢二钠4g、亮氨酸14mg，黄瓜汁20mL。

[0042] 实施例6：

[0043] 1)黄瓜汁的制备：将新鲜的黄瓜清洗干净并去皮，切块后加入黄瓜质量2倍的蒸馏水打浆，即得到黄瓜汁；

[0044] 2)亮氨酸溶液制备：将亮氨酸制成质量浓度为1％的溶液并通过0.22微米过滤膜过滤，经过121℃，15min高压灭菌；

[0045] 3)培养基的制备：将葡萄糖、酵母浸粉、硫酸锰、吐温80、菊糖、酪蛋白胨、磷酸氢二钠加入水中配成溶液，然后经121℃，15min灭菌，灭菌后加入已除菌的亮氨酸和黄瓜汁，调节pH至7.5培养基，以每1000mL无菌水溶液所含的物质计，包括以下组分：葡萄糖30g，酵母浸粉30g、硫酸锰0.02g、吐温80 0.5g，菊糖1g、酪蛋白胨4.5g、磷酸氢二钠7g、亮氨酸17mg，黄瓜汁10mL。