一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法

摘要

本发明提供了一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法，属于植物组培技术领域。本发明提供的愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法包括：取愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗进行炼苗5～10d，得炼苗后小苗，所述炼苗的温度为15～18℃，光照强度为800～1000lx，每天光照5～8h，炼苗湿度为70～80％；将得到的所述炼苗后小苗移栽至移栽基质中，每天向小苗根部的基质中添加营养液。经过本发明的炼苗移栽过程，愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的移栽成活率高达91％以上，本发明提供的炼苗移栽方法操作简单，人工成本低，解决了暴马丁香愈伤组织诱导的组培苗移栽之后成活率低的问题。

权利要求

1.一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法，包括：

1)取愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗进行炼苗5～10d，得炼苗后小苗，所述炼苗的温度为15～18℃，光照强度为800～1000lx，每天光照5～8h，炼苗湿度为70～80％；

2)将步骤1)得到的所述炼苗后小苗移栽至移栽基质中，每天向小苗根部的基质中添加营养液；

所述移栽基质包括河沙和蛭石中的一种和草炭土的混合物；

所述营养液以1/3MS液体培养基和1/3WPM液体培养基为基本培养基，包含2mg/L的IBA和1mg/L的NAA；

所述组培苗的培育方法，包括以下步骤：

a)取暴马丁香的发育下胚轴接种至愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养40～60d，得愈伤组织；步骤a)所述诱导培养的培养基以MS固体培养基为基本培养基，还包括5mg/L的BA和0.5mg/L的IBA；

b)将所述步骤a)得到的愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上，培养40～55d，得愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗；所述不定芽诱导培养基以1/2MS固体培养基为基本培养基，包含

0.1mg/L的2,4-D，3mg/L的BA和0.5mg/L的NAA；

所述愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗在炼苗前，还包括：将所述组培苗移栽到壮苗培养基上进行壮苗培养，所述壮苗培养的时间为7～12d，所述壮苗培养基以1/6MS固体培养基和1/6WPM固体培养基为基本培养基，pH值为5.8～6.5。

2.根据权利要求1所述的炼苗移栽方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导的组培苗，苗高不低于3cm，根数不少于4条。

3.根据权利要求1所述的炼苗移栽方法，其特征在于，步骤2)所述营养液添加在所述移栽基质的表面，所述添加的位置距离所述小苗0.8～1.5cm。

4.根据权利要求1所述的炼苗移栽方法，其特征在于，步骤2)所述营养液共添加13～

16d，每天添加的量为15～25ml。

5.根据权利要求1所述的炼苗移栽方法，其特征在于，步骤a)所述诱导培养的条件为：温度20～24℃，光照强度2000lx，光照时间每天10～12h。

6.根据权利要求1所述的炼苗移栽方法，其特征在于，步骤a)所述发育下胚轴的获取方法包括以下步骤：将消毒后的种子接种于MS固体培养基上进行离体培养10d后，切取得到发育下胚轴。

7.根据权利要求6所述的炼苗移栽方法，其特征在于，所述消毒为清洗干净所述种子，清水冲洗1～2h，然后用体积百分含量为75％的乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，风干后再用质量百分含量0.1％的升汞消毒5～10min，无菌水冲洗3～5次。

说明书

一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法

技术领域

[0001] 本发明属于一种生物组培技术领域，更具体涉及一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法。

背景技术

[0002] 暴马丁香Syringareticulata(Blume)，又称暴马子、白丁香，为木犀科丁香树落叶小乔木。丁香树全世界约35种，主要分布于亚洲和欧洲的温带地区，我国产25种以上。暴马丁香作为一种观赏植物因其枝叶繁茂、花序硕大、浓香袭人，是我国北方园林中应用较普遍的树种之一，此外，其材质坚实致密，结构均一；精油含量丰富，具有广泛的生物活性；暴马丁香的景观价值和经济价值日益受到人们的重视。暴马丁香主要用常规的繁殖方法，以种子繁殖和扦插，嫁接等无性繁殖法。但种子繁殖所用的种子需要复杂的催芽过程，且出苗不均匀，初期生长慢以及结实受大小年影响等特点，使得丁香这类品种较多的观花类型，由于其本身大多为杂合遗传型，故种子繁殖无法保持其品种的典型性状。

[0003] 目前，对暴马丁香离体培养有了一定的研究，利用芽增殖和愈伤组织两个途径确立了一套较为系统的暴马丁香组织培养再生系统，但是组培苗在无菌湿润的组培环境状态下，根系对周围水分充足、养分丰富的环境产生了适应性，其次，试管苗较小，对不良环境的缓冲能力十分有限，抗性较差，直接移栽到基质中放到自然环境中非常容易造成缺水枯萎，降低成活率；另外，针对暴马丁香而言，愈伤组织诱导的组培苗比一般茎段诱导的组培苗更弱，加剧了移栽死亡率，使成活率更低。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法，降低移栽死亡率，提高成活率。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法，包括：

[0007] 1)取愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗进行炼苗5～10d，得炼苗后小苗，所述炼苗的温度为15～18℃，光照强度为800～1000lx，每天光照5～8h，炼苗湿度为70～80％；

[0008] 2)将步骤1)得到的所述炼苗后小苗移栽至移栽基质中，每天向小苗根部的基质中添加营养液；

[0009] 所述移栽基质包括河沙和蛭石中的一种和草炭土的混合物；

[0010] 所述营养液以1/3MS液体培养基和1/3WPM液体培养基为基本培养基，包含2mg/L的IBA和1mg/L的NAA。

[0011] 优选的，所述愈伤组织诱导的组培苗，苗高不低于3cm，根数不少于4条。

[0012] 优选的，步骤2)所述营养液添加在所述移栽基质的表面，所述添加的位置距离所述小苗0.8～1.5cm。

[0013] 优选的，步骤2)所述营养液共添加13～16d，每天添加的量为15～25ml。

[0014] 优选的，所述组培苗的培育方法，包括以下步骤：

[0015] a)取暴马丁香的发育下胚轴接种至愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养40～60d，得愈伤组织；

[0016] b)将所述步骤a)得到的愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上，培养40～55d，得愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗。

[0017] 优选的，步骤a)所述诱导培养的培养基以MS固体培养基为基本培养基，还包括5mg/L的BA和0.5mg/L的IBA。

[0018] 优选的，步骤a)所述诱导培养的条件为：温度20～24℃，光照强度2000lx，光照时间每天10～12h。

[0019] 优选的，所述发育下胚轴的获取方法包括以下步骤：将消毒后的种子接种于MS固体培养基上进行离体培养10d后，切取得到发育下胚轴。

[0020] 优选的，所述消毒为清洗干净所述种子，清水冲洗1～2h，然后用体积百分含量为75％的乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，风干后再用质量百分含量0.1％的升汞消毒5～
10min，无菌水冲洗3～5次。

[0021] 优选的，所述愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗在炼苗前，还包括将所述组培苗移栽到壮苗培养基上进行壮苗培养，所述壮苗培养的时间为7～12d，所述壮苗培养基以1/6MS固体培养基和1/6WPM固体培养基为基本培养基，pH值为5.8～6.5。

[0022] 本发明提供了一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法。本发明提供的炼苗移栽方法将在无菌湿润环境中获得组培苗，经过炼苗，使得组培苗对外部环境有一定的缓冲能力，提高抗性；炼苗过程中，向幼苗根部添加营养液，形成一种有利于植物生长的外部营养环境，保证试管苗的根部吸收足够的养分和水分，不仅节约了成本，还降低移栽死亡率，提高成活率至91％以上。

具体实施方式

[0023] 本发明提供了一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法，包括：

[0024] 1)取愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗进行炼苗5～10d，得炼苗后小苗，所述炼苗的温度为15～18℃，光照强度为800～1000lx，每天光照5～8h，炼苗湿度为70～80％；

[0025] 2)将步骤1)得到的所述炼苗后小苗移栽至移栽基质中，每天向小苗根部的基质中添加营养液；

[0026] 所述移栽基质包括河沙和蛭石中的一种和草炭土的混合物；

[0027] 所述营养液以1/3MS液体培养基和1/3WPM液体培养基为基本培养基，包含2mg/L的IBA和1mg/L的NAA。

[0028] 本发明在进行炼苗移栽前，优选进行组培苗的培育。在本发明中，所述暴马丁香愈伤组织诱导的组培苗的培育方法，包括以下步骤：

[0029] a)取暴马丁香的发育下胚轴接种至愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养40～60d，得愈伤组织；

[0030] b)将所述步骤a)得到的愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上，培养40～55d，得愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗。

[0031] 本发明取暴马丁香的发育下胚轴接种至愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养40～60d，得愈伤组织。在本发明中，所述诱导培养的时间优选为50d。在本发明中，所述发育下胚轴的获取方法优选包括：将消毒后的暴马丁香种子接种于MS固体培养基上进行离体培养10d后切取得到发育下胚轴。本发明对所述暴马丁香种子的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的暴马丁香种子常规市售产品即可。

[0032] 在本发明中，暴马丁香种子的消毒方法优选为：清洗干净所述种子，清水冲洗1～2h，然后用体积百分含量为75％的乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，风干后再用质量百分含量
0.1％的升汞消毒5～10min，无菌水冲洗3～5次。

[0033] 得到消毒的种子后，本发明将消毒的种子切开，切取下胚轴，得到下胚轴后，本发明在进行愈伤组织诱导培养前，优选将下胚轴置于离体培养基中进行下胚轴离体培养，在本发明中，所述离体培养的培养基优选为MS固体培养基，所述下胚轴离体培养的条件优选为：培养温度20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h；所述离体培养的时间优选10d；得到发育的下胚轴后。本发明优选将发育的下胚轴切成5～7mm的段，接入愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，所述愈伤组织诱导培养基优选以MS固体培养基为基本培养基，还包括5mg/L的BA和0.5mg/L的IBA；所述诱导培养的条件优选为：温度20～24℃，光照强度2000lx，光照时间每天10～12h，光照时间优选为每天12h。

[0034] 得到愈伤组织后，本发明将得到的愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上，培养40～55d，得愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗。在本发明中，所述培养时间优选为46～52d，更优选为50d。在本发明中，所述愈伤组织优选选取生长致密、翠绿、疏松的愈伤组织。在本发明中，所述不定芽诱导培养基优选以1/2MS固体培养基为基本培养基，包含0.1mg/L的2,4-D，3mg/L的BA和0.5mg/L的NAA；所述培养的条件为：温度20～24℃，光照强度2000lx，光照时间每天12h。

[0035] 得到愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗后，在所述愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗在炼苗前，本发明优选将组培苗移栽到壮苗培养基上进行壮苗培养进行壮苗培养。在本发明中，所述壮苗培养的时间优选为7～12d，更优选为10d。在本发明中，所述壮苗培养基以1/6MS固体培养基和1/6WPM固体培养基为基本培养基，在本发明中，所述1/6MS固体培养基和
1/6WPM固体培养基的体积比优选为(1～2):(1～3)，更优选为1:1；所述壮苗培养基的pH值优选为5.8～6.5，更优选为5.8。在本发明中，所述壮苗培养基中不添加糖分和激素，把无机盐的离子浓度降低，可以促进试管苗生根，增加移栽后苗的成活率。

[0036] 本发明取愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗进行炼苗5～10d，得炼苗后小苗，所述炼苗的温度为15～18℃，光照强度为800～1000lx，每天光照5～8h，炼苗湿度为70～80％。在本发明中，所述炼苗的温度优选为16℃；在本发明中，所述光照强度优选为900lx，每天光照时间优选为6h；在本发明中，所述炼苗湿度优选为75％。在本发明中，所述愈伤组织诱导的组培苗，苗高优选不低于3cm，根数优选不少于4条，所述组培苗优选选取生长良好的组培苗进行炼苗。本发明优选在无菌培养室进行炼苗。

[0037] 得到炼苗后小苗后，本发明将所述炼苗后小苗移栽至移栽基质中，每天向小苗根部的基质中添加营养液；所述营养液以1/3MS液体培养基和1/3WPM液体培养基为基本培养基，所述/3MS液体培养基和1/3WPM液体培养基的体积比优选为(1～3)：(1～2)，更优选的为1:1；所述营养液中优选包含2mg/L的IBA和1mg/L的NAA。在本发明中，所述移栽优选移栽到直径12cm的营养钵中，每个营养钵中优选的移栽一棵所述移栽后小苗。在本发明中，所述移栽基质包括河沙和蛭石中的一种和草炭土的混合物，即所述移栽基质包括河沙与草炭土的混合物，或蛭石与草炭土的混合物，当所述移栽基质为河沙和草炭土的混合物时，所述河沙与草炭土的体积比优选为(1～3)：(3～8)，更优选为(2～3)：(4～5)，最优选为2:5；当所述移栽基质为蛭石和草炭土的混合物时，所述蛭石与草炭土的体积比优选为(1～3)：(3～8)，更优选为(2～3)：(4～5)，最优选为2:5。在本发明中，河沙、蛭石、草炭土价格较低，购买方便，且草炭土的保水性好，但是如果基质都是草炭土，容易造成组培苗烂根，当加入河沙或蛭石后，提高了草炭土的透水性，有利于提高组培苗的移栽成活率。在本发明中，所述移栽基质在使用前优选经过高温200℃消毒30min，然后自然冷却至室温；本发明所述基质在使用前优选用水把基质浇透，具体达到基质滴水即可；

[0038] 本发明中所述营养液添加在所述移栽基质的表面，所述添加的位置距离所述小苗0.8～1.5cm。在本发明中，所述营养液的添加方式优选为注射，所述注射的位置为移栽基质的表面，优选的距离所述小苗0.8～1.5cm，更优选的距离所述小苗1cm处的基质中，所述注射的量优选的为每棵小苗15～25ml/次，更优选的为20ml/次；在本发明中，所述注射优选为每天早上注射，更优选的每天早上7:30注射；在本发明中，所述注射优选为连续性注射，所述注射的时间优选为13～16d，更优选为15d。本发明所述注射的方式能够使幼苗根部形成一个相对高营养、高湿的环境，有利于植物生长，20ml的注入量，不至形成过高的高湿环境从而引起烂根，在局部使用所述营养液，可以保证试管苗的根部吸收足够的养分和水分，大大降低了死亡率，使成活率达到91％以上。

[0039] 下面结合实施例对本发明提供的一种愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0040] 实施例1

[0041] (1)选择成熟的暴马丁香的种子，采用洗衣粉清洗干净，然后再用清水冲洗1h；置于超净工作台上用体积百分含量为75％的乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次，放在无菌滤纸上风干，再用质量百分含量为0.1％升汞消毒8min，然后用无菌水冲洗3次，得消毒后种子；

[0042] (2)将消毒过的种子切开，把下胚轴接入MS培养基中培养，培养条件为：培养温度为22℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养10天，得发育后下胚轴；

[0043] (3)取5mm的下胚轴接种在以MS固体培养基为基本培养基，包含有5mg/LBA、0.5mg/LIBA的愈伤组织诱导培养基上，在温度为20℃，光照强度为2000lx，每天光照12h，培养50天，得愈伤组织；

[0044] (4)把生长致密、翠绿、疏松的愈伤组织接种到以1/2MS培养基为基本培养基，包含有0.1mg/L的2，4-D、3mg/L的BA和0.5mg/L的NAA的不定芽诱导培养基上，在温度为20℃，光照强度为2000lx，每天光照12h条件下诱导培养50d，得到愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗；

[0045] (5)再将组培苗转移到以1/6MS固体培养基和1/6WPM固体培养基为基本培养基的混合培养基中，在温度为20℃，光照强度为2000lx，每天光照12h，壮苗培养10d；

[0046] (6)在无菌，温度15℃，光照强度800lx，每天光照5h，室内湿度70％环境下，将幼苗移栽入河沙和草炭土体积比2:5的移栽培养基中，移栽炼苗5d，得炼苗后小苗，炼苗过程中，每天向距离小苗1cm的基质表面注射以1/3MS液体培养基和1/3WPM液体培养基为基本培养基，包含2mg/L的IBA和1mg/L的NAA的营养液20ml，15d后停止注射，移栽成活率可达91％。

[0047] 实施例2

[0048] (1)选择成熟的暴马丁香的种子，采用洗衣粉清洗干净，然后再用清水冲洗2h；置于超净工作台上用体积百分含量为75％的乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次，放在无菌滤纸上风干，再用质量百分含量为0.1％升汞消毒8min，然后用无菌水冲洗3次，得消毒后种子；

[0049] (2)将消毒过的种子切开，把下胚轴接入MS培养基中培养，培养条件为：培养温度为20℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养10天，得发育后下胚轴；

[0050] (3)取6mm的下胚轴接种在以MS固体培养基为基本培养基，包含有5mg/LBA、0.5mg/LIBA的愈伤组织诱导培养基上，在温度为20℃，光照强度为2000lx，每天光照12h，培养40天，得愈伤组织；

[0051] (4)把生长致密、翠绿、疏松的愈伤组织接种到以1/2MS培养基为基本培养基，包含有0.1mg/L的2，4-D、3mg/L的BA和0.5mg/L的NAA的不定芽诱导培养基上，在温度为22℃，光照强度为2000lx，每天光照12h条件下诱导培养40d，得到愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗；

[0052] (5)再将组培苗转移到以1/6MS固体培养基和1/6WPM固体培养基为基本培养基的混合培养基中，在温度为22℃，光照强度为2000lx，每天光照12h，壮苗培养7d；

[0053] (6)在无菌，温度16℃，光照强度900lx，每天光照5h，室内湿度70％环境下，将幼苗移栽入河沙和草炭土体积比3:7的移栽培养基中，移栽炼苗7d，得炼苗后小苗，炼苗过程中，每天向距离小苗1cm的基质表面注射以1/3MS液体培养基和1/3WPM液体培养基为基本培养基，包含2mg/L的IBA和1mg/L的NAA的营养液15ml，13d后停止注射，移栽成活率可达93％。

[0054] 实施例3

[0055] (1)选择成熟的暴马丁香的种子，采用洗衣粉清洗干净，然后再用清水冲洗1.5h；置于超净工作台上用体积百分含量为75％的乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗5次，放在无菌滤纸上风干，再用质量百分含量为0.1％升汞消毒8min，然后用无菌水冲洗3次，得消毒后种子；

[0056] (2)将消毒过的种子切开，把下胚轴接入MS培养基中培养，培养条件为：培养温度为24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养10天，得发育后下胚轴；

[0057] (3)取7mm的下胚轴接种在以MS固体培养基为基本培养基，包含有5mg/LBA、0.5mg/LIBA的愈伤组织诱导培养基上，在温度为20℃，光照强度为2000lx，每天光照12h，培养60天，得愈伤组织；

[0058] (4)把生长致密、翠绿、疏松的愈伤组织接种到以1/2MS培养基为基本培养基，包含有0.1mg/L的2，4-D、3mg/L的BA和0.5mg/L的NAA的不定芽诱导培养基上，在温度为24℃，光照强度为2000lx，每天光照12h条件下诱导培养55d，得到愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗；

[0059] (5)再将组培苗转移到以1/6MS固体培养基和1/6WPM固体培养基为基本培养基的混合培养基中，在温度为20℃，光照强度为2000lx，每天光照12h，壮苗培养12d；

[0060] (6)在无菌，温度15℃，光照强度1000lx，每天光照8h，室内湿度80％环境下，将幼苗移栽入河沙和草炭土体积比2:5的移栽培养基中，移栽炼苗10d，得炼苗后小苗，炼苗过程中，每天向距离小苗1cm的基质表面注射以1/3MS液体培养基和1/3WPM液体培养基为基本培养基，包含2mg/L的IBA和1mg/L的NAA的营养液25ml，16d后停止注射，移栽成活率可达92.6％。

[0061] 对照例

[0062] 选择与实施例1～3相同的组培苗进行炼苗，把组培瓶的封口膜去掉，将小苗取出清洗干净根系；在避免阳光直射，温度16±2℃，湿度80％的环境中，移栽入草炭土基质中，15天以后，植株生长势较弱，叶子有些泛黄、打蔫，整体生长情况较弱，记录小苗的成活率为
45.6％。

[0063] 由以上实施例可知，利用本发明提供的愈伤组织诱导的暴马丁香组培苗的炼苗移栽方法，已在成活率显著高于对比例，移栽成活率平均达91％以上。

[0064] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。